基于网络药理学和分子对接探讨中药芫花治疗原发性痛经的作用机制.pdf

接收日期：2024-01-05 接受日期：2024-01-30 基金项目：江苏省妇幼健康研究会委托研究课题(JSFY202106)*通信作者。E-mail: 基于网络药理学和分子对接探讨中药芫花治疗基于网络药理学和分子对接探讨中药芫花治疗 原发性痛经的作用机制原发性痛经的作用机制 李思蒙，田 荣，殷明婧，谷 巍*(南京中医药大学，江苏 南京 210023)摘 要：通过网络药理学和分子对接技术预测芫花治疗原发性痛经的功效物质基础及其潜在的作用机制。基于 TCMSP数据库预测获得芫花的活性成分和作用靶点，同时借助 DisGeNET 等数据库获得与原发性痛经相关的靶点，基于获得的芫花与原发性痛经的交集靶点，使用 STRING 数据库构建交集靶点蛋白互作网络，并采用 Cytoscape3.7.2 构建芫花活性成分靶点原发性痛经网络。采用 DAVID 数据库进行基因本体论(GO)及京都基因与基因组百科全书(KEGG)通路富集分析，利用 Autodock tools 将核心靶点与对应的活性成分进行分子对接。结果表明，中药芫花治疗原发性痛经的核心活性成分为芫花素、柚皮素、7-羟基-6-甲氧基-3,7-双香豆素、龙胆山酮酚、羟基芫花素、山奈酚、木犀草素、谷甾醇、羟光刺苞菊内酯；关键靶点包括 ESR1、PTGS1、PTGS2、GSTM1、CYP1A1、OPRM1、NTRK2 和 NR1H2；涉及的生物学过程主要与老化、一氧化氮生物合成过程的正向调节、细胞质和 ATP 酶结合等有关；KEGG 通路主要富集在癌症的发病途径、化学致癌作用受体激活、化学致癌作用-DNA 加合物等。此外，分子对接显示核心活性成分芫花素与关键靶点蛋白之间的对接能量值均小于7.0 kcalmol1，具有强烈的结合活性，能形成稳定的结构构象。运用网络药理学和分子对接方法从“中药成分靶点疾病”的思路初步探究芫花治疗原发性痛经的活性物质基础，为深入研究该类成分治疗痛经的作用机制奠定基础。关键词：芫花；原发性痛经；网络药理学；分子对接；物质基础 Doi:10.3969/j.issn.1009-7791.2024.01.004 中图分类号：R966 文献标识码：A 文章编号：1009-7791(2024)01-0031-09 Mechanism of Traditional Chinese Medicine Genkwa Flos for Treatment of Primary Dysmenorrhea Based on Network Pharmacology and Molecular Docking LI Si-meng,TIAN Rong,YIN Ming-jing,GU Wei*(Nanjing University of Chinese Medicine,Nanjing 210023,Jiangsu China)Abstract:The effective material basis and potential mechanism of Genkwa Flos in treating primary dysmenorrhea by network pharmacology and molecular docking techniques were studied.Based on the TCMSP database,the active substances and targets of Genkwa Flos were predicted,and the targets related to primary dysmenorrhea were obtained with the help of DisGeNET and other databases.Based on the intersection targets of Genkwa Flos and primary dysmenorrhea,the intersection target protein interaction network was constructed using the STRING database,and the“Genkwa Flos-active substances-target-primary dysmenorrhea”network was constructed using Cytoscape3.7.2.Gene ontology(GO)and Kyoto encyclopedia of genes and genomes(KEGG)pathway enrichment 2024,53(1):3139.Subtropical Plant Science 第 53 卷 32analysis were performed using the DAVID database,and molecular docking of the core targets and corresponding active ingredients was performed using Autodock tools.Results showed that the core active substances of Genkwa Flos for treating primary dysmenorrhea are Genkwanin,(2R)-5,7-dihydroxy-2-(4-hydroxyphenyl)chroman-4-one,7-hydroxy-6-methoxy-3,7-dicoumarin,Gentiacaulein,Hydroxygenkwanin,kaempferol,luteolin,sitosterol,9-hydroxyglabratolide;key targets include ESR1,PTGS1,PTGS2,GSTM1,CYP1A1,OPRM1,NTRK2 and NR1H2;the associated biological processes are mainly related to aging,positive regulation of nitric oxide biosynthetic process,cytoplasm and ATPase binding;thepathway of KEGG are mainly enriched in the pathogenesis of cancer,chemical carcinogenesis-receptor activation,and chemical carcinogenesis-DNA adducts.In addition,molecular docking shows that the docking energy values between the core active ingredient Genkwanin and the key target proteins are all less than 7.0 kcalmol1,which have strong binding activity and can form stable structural conformations.This study used network pharmacology and molecular docking methods to preliminarily explore the active material basis of Genkwa Flos for treating primary dysmenorrhea from the perspective of“Chinese medicine-ingredient-target-disease”,laying a foundation for further studying the mechanism of action of this kind of ingredients for treating dysmenorrhea.Key words:Genkwa Flos;primary dysmenorrhea;network pharmacology;molecular docking;material basis 原发性痛经(Primary dysmenorrhea，PD)是指伴随月经周期出现下腹部疼痛，但没有任何生殖器官的器质性病变1，是妇科最常见的疼痛性疾病之一，不仅影响到女性的身心健康，也会影响到她们的日常生活和工作。在中医学理论中，原发性痛经属于“经行腹痛”等范畴，主要病机为“不通则痛”和“不荣则痛”2。出血不通不畅，以辛、苦、甘三味药治疗频率最高3。临床治疗基本从瘀着手，利用中药多成分、多层次、多靶点的药理学干预进行治疗。圣惠方中记载：芫花一两(醋拌炒令干)，当归一两(锉，微炒)，桂心一两，上药，捣罗为末，以软饭和丸，如梧桐子大，每服，食前以热酒下十丸，治妇人积年血气癥块结痛4。芫花始载于神农本草经，为瑞香科瑞香属植物芫花 Daphne genkwa Sieb.et Zucc 干燥的未开放花蕾，具有泻水逐饮，祛痰止咳的功效5。芫花辛、苦、温，可治疗子宫结块，月经不通等症状，且若久淤血癥出现水肿等病症，芫花泻水逐饮，可消水肿胀满，故可用于治疗妇人积年血气癥块所致的疼痛。现代药理研究表明，芫花具有抗病毒、抗肿瘤、抑菌、镇痛、抗生育等药理作用6。中药功效物质是临床疗效的物质基础，使得中药成为最具有原始创新特色的药物。但是，对于芫花治疗原发性痛经的具体成分与效应机制，还有待进一步研究。本文拟通过系统深入的网络药理学研究，结合分子对接技术预测芫花治疗原发性痛经的功效物质，初步讨论中药芫花治疗原发性痛经的作用机制，为深入研究其活性成分治疗痛经的作用机制奠定基础。1 材料与方法 1.1 中药有效活性成分筛选 运用 TCMSP 数据库检索“芫花”，设置筛选标准口服生物利用度(oral bioavailability，OB)30%，类药性(drug-likenesses，DL)0.187，筛选出芫花的活性成分。1.2 中药活性成分对应靶点基因获取 使用 Swiss Target Prediction 数据库(http:/www.swisstarget-prediction.ch/)进 行 靶 标 预 测。将 从PubChem(https:/pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)数据库中下载的化合物 2D 结构的 SDF 文件导入 Swiss Target Prediction 中，并选择 Organism 为 Homo Sapiens，得到活性成分对应的靶点。1.3 疾病靶点预测 在 DisGNET 数据库(https:/www.disgenet.org)以第 1 期 李思蒙等：基于网络药理学和分子对接探讨中药芫花治疗原发性痛经的作用机制 33及GeneCards数据库(https:/www.genecards.org)中搜索关键词“primary dysmenorrhea”，去重汇总后，得到原发性痛经的相关靶点。1.4 中药疾病共同靶点筛选 利用Venny 2.1.0将芫花活性成分靶点和原发性痛经相关靶点通过韦恩图进行一一映射，获得芫花和原发性痛经的共同靶点。1.5 中药成分靶点疾病网络构建 运用 Perl 软件处理芫花原发性痛经靶点，利用Cytoscape3.7.2 网络可视化软件，基于边数、节点、关联性设置颜色、大小等参数构建活性成分靶点原发性痛经网络图。1.6 中药疾病靶点蛋白质互作网络(PPI)构建 将芫花活性成分靶点和原发性痛经相关的靶点导入 STRING 数据库(https:/string-db.org/cgo/)构建PPI 图，设置最小互作分数值为 0.4，获得芫花原发性痛经蛋白互作网络。1.7 GO 功能富集分析和 KEGG 信号通路分析 将所提取的交集靶点导入 Metascape 数据库，对交集靶点进行GO 功能富集分析和KEGG 通路分析，并结合 Cityscape 构建“成分靶点通路疾病”的可 视化网络图，预测芫花治疗原发性痛经的作用靶点。1.8 分子对接 将分析得到的潜在有效成分与潜在靶点进行对接。从 PubChem 数据库(https:/pubchem.ncbi.nlm.nih.gov)下载活性成分的分子结构，通过蛋白质 PDB数据库(https:/www.rcsb.org/)数据库下载靶点的 pdb文件。通过 AutoDock Vina 软件(http:/vina.scripps.edu/)对化合物和蛋白质进行对接，使用 Pymol 对其进行可视化分析，2D 图采用 Discovery Studio 2020 Client 进行可视化分析。2 结果与分析 2.1 网络药理学分析 2.1.1 芫花活性成分及靶点芫花活性成分及靶点 芫花的有效活性成分初筛得到 14 个，有效成分对应的靶点 312 个(表 1)。2.1.2 疾病靶点筛选及芫花疾病靶点筛选及芫花原发性痛经共同靶点预测原发性痛经共同靶点预测 获得与原发性痛经相关靶点 39 个，芫花与原发性痛经共同靶点 8 个，包括 ESR1、PTGS1、PTGS2、GSTM1、CYP1A1、OPRM1、NTRK2 和 NR1H2，均为芫花治疗原发性痛经的潜在作用靶点(图 1)。表 1 芫花中所含化学成分的相关信息 Table 1 Information of the chemical components contained in Genkwa Flos 序号 MOL ID Molecule 名称 OB/%DL 1 MOL001040 柚皮素(2R)-5,7-dihydroxy-2-(4-hydroxyphenyl)chroman-4-one)42.36 0.21 2 MOL001506 角鲨烯(supraene)33.55 0.42 3 MOL000359 谷甾醇(sitosterol)36.91 0.75 4 MOL000422 山奈酚(kaempferol)41.88 0.24 5 MOL005530 羟基芫花素(hydroxygenkwanin)36.47 0.27 6 MOL005573 芫花素(genkwanin)37.13 0.24 7 MOL005574 羟光刺苞菊内酯(9-hydroxyglabratolide)104.66 0.32 8 MOL005575 龙胆山酮酚(gentiacaulein)72.82 0.27 9 MOL005578 7-羟基-6-甲氧基-3,7-双香豆素(7-hydroxy-6-methoxy-3,7-dicoumarin)50.81 0.51 10 MOL005580 芫花苷(yuenkanin)37.66 0.75 11 MOL005584 芫花酯甲(yuanhuacin)31.83 0.31 12 MOL005586 芫花酯乙(yuanhuadine)30.73 0.5 13 MOL000006 木犀草素(luteolin)36.16 0.25 14 MOL000098 槲皮素(quercetin)46.43 0.28 第 53 卷 34 图 1 芫花和原发性痛经的共同靶点交集图 Fig.1 Intersection diagram of common targets between Genkwa Flos and primary dysmenorrhea 2.1.3 活性成分活性成分靶点网络图靶点网络图 芫花中主要包括 13 种活性成分通过 8 个靶点治疗原发性痛经，有芫花酯甲、芫花素、羟基芫花素、柚皮素、谷甾醇、山奈酚、羟光刺苞菊内酯、龙胆山酮酚、木犀草素等。将芫花及其活性成分的ID号与相对应的原发性痛经靶点蛋白导入Cytoscape3.7.2 软件，构建“活性成分靶点”网络图。去除游离靶点后，结果如图 2 所示，共获得 8 个节点，36 条边。另外，Degree 值越高，药效成分越能代表药材的药效。芫花活性成分的拓扑学参数见表 2。芫花素(Degree=6)与芫花(Degree=13)图 2 芫花的活性成分靶点网络图 Fig.2 Active substances-target network diagram of Genkwa Flos 表 2 芫花活性成分的拓扑学参数 Table 2 Topological parameters of active substances of Genkwa Flos 序号 MOL ID 度值 介度中心性 紧密度中心性 1 MOL005573 6 111.96257076257 0.0285714285714285 2 MOL001040 3 16.8534798534798 0.0212765957446808 3 MOL005578 3 22.4545454545454 0.0232558139534883 4 MOL005575 3 9.96257076257076 0.024390243902439 5 MOL005530 3 9.96257076257076 0.024390243902439 6 MOL000422 3 9.96257076257076 0.024390243902439 7 MOL000006 3 9.96257076257076 0.024390243902439 8 MOL000359 3 36.8791208791209 0.0212765957446808 9 MOL005574 2 36.0000000000000 0.0196078431372549 第 1 期 李思蒙等：基于网络药理学和分子对接探讨中药芫花治疗原发性痛经的作用机制 35续表 2 序号 MOL ID 度值 介度中心性 紧密度中心性 10 MOL000098 1 0 0.0188679245283018 11 MOL005584 1 0 0.0188679245283018 12 MOL005586 0 0 0 13 MOL005580 0 0 0 的 Degree 值最接近，说明芫花素最能代表芫花治疗原发性痛经的作用8。2.1.4 PPI 蛋白互作蛋白互作 芫花治疗原发性痛经的潜在靶点 PPI 图由 7 个节点和 26 条边组成(图 3)，靶点连接的线越多，表明该靶点 Degree 值越高，是关键靶点，芫花治疗原发性痛经共同靶点的拓扑学参数见表 3。将 Degree值作为筛选条件，获得芫花治疗原发性痛经的关键靶点为前列腺素内过氧化物合酶 2(PTGS2)和雌激素受体(ESR1)，表明这两个靶点与芫花治疗原发性痛经有着更为直接的关系。2.1.5 GO 功能富集分析功能富集分析 利用 Metascape 数据库对所提取的交集靶点进行 GO 功能富集分析，将分析结果分为生物学过程、细胞组成、分子功能三类，其中生物学过程主要涉及一氧化氮生物合成过程的正向调节、对脂多糖的反应、对线虫的反应、环氧化酶途径、对炎症反应的调控、痛觉感知、前列腺素的生物合成过程等；细胞组成涉及神经元投影、内质网膜、细胞质等；分子功能涉及氧化还原酶活性、前列腺素过氧化物合酶活性等(图 4)。2.1.6 KEGG 通路富集分析通路富集分析 利用 Metascape 数据库对所提取的交集靶点进行 KEGG 通路富集分析，结果显示包括 8 条通路，共同靶点主要富集于羟色胺能突触、癌症的发病途径、细胞色素 P450 对异类物质的代谢、花生四烯酸的新陈代谢、化学致癌作用受体激活、化学致癌作用DNA 加合物等(图 5)。2.2 分子对接分析 选择排名第一的活性成分芫花素与 PTGS2、ESR1 核心靶点进行分子对接验证，对接结合能越低，二者结合力越强，对接情况见表 4。一般认为，对接能量值小于4.25 kcalmol1表示两者间有一定的结合活性，小于5.0 kcalmol1表示有较好的结合活性，小于7.0 kcalmol1表示有强烈的结合活性9，因此芫花素与 ESR1 与 PTGS2 有强烈结合活性。图 3 芫花原发性痛经蛋白互作图 Fig.3 Protein-protein interaction diagram of Genkwa Flos in the treatment of primary dysmenorrhea 表 3 芫花治疗原发性痛经共同靶点的拓扑学参数 Table 3 Topological parameters of common targets of Genkwa Flos in treating primary dysmenorrhea 序号 靶点 度值介度中心性 紧密度中心性 1 ESR1 8 79.2144522144522 0.02857142857142852 PTGS2 8 128.205128205128 0.02857142857142853 PTGS1 2 1.97435897435897 0.01818181818181814 GSTM11 0 0.01449275362318845 CYP1A1 1 0 0.01886792452830186 OPRM1 1 0 0.01886792452830187 NTRK21 0 0.01886792452830188 NR1H21 0 0.0153846153846153 第 53 卷 36 图 4 GO 富集分析图 Fig.4 The diagramof GO enrichment analysis 图 5 KEGG 通路富集分析 Fig.5 The analysis of KEGG pathway enrichment 第 1 期 李思蒙等：基于网络药理学和分子对接探讨中药芫花治疗原发性痛经的作用机制 37表 4 芫花活性成分与靶点蛋白分子对接结果 Table 4 The molecular docking results between active components of Genkwa Flos and target protein 受体蛋白 配体分子 对接能量值/kcalmol1 ESR1 Genkwanin 7.4 PTGS2 Genkwanin 9.1 如图 6 所示，基于分子对接 ESR1 和芫花素的结合模式，ESR1 与芫花素的靶点蛋白的 LEU462 和ALA430 形成 Alkyl 和 Pi-Alkyl 疏水相互作用，与LEU429 形成 Pi-Sigma 超共轭相互作用，与 ARG412形成氢键相互作用，与 ASP426 形成 Pi-Anion 相互作用。对接结果显示 ESR1 和芫花素的对接结合能为7.4 kcalmol1。如图 7 所示，基于分子对接 PTGS2 和芫花素的结合模式，PTGS2 与芫花素的靶点蛋白的 PRO153和 CYS36 形成 Alkyl 和 Pi-Alkyl 疏水相互作用，与CYS47 形成氢键相互作用。对接结果显示，PTGS2和芫花素的对接结合能为9.1 kcalmol1。图 6 芫花素与 ESR1 对接图 Fig.6 Docking diagram of Genkwanin and ESR1 图 7 芫花素与 PTGS2 的对接图 Fig.7 Docking diagram of Genkwanin and PTGS2 3 讨论 原发性痛经是常见的妇科病之一，痛经的发病原因较为复杂，作用机制尚不明确，认为可能与下丘脑垂体卵巢轴、前列腺素、血管加压素等有关。中草药成分复杂，药物治疗疾病会作用于多个靶点，根据文献记载，中药芫花泻水逐饮，可消水肿胀满，用于治疗妇女积年血气癥块所致的疼痛。网络药理学建立了一种多靶点与多疾病之间复杂网络关系的新模式，在研究疾病的发病机制及其治疗靶点方面具有参考价值，对于阐明药物疗效的分子机制及新药开发具有指导作用10。本研究通过 TCMSP 数据库共筛选出 9 个芫花的潜在活性成分：芫花素(MOL005573)、柚皮素(MOL001040)、7-羟基-6-甲氧基-3,7-双香豆素(MOL005578)、龙胆山酮酚(MOL005575)、羟基芫花素(MOL005530)、山奈酚(MOL000422)、木犀草素(MOL000006)、谷甾醇(MOL000359)、羟光刺苞菊内酯(MOL005574)。另一方面，从数据库中筛选出疾病靶点，发现 PTGS2和 ESR1 这两个靶点是整个网络的核心节点。前列 第 53 卷 38腺素(Prostaglandins，PGS)是生物活性氧化脂肪酸，PTGS 酶是前列腺素生物合成的关键酶，能将花生四烯酸转化为前列腺素，这是聚丙烯生物合成的限制速率步骤11。PTGS2 的表达水平会被细胞因子等诱导上调，催化花生四烯酸产生多种代谢产物，包括前列腺素1213。Haidari 等14发现前列腺素的升高是引起原发性痛经发作的主要原因，其通过增加子宫张力和收缩，造成女性在经期疼痛程度加重和持续时间延长。网络药理学分析显示，PTGS2 是芫花治疗原发性痛经的关键靶点，推测其是通过抑制花生四烯酸合成途径降低前列腺素的水平，从而达到治疗原发性痛经的作用。ESR1 可以调节转录因子 NF-B 间接参与炎症反应15，还可与雌激素结合，促进 PGF2 的合成，引起体内 PGF2 浓度升高，引发痛经16。KEGG 富集分析提示，芫花作用于原发性痛经的 8 条通路分别是羟色胺能突触、癌症的发病途径、细胞色素 P450 对异类物质的代谢、花生四烯酸新陈代谢、化学致癌作用受体激活、化学致癌作用DNA加合物。其中花生四烯酸途径通过产生前列腺素、白三烯等代谢产物调节细胞信号传导，调控炎症反应、疼痛、血管张力等生理过程，参与调节子宫肌细胞的收缩和舒张17。分子对接实验显示，芫花素与原发性痛经相关的 PTGS2 和 ESR1 靶点有强烈的结合活性，说明芫花素通过降低 PTGS2 表达水平，缓解子宫平滑肌的收缩；通过下调 ESR1 降低激素水平，缓解雌激素偏高导致的痛经。结合文献报道，芫花素能通过降低 PTGS2 和 COX-2 表达，同时降低子宫 PGF2 水平来缓解疼痛1819。以上研究表明，芫花可能通过调控 PTGS2 和ESR1 等靶标蛋白，介导花生四烯酸的新陈代谢、羟色胺能突触等通路降低前列腺素和雌激素水平。分子对接验证显示，靶点与芫花黄酮类成分芫花素对接强烈，推测其可能是芫花治疗原发性痛经的主要活性成分。这为芫花治疗原发性痛经的作用机制与物质基础研究拓宽了思路，但研究结果需进一步验证。参考文献 1 孙玉阳,纪宏宇,陈博,初明慧,王海荣,吴琳华.原发性痛经的发病机制及中医药治疗的研究进展J.中国药师,2017,20(1):144147.2 王艳英.原发性痛经发病机制及治疗的研究进展J.中华中医药杂志,2015,30(7):24472449.3 高兵,郭锦晨,孙晖晖,黄辉,程悦,冯烨.基于数据挖掘的王仲奇医案中月经不调处方用药规律分析J.甘肃中医药大学学报,2018,35(2):8489.4 王怀隐.太平圣惠方M.北京:人民卫生出版社,1958.5 石开玉.芫花的文献考证J.中药材,2016,39(11):26522656.6 刘金敏,卢金清,龚敏.芫花的研究进展J.湖北农业科学,2019,58(S2):12.7 宗明月,张庆然,王璐琼,辛敏,赵烽.基于网络药理学和分子对接法研究芫花抗炎作用机制J.烟台大学学报(自然科学与工程版),2021,34(2):178185.8 杨娟,豆佳红,孙悦龙,王小莹,周炜炜,张国滨,刘红欣,杨培龙,李秀梅.基于网络药理学与分子对接和实验验证探讨费菜抗炎作用的分子机制J.食品工业科技,2023,44(4):1221.9 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