淡豆豉的多菌种协同发酵工艺优化.pdf

基金项目:福建省科技厅引导性项目(.)作者简介:隋利强男硕士副教授研究方向:中药炮制工艺与炮制原理:.通信作者:徐伟男博士教授研究方向:中药药效物质基础及作用机制:.淡豆豉的多菌种协同发酵工艺优化隋利强王苏贵曹冬英谢思静王欣徐伟(福建中医药大学药学院福建 福州)摘要:目的 优化淡豆豉多菌种(环状芽孢杆菌、黑曲霉、少根根霉)协同发酵工艺为淡豆豉发酵工艺改进和创新提供参考 方法 以发酵时间、发酵温度、混合菌种比例、接种量为考察因素以总黄酮、大豆苷元、黄豆黄素、染料木素的含量为考察指标通过单因素考查对淡豆豉多菌种协同发酵工艺进行优化 结果 淡豆豉多菌种协同发酵最佳工艺条件为:发酵温度 发酵时间 接种量 混合菌种接种比例为环状芽孢杆菌 黑曲霉 少根根霉 结论 淡豆豉多菌种协同发酵工艺可避免杂菌干扰、利于工艺标准化可为淡豆豉工艺改进和创新以及为中药多菌种协同发酵工艺研究提供参考关键词:淡豆豉多菌种协同发酵工艺优化环状芽孢杆菌黑曲霉少根根霉中图分类号:文献标志码:文章编号:():./.():().:.:淡豆豉是以豆科植物黑大豆 (.).的成熟种子为原料发酵而成的药食两用中药具有解表除烦、宣发郁热等功效临床常用于治疗感冒、寒热头痛、烦躁胸闷以及虚烦不眠等病症 研究表明淡豆豉具有抗骨质疏松、清除自由基、解热、降血糖、抗菌、抗炎、抗肿瘤、抗辐射、抗抑郁、降低血压和抗动脉粥样硬化等作用现代研究认为中药发酵过程中微生物谢会产药学研究 .生多种酶使纤维素等构成的细胞壁发生裂解促进药效成分的释放、产生新的活性物质 另一方面药物中的大分子物质被微生物产生的酶催化酶解将人体不能直接吸收利用的大分子物质降解为小分子活性物质后者可通过血脑屏障易于机体对有效成分的吸收和利用更好地发挥药效 例如淡豆豉发酵过程在微生物作用下异黄酮苷、糖基皂苷等被分解成异黄酮苷元、低糖链皂苷等蛋白质被分解成多种氨基酸同时产生 氨基丁酸()等新的物质目前淡豆豉生产多为自然发酵空气、原料等环境中的多种微生物参与其中形成了特有的微生物体系 但是淡豆豉自然发酵过程也相对容易受杂菌污染 因此在合理利用传统发酵工艺微生物资源的同时优化发酵工艺通过纯种发酵或者多菌种协同发酵可以较好地保证豆豉的风味、功效以及产品质量的稳定性 与纯种发酵相比多菌种协同发酵更符合传统中药发酵模式具有发酵体系稳定不易引入杂菌等优势同时还可借助不同微生物的生长代谢丰富发酵产物 经查阅文献淡豆豉发酵工艺研究大多为纯种发酵工艺如异常威克汉姆酵母纯种发酵淡豆豉、纳豆芽孢杆菌纯种发酵淡豆豉以及伞枝梨头霉纯种发酵淡豆豉等 两种菌株组合发酵较少报道 例如王萍等以枯草芽孢杆菌、伞枝梨头霉以及米曲霉两两组合发酵淡豆豉 种及以上组合菌株协同发酵淡豆豉工艺未见报道前期试验本课题组通过内部转录间隔序列()基因高通量测序和 基因高通量测序的方法对闽产淡豆豉发酵过程的菌群分布情况进行了分析 结果提示黑曲霉、少根根霉和环状芽孢杆菌为淡豆豉发酵的优势菌种 因此在前期研究的基础上本课题组以黑曲霉、少根根霉和环状芽孢杆菌进行了多菌种协同发酵淡豆豉工艺研究为中药多菌种协同发酵工艺研究进行了探索也为淡豆豉工艺创新和改进提供了参考 仪器与试药.仪器 型隔水式恒温培养箱(上海一恒科学仪器有限公司)型洁净工作台(苏州安泰空气技术有限公司)型立式压力蒸汽灭菌器(福建省计量科学研究院)型震荡培养箱(上海知楚仪器有限公司)型紫外可见分光光度计(上海光谱仪器有限公司).试药 黑豆(市售)经福建中医药大学车苏容副教授鉴定为豆科植物黑大豆 (.).的 成 熟 种 子 环 状 芽 孢 杆 菌(批 号:)、黑曲霉(批号:)、少根根霉(批号:)均购自河南标准物质研发中心 培养基(批号:杭州滨和微生物试剂有限公司)培养基(批号:杭州百思生物技术有限公司)大豆苷(批号:)、黄豆黄苷(批号:)、染 料 木 苷(批 号:)、大豆苷元(批号:)、黄豆黄素(批号:)、染料木素(批号:)以上标准品均购于上海源叶生物科技有限公司纯度均 方法与结果淡豆豉发酵过程中大豆苷、黄豆黄苷、染料木苷会分别转化为大豆苷元、黄豆黄素以及染料木素其中大豆苷元、黄豆黄素、染料木素的含量变化与淡豆豉发酵程度呈正相关的关系 黄酮类成分为淡豆豉的药效成分发酵过程呈动态变化其含量变化与发酵程度有关 因此在预试验基础上我们以发酵时间、发酵温度、混合菌种比例、接种量为考察因素以总黄酮、大豆苷元、黄豆黄素、染料木素含量为综合评价指标筛选多菌种协同发酵淡豆豉的最佳工艺.培养基的制备马铃薯葡萄糖固体培养():马铃薯粉 葡萄糖 琼脂 加入 蒸馏水搅拌加热煮沸完全溶解经 高压灭菌 .菌种活化将冻干粉菌粉甩至底部取.溶解液加入至菌种管中轻轻弹至菌粉混合均匀用无菌吸头吸出溶解液全部接种至斜面上培养.单因素考察试验.种异黄酮含量测定.色谱条件色谱柱:(.)流动相:甲醇.甲酸梯度洗脱流速为 柱温 检测波长 样品和对照品 色谱图见图.对照品溶液的制备精密称取大豆苷.、黄豆黄苷.、染料木苷.、大豆苷元.、黄豆黄素.和染料木素.加入 药学研究 .混合对照品.黑豆.种菌株协同发酵淡豆豉.黑曲霉发酵淡豆豉.环状芽孢杆菌发酵淡豆豉.少根根霉发酵淡豆豉.大豆苷.黄豆黄苷.染料木苷.大豆苷元.黄豆黄素.染料木素图 色谱图甲醇溶解并定容至 制成混合对照品溶液.供试品溶液的制备 精密称取淡豆豉样品粉末 (过 号筛)置 三角瓶中精密加入 甲醇超声提取 放冷甲醇补足减失重量过滤取续滤液用.滤膜滤过即得供试品溶液.线性关系考察 精密量取混合对照品溶液适量用 甲醇稀释为不同梯度浓度的混合对照品溶液按照上述色谱条件测定 以大豆苷、黄豆黄苷、染料木苷、大豆苷元、黄豆黄素和染料木素含量()为横坐标峰面积()为纵坐标绘制标准曲线得到线性回归方程结果见表 表 淡豆豉 种异黄酮的线性关系成分回归方程线性范围/大豆苷.黄豆黄苷.染料木苷.大豆苷元.黄豆黄素.染料木素.含量测定精密称取淡豆豉样品粉末 (过 号筛)按上述方法制备样品进样根据回归方程计算样品中 种异黄酮的含量.总黄酮含量测定.对照品溶液的制备 精密称取染料木苷对照品.用甲醇溶解至 容量瓶定容至刻度.供试品溶液的制备 精密称取淡豆豉粉末.(过 号筛)置锥形瓶中精密甲醇 加热回流两次每次.放冷甲醇补足减失重量过滤取续滤液.置 容量瓶中用甲醇定容到刻度即得供试品溶液.线性关系考察 分别吸取对照品溶液.、.、.、.、.、置 容量瓶中用甲醇定容至刻度测定 处吸收以吸光度值()为纵坐标染料木苷浓度()为横坐标得到线性回归方程:.结果显示染料木苷在.浓度范围内线性关系良好.总黄酮含量测定精密称取淡豆豉粉末(过 号筛)按上述方法制备供试品溶液测定计算总黄酮含量.综合评分采用综合加权评分法进行综合评价总黄酮、大豆苷元、黄豆黄素、染料木素都是淡豆豉药效成分并且都能反应淡豆豉发酵程度因此将上述 个指标的权重各设置为 设综合评分为 总黄酮含量为 大豆苷元含量为 黄豆黄素含量为 染料木素含量为 可得评分公式:.(/).(/)././)其中 和 分别总黄酮含量及其最大值 和分别大豆苷元含量及其最大值 和 分别黄豆黄素含量及其最大值 和 分别染料木素含量及其最大值.发酵时间考察固定混合菌种的接种比例为 接种量 培养温度 发酵时间分别为、考察发酵时间对总黄酮和 种异黄酮含量的影响结果见表 和表 对各指标进行综合评分结果见图 由图 可以看出最佳发酵时间为 表 不同时间的总黄酮含量发酵天数/总黄酮含量().表 不同发酵时间 种异黄酮和总黄酮含量()发酵天数/大豆苷.黄豆黄苷.染料木苷.大豆苷元.黄豆黄素.染料木素.接种比例考察固定菌株接种量 培养温度 发酵时间 混合菌种(环状芽孢杆菌黑曲霉少根根霉)接种比例分别为 、考察接种比例对总黄酮和 种异黄酮含量的影响结果见表 和表 对各指标进行综合评分结果见图 由图 可以看出混合菌种的最佳接种比例为环状芽孢杆菌黑曲霉少根根霉药学研究 .图 淡豆豉不同发酵时间综合评分表 淡豆豉菌株不同接种比例总黄酮含量菌种比例(环状芽孢杆菌黑曲霉少根根霉)总黄酮含量().表 淡豆豉菌株不同接种比例 种异黄酮含量()名称环状芽孢杆菌黑曲霉少根根霉 环状芽孢杆菌黑曲霉少根根霉 环状芽孢杆菌黑曲霉少根根霉大豆苷.黄豆黄苷.染料木苷.大豆苷元.黄豆黄素.染料木素.图 淡豆豉菌株不同接种比例综合评分.发酵温度考察固定混合菌种的接种比例为环状芽孢杆菌黑曲霉少根根霉 接种量为 发酵时间 发酵温度分别为、考察发酵温度对总黄酮和 种异黄酮含量的影响结果见表 和表 对各指标进行综合评分结果见图 由图 可以看出最佳发酵温度为 表 淡豆豉不同发酵温度总黄酮含量温度/总黄酮含量().表 淡豆豉不同发酵温度 种异黄酮含量()温度/大豆苷.黄豆黄苷.染料木苷.大豆苷元.黄豆黄素.染料木素.图 淡豆豉不同发酵温度综合评分.接种量考察固定混合菌种的接种比例为环状芽孢杆菌黑曲霉少根根霉 培养温度 发酵时间 接种量分别为、考察接种量对总黄酮和 种异黄酮的影响结果见表 和表 对各指标进行综合评分结果见图 由图 可以看出组合菌种的最佳接种量为 表 淡豆豉菌株不同接种量总黄酮含量接种量()总黄酮含量().表 淡豆豉菌株不同接种量 种异黄酮含量()接种量()大豆苷.黄豆黄苷.染料木苷.大豆苷元.黄豆黄素.染料木素.图 组合菌种不同接种量发酵淡豆豉综合评分.淡豆豉发酵工艺优化结果本研究以少根根霉、黑曲霉、环状芽孢杆菌作为组合菌种协同发酵淡豆豉以发酵时间、混合菌种的接种比例、接种量和发酵温度为考察因素以总黄酮和大豆苷元、黄豆黄素、染料木素的含量为综合评价指标优化了淡豆豉多菌种协同发酵的最佳工艺件为:发酵温度 发酵时间 接种量 接种比例为环状芽孢杆菌黑曲霉少根根霉药学研究 .讨论与结论淡豆豉作为常用中药传统工艺多在自然条件下发酵发酵中的温度和湿度、有效菌种等皆具有不可控性多依靠生产经验并且生产周期很长产品的质量不稳定 目前对淡豆豉工艺改进和优化研究主要集中在两个方向:对传统发酵工艺的参数的优化研究如对发酵温度、湿度、发酵时间等进行优化该类研究可以提高淡豆豉生产的规范化提升淡豆豉质量的稳定性在菌种研究的基础上进行纯种发酵按发酵菌种不同可分为细菌型、根霉型、曲霉型和毛霉型淡豆豉该类研究是在淡豆豉传统工艺基础上的创新除了可以提升生产工艺和质量的稳定外还可以一定程度上实现定向发酵实现目标药效物质的定向转化 本研究在纯种发酵的基础上结合课题组前期的菌种研究采用多菌种协同发酵包括细菌型、根霉型、曲霉型 类菌种共同发酵淡豆豉除了可以提升淡豆豉发酵工艺和产品质量的稳定性外还可以丰富淡豆豉发酵过程的物质转化具有单一菌种发酵不具备的优势淡豆豉多菌种协同发酵工艺考察指标为总黄酮和大豆苷元、黄豆黄素、染料木素的含量在含量测定时除了总黄酮外测定了大豆苷、黄豆黄苷、染料木苷、大豆苷元、黄豆黄素、染料木素 种成分的含量主要有两个目的:大豆苷元、黄豆黄素、染料木素的含量可用于多菌种协同发酵淡豆豉的工艺评价通过大豆苷、黄豆黄苷、染料木苷 种异黄酮苷和大豆苷元、黄豆黄素、染料木素 种异黄酮苷元的含量变化和 谱图的变化可以更直观地了解环状芽孢杆菌、黑曲霉和少根根霉 个菌株纯种发酵和混合发酵对药效成分转化程度的影响试验过程中我们分别以环状芽孢杆菌、黑曲霉和少根根霉 个菌株纯种发酵淡豆豉 图谱见图 从图 中可以看出上述 个菌株纯种发酵淡豆豉都可将大豆苷、黄豆黄苷、染料木苷异黄酮苷转化为大豆苷元、黄豆黄素、染料木素间接验证了前期筛选的淡豆豉发酵优势菌种是淡豆豉发酵过程的重要菌种对淡豆豉发酵过程的成分转化起重要作用 对图 中几种发酵方法制备的淡豆豉样品进行比较结果显示不同发酵方式对上述 种异黄酮苷(对应图 中的色谱峰)的转化程度有明显差异按转化程度排序:种菌株组合发酵黑曲霉纯种发酵淡豆豉少根根霉纯种发酵淡豆豉环状芽孢杆菌纯种发酵淡豆豉 该结果提示多菌种协同发酵淡豆豉对上述 种异黄酮苷的转化效果优于单菌种纯种发酵淡豆豉从一定程度上体现了多菌种协同发酵淡豆豉的优势 此外该结果也提示 种发酵菌株中黑曲霉对淡豆豉发酵起重要作用这与我们所优选的多菌种协同发酵的接种比例结果是一致的中药传统发酵方式多为自然发酵微生物体系相对复杂 单一菌株发酵的优点是稳定可控可以提高中药质量的稳定性促进发酵中药的现代化生产但与传统发酵工艺差别较大 多菌种协同发酵中药除了具有发酵体系稳定不易引入杂菌的优势外还可借助不同微生物的代谢丰富发酵产物的类型兼顾到众多微生物协同生长的实际与传统中药发酵工艺的菌株组成更为接近更能体现多菌种协同发酵的整体优势和多成分的转化组合也更符合中医药的整体观少根根霉、黑曲霉和环状芽孢杆菌多菌种协同发酵淡豆豉过程中我们观察到发酵第 天时少根根霉生长较为旺盛发酵至第 天时黑曲霉生长较为旺盛发酵至第 天时环状芽孢杆菌生长较为旺盛故推测少根根霉可能为多菌种协同发酵淡豆豉的启动菌之后黑曲霉在发酵过程占主导作用后期随着糖类成分的转化环状芽孢杆菌参与到发酵过程整个过程 个菌株可以使淡豆豉发酵持续进行有利于缩短发酵周期加块药效成分的转化和积累的进程在多菌种协同发酵工艺综合评价过程中因为评价指标的选择和评价方法不同我们初期筛选的最佳工艺为:发酵温度 发酵时间 接种量混合菌种的接种比例为环状芽孢杆菌 黑曲霉 少根根霉 并以该工艺生产了 批淡豆豉各测定指标见表 和表 经验证上述发酵工艺稳定、可行 因该部分工艺数据并非最优发酵工艺数据故未在正文中呈现 但是该部分数据可以验证环状芽孢杆菌、黑曲霉和少根根霉多菌种协同发酵工艺稳定性和可行性 后期将在本试验所筛选的多菌种协同发酵淡豆豉的工艺基础上结合实际生产做进一步的优化和调整为淡豆豉工业化生产提供参考本研究优化的少根根霉、黑曲霉、环状芽孢杆菌多菌种协同发酵淡豆豉工艺具有生产周期短、发酵参数稳定、可控的优点有利于提升淡豆豉发酵生产的规范化和质量的稳定性 此外借助不同微生物的代谢可丰富发酵产物加快药效物质转化和积累药学研究 .表 多菌种协同发酵 批淡豆豉 种异黄酮含量()批次大豆苷 黄豆黄苷 染料木苷 大豆苷元 黄豆黄素染料木素.平均值.().表 多菌种协同发酵 批淡豆豉总黄酮含量批次平均值()总黄酮含量().可为淡豆豉工艺改进和创新以及为中药多菌种协同发酵工艺研究提供参考参考文献:国家药典委员会.中华人民共和国药典 年版(一部).北京:中国医药科技出版社:.董淑翔.淡豆豉的药理作用及临床运用研究进展概述.中医临床研究():.():.():.董凡李浩然王少平等.中药发酵的现代研究进展与展望.中华中医药杂志():.殷红冉淦侨韩姗姗等.微生物多级发酵对八珍汤中有效成分的影响.时珍国医国药():.林王敏翁倩倩邓爱平等.基于文献的淡豆豉发酵过程成分转化分析.中国中药杂志():.林王敏翁倩倩邓爱平等.淡豆豉的发酵工艺沿革及过程控制概述.中国实验方剂学杂志():.朱海针谢卫华龙凯等.技术研究淡豆豉炮制过程中微生物菌群的动态变化.中草药():.徐菁雯王伟明史海粟等.豆豉和淡豆豉微生物组与功能成分研究进展.中国酿造():.屈青松李智勋周晴等.发酵中药的研究进展及其“发酵配伍”理论探索.中草药():.李尚逊姬翔翟兴媛等.异常威克汉姆酵母纯种发酵淡豆豉的炮制工艺研究.大豆科学():.冯薇孙佳明董秋菊等.纳豆芽孢杆菌发酵淡豆豉促成骨细胞增殖的谱效关系分析.中国药学杂志():.宓月光王伟明孙银玲等.淡豆豉和豆豉纯种发酵过程中游离氨基酸的含量变化.食品与发酵工业():.王萍陈丽艳孙银玲等.单、双菌发酵淡豆豉不同发酵期纤溶酶活性.中国微生态学杂志():.刘锋隋利强吴仲等.基于 基因测序的闽产淡豆豉发酵过程优势菌种研究.贵州中医药大学学报():.曹冬英谢思静曾思婷等.基于高效液相色谱法对淡豆豉发酵过程中 种异黄酮含量的动态分析.中南药学():.刘锋曹冬英徐伟等.淡豆豉发酵过程总黄酮和多糖含量动态分析.中医药导报():.李鸷曹冬英许文等.基于发酵过程的淡豆豉 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