生物化学实验电泳市公开课一等奖百校联赛特等奖课件.pptx

生物化学试验生物化学试验Biochemical Experiment第1页人员组成人员组成n主讲教师：吕晓玲（教授）主讲教师：吕晓玲（教授）刘常金（副教授博士）刘常金（副教授博士）曹东旭（副教授博士）曹东旭（副教授博士）王德培（副教授博士）王德培（副教授博士）白小佳（讲白小佳（讲 师博士）师博士）李昌模（副教授博士）李昌模（副教授博士）张张 燕（副教授博士）燕（副教授博士）方国臻（副教授博士）方国臻（副教授博士）n试验辅助：高试验辅助：高 辉（试验师）辉（试验师）姚秀玲（试验师）姚秀玲（试验师）第2页试验内容安排试验内容安排共共3636课时课时1 1、生物化学试验规则及惯用仪器使用入门（、生物化学试验规则及惯用仪器使用入门（2 2课时）课时）2 2、离子交换柱层析法分离氨基酸（、离子交换柱层析法分离氨基酸（5 5课时）课时）3 3、3 3，5 5二硝基水杨酸法测定还原糖（二硝基水杨酸法测定还原糖（5 5课时）课时）4 4、多酚氧化酶制备、性质及其影响原因（、多酚氧化酶制备、性质及其影响原因（6 6课时）课时）5 5、碱性蛋白酶活力测定福林酚试剂法（、碱性蛋白酶活力测定福林酚试剂法（4 4课时）课时）6 6、SDSSDSPAGEPAGE分离蛋白质（分离蛋白质（6 6课时）课时）7 7、植物中核酸分离与判定、植物中核酸分离与判定(5(5课时课时)8 8、BradfordBradford法测定蛋白质含量（法测定蛋白质含量（3 3课时）课时）第3页1试验目标试验目标l掌握蛋白质、酶、核酸、糖等主要物质分离、掌握蛋白质、酶、核酸、糖等主要物质分离、纯化和测定技术原理及方法；纯化和测定技术原理及方法；l掌握生物化学基本知识、基本理论及基本试验掌握生物化学基本知识、基本理论及基本试验技能技能；l培养分析和处理问题能力以及严谨细致科学作培养分析和处理问题能力以及严谨细致科学作风、创新能力等综合素质。风、创新能力等综合素质。绪论绪论第4页2 经过生物化学试验应该做到经过生物化学试验应该做到l学习设计一个试验基本思绪，掌握各个试验基学习设计一个试验基本思绪，掌握各个试验基本原理，学会严密地组织自己试验，合理地安本原理，学会严密地组织自己试验，合理地安排试验步骤和时间。排试验步骤和时间。l训练试验动手能力，学会熟练地使用各种生物训练试验动手能力，学会熟练地使用各种生物化学试验仪器。化学试验仪器。l学会准确翔实地统计试验现象和数据技能，提学会准确翔实地统计试验现象和数据技能，提升试验汇报写作能力，能够整齐清洁地进行全升试验汇报写作能力，能够整齐清洁地进行全部试验。部试验。l掌握生物化学各种基本试验方法和试验技术，掌握生物化学各种基本试验方法和试验技术，尤其是各种电泳技术和层析枝术，为今后参加尤其是各种电泳技术和层析枝术，为今后参加科研工作打下坚实基础。科研工作打下坚实基础。第5页3.1 3.1 试验统计试验统计l试验前写好试验预习汇报试验前写好试验预习汇报(钢笔和园珠笔钢笔和园珠笔)。l试验中应及时准确地统计试验中应及时准确地统计(专用纸，事先在统计纸上专用纸，事先在统计纸上设计好各种统计格式和表格）所观察到现象和测量数设计好各种统计格式和表格）所观察到现象和测量数据。据。l试验统计要注意有效数字，如吸光度值应为试验统计要注意有效数字，如吸光度值应为“0.050”“0.050”，而不能记成，而不能记成“0.05”“0.05”。每个结果都要尽。每个结果都要尽可能重复观察二次以上，即使观察数据相同或偏差很可能重复观察二次以上，即使观察数据相同或偏差很大，也都应如实统计，不得涂改。大，也都应如实统计，不得涂改。l试验中要详细统计试验条件，如使用仪器型号、编试验中要详细统计试验条件，如使用仪器型号、编号、生产厂等；生物材料起源、试剂规格、试剂浓度号、生产厂等；生物材料起源、试剂规格、试剂浓度等。等。3 3 试验统计与试验汇报试验统计与试验汇报第6页3 3 试验统计与试验汇报试验统计与试验汇报3.2 3.2 试验汇报试验汇报试验汇报格式应为：试验汇报格式应为：试验目标；试验目标；试验原理；试验原理；仪器、材料和试剂；仪器、材料和试剂；试验步骤；试验步骤；结果讨论（含数理据处）；结果讨论（含数理据处）；注意事项注意事项;(7)(7)思索题思索题 注意：试验结果讨论要充分，尽可能多查阅一些相关注意：试验结果讨论要充分，尽可能多查阅一些相关文件和教科书，充分利用己学过知识和生物化学原理，文件和教科书，充分利用己学过知识和生物化学原理，进行深入探讨，勇于提出自己独到分析和看法，并欢进行深入探讨，勇于提出自己独到分析和看法，并欢迎对试验提出改进意见。迎对试验提出改进意见。第7页4 试验成绩评分方法试验成绩评分方法n试验预习情况（试验预习情况（10%10%）n试验操作情况（试验操作情况（20%20%）n试验汇报情况（试验汇报情况（30%30%）n试验考试成绩（试验考试成绩（40%40%）第8页生物化学试验技术理论生物化学试验技术理论层析技术第9页l19，俄国科学家M.C.Jber首创了一个从绿叶中分离各种不一样颜色色素成份方法，命名为色谱法(Chromatography)，因为翻译和习惯原因又常称为层析法。l80多年来，层析法不停发展，形式各种多样。50年代开始，相继出现了分配层析、离于交换层析、凝胶层析、亲和层析、吸附层析等。l几乎每一个层析法都已发展成为一门独立生化高技术，在生化领域内得到了广泛应用。一、层析技术一、层析技术第10页一、层析技术一、层析技术l1、层析技术原理l2、层析技术分类l3、惯用层析技术原理第11页1、层析技术原理、层析技术原理l层析原理：是一个物理分离方法，利用混合物中各组分物理化学性质差异，使各组分以不一样程度分布在两相中，其中一相为固定相，另一相流过此相当作流动相，并使各组分以不一样速度移动，从而到达分离目标。l可分离物质：糖类、有机酸、氨基酸、核苷酸。第12页2、层析技术分类、层析技术分类名称名称操作方式操作方式固定相固定相流动相流动相分离依据分离依据分配层析分配层析纸层析纸层析薄层层析薄层层析液体液体液体液体溶解度溶解度离子交换层析离子交换层析离子交换柱层析离子交换柱层析固体固体液体液体带电性带电性静电引力静电引力吸附层析吸附层析吸附薄层层析吸附薄层层析气体吸附层析气体吸附层析固体固体固体固体液体液体气体气体吸附力吸附力亲合层析亲合层析酶与底物酶与底物抗原与抗体抗原与抗体固体固体液体液体配体专一性配体专一性凝胶层析凝胶层析 凝胶过滤凝胶过滤固体固体液体液体分子大小分子大小第13页3、惯用层析原理、惯用层析原理l（1）分配层析纸层析l原理：溶质在互不相溶两相中溶解度不一样，在终点时到达一个平衡，其比值为一个常数，即分配系数（）。l 固定相内溶质浓度 流动相内溶质浓度 固定相：滤纸上吸附水 流动相：有机溶剂（正丁醇）=第14页128646432643216484816 8324832 8 4204040 20 4 2123040 30 12 2第15页纸层析纸层析l纸层析是最简单液一液相分配层析。l滤纸是纸层析支持物。当支持物被水饱和时，大部分水分子被滤纸纤维素牢牢吸附，所以，纸及其饱和水为层析固定相，与固定相不相混溶有机溶剂为层析流动相。l对一些特定化合物，在特定展层系统，一定温度条件下，Rf是个常数。第16页（2）离子交换层析）离子交换层析l原理：将能与周围介质进行离子交换不稳定离子固定于惰性基质上，从而分离介质中组分。l惯用惰性基质：人工合成树脂（单体：苯乙烯、交联剂：二乙烯苯）l阳离子交换剂：磺酸甲基、羧甲基、磷酸基l阴离子交换剂：二乙基胺乙基、三乙基胺乙基 l可交换离子：阳离子：Na+、H+阴离子：Cl-、OH-第17页示意图（交换树脂表面）示意图（交换树脂表面）第18页示意图（离子交换过程）示意图（离子交换过程）电离基团（磺酸根）可交换离子（钠离子）交换离子不交换离子第19页示意图示意图水分子B物质A物质第20页（3）吸附层析）吸附层析l原理：当气体或液体中某组分分子在运动中碰到一个固体表面时，原理：当气体或液体中某组分分子在运动中碰到一个固体表面时，分子会贴在固体表面上并停留一定时间然后才离开，此为吸附现分子会贴在固体表面上并停留一定时间然后才离开，此为吸附现象。象。l吸附现象形成原因：吸附现象形成原因：吸附作用可能由几个作用力形成，包含被吸吸附作用可能由几个作用力形成，包含被吸附物与吸附剂之间相反电荷基团与基团之间静电引力附物与吸附剂之间相反电荷基团与基团之间静电引力(形成离子键形成离子键)、氢键及范德华引力等。、氢键及范德华引力等。l在不一样条件在不一样条件 下，占主要地位作用力可能不一样，也可能几个力下，占主要地位作用力可能不一样，也可能几个力同时起作用同时起作用l吸附剂：氧化铝、活性炭、硅胶；纤维素、淀粉、聚酰胺；滑石、吸附剂：氧化铝、活性炭、硅胶；纤维素、淀粉、聚酰胺；滑石、陶土、粘土。陶土、粘土。第21页吸附层析示意图吸附层析示意图 吸附剂易吸附分子不易吸附分子第22页（4）亲和层析）亲和层析l原理：利用分子间含有专一亲和力而设计层析技利用分子间含有专一亲和力而设计层析技术。术。l专一亲和力分子对：酶与底物、特异性抗原与酶与底物、特异性抗原与抗体、抗体、DNA和和RNA、激素和其受体、激素和其受体l载体：使亲和物固相化水不溶性化合物。如：纤使亲和物固相化水不溶性化合物。如：纤维素、聚丙烯酰胺凝胶、琼脂糖凝胶、聚苯乙烯、维素、聚丙烯酰胺凝胶、琼脂糖凝胶、聚苯乙烯、乙烯、多孔玻璃。乙烯、多孔玻璃。第23页第24页（5）凝胶过滤凝胶过滤l原理：被分离物质因分子大小不一样，在凝胶中向下移动被分离物质因分子大小不一样，在凝胶中向下移动速度不一样。速度不一样。l物质进入凝胶柱之后有两种运动方式：垂直向下移动和无定向物质进入凝胶柱之后有两种运动方式：垂直向下移动和无定向扩散运动。大分子物质直径大无法进入凝胶颗粒内，只能分布扩散运动。大分子物质直径大无法进入凝胶颗粒内，只能分布于颗粒间隙中向下移动快，而小分子物质可扩散到凝胶颗粒内，于颗粒间隙中向下移动快，而小分子物质可扩散到凝胶颗粒内，所以向下移动慢。所以向下移动慢。l凝胶物质：马铃薯淀粉凝胶、琼脂、琼脂糖凝胶、聚丙烯酰马铃薯淀粉凝胶、琼脂、琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶、葡聚糖凝胶。胺凝胶、葡聚糖凝胶。第25页第26页电 泳 技 术一一.电泳概念电泳概念二二.电泳技术分类电泳技术分类三三.电泳技术基本原理电泳技术基本原理四四.几个常见电泳方法比较几个常见电泳方法比较五五.聚丙烯酰胺凝胶盘状电泳原理聚丙烯酰胺凝胶盘状电泳原理第27页一.电泳概念l带电质点在电场中移动现象带电质点在电场中移动现象。第28页二.电泳技术分类第29页三.电泳技术基本原理1.基本原理基本原理 不一样带电颗粒在同一电场中泳动速度，主要与其所不一样带电颗粒在同一电场中泳动速度，主要与其所带净电荷量，分子量及分子形状相关。带净电荷量，分子量及分子形状相关。pH pI 分子带负电荷分子带负电荷,在电场中向正极移动在电场中向正极移动;pH 蛋蛋 GlyGlylm mcl cl cl clmm蛋蛋 蛋蛋m m GlyGly GlyGlyl凝胶中凝胶中ClCl为快离子，为快离子，Gly Gly为慢离子，为慢离子，蛋白质样品被夹在中间。蛋白质样品被夹在中间。缓冲缓冲液液样品样品浓缩胶浓缩胶分离胶分离胶第39页缓冲液成份及pH不连续性造成蛋白质样品浓缩效应示意图l快离子l慢离子l蛋白质样品 第40页lE：每厘米电压降每厘米电压降 E EI(I(电流强度电流强度)/)/(电导率电导率)lE E与电泳速度成正比与电泳速度成正比l电泳开始后，因为快离子泳动电泳开始后，因为快离子泳动率最大，在快离子后面形成一率最大，在快离子后面形成一个离子浓度低低电导区，产生个离子浓度低低电导区，产生较高电位梯度，使蛋白质和慢较高电位梯度，使蛋白质和慢离子加速移动，蛋白质样品被离子加速移动，蛋白质样品被深入浓缩。深入浓缩。电位梯度不连续性第41页lE：每厘米电压降每厘米电压降 E EI(I(电流强度电流强度)/)/(电导率电导率)lE E与电泳速度成正比与电泳速度成正比l电泳开始后，因为快离子泳动电泳开始后，因为快离子泳动率最大，在快离子后面形成一率最大，在快离子后面形成一个离子浓度低低电导区，产生个离子浓度低低电导区，产生较高电位梯度，使蛋白质和慢较高电位梯度，使蛋白质和慢离子加速移动，蛋白质样品被离子加速移动，蛋白质样品被深入浓缩。深入浓缩。电位梯度不连续性第42页A.样品浓缩效应四个不连续性造成样品浓缩效应原四个不连续性造成样品浓缩效应原理包含理包含：l缓冲液成份及缓冲液成份及pHpH不连续性不连续性l电位梯度不连续性电位梯度不连续性 缓冲液缓冲液浓缩胶浓缩胶样品样品分离胶分离胶第43页A.样品浓缩效应四个不连续性造成样品浓缩效应原四个不连续性造成样品浓缩效应原理包含理包含：l凝胶层不连续性：凝胶层不连续性：样品进入浓缩胶有一个堆积浓缩样品进入浓缩胶有一个堆积浓缩效应效应(缓冲液缓冲液pH8.3)pH8.3)蛋白质从蛋白质从“”极向极向“”极移极移动，从浓缩胶进入分离胶，速动，从浓缩胶进入分离胶，速度变慢，堆积浓缩。度变慢，堆积浓缩。缓冲缓冲液液样品样品浓缩胶浓缩胶分离胶分离胶第44页A.样品浓缩效应四个不连续性造成样品浓缩效应原四个不连续性造成样品浓缩效应原理包含理包含：l凝胶层不连续性：凝胶层不连续性：样品进入浓缩胶有一个堆积浓缩样品进入浓缩胶有一个堆积浓缩效应效应(缓冲液缓冲液pH8.3)pH8.3)蛋白质从蛋白质从“”极向极向“”极移极移动，从浓缩胶进入分离胶，速动，从浓缩胶进入分离胶，速度变慢，堆积浓缩。度变慢，堆积浓缩。缓冲缓冲液液样品样品浓缩胶浓缩胶分离胶分离胶第45页A.样品浓缩效应四个不连续性造成样品浓缩效应原四个不连续性造成样品浓缩效应原理包含理包含：l凝胶层不连续性：凝胶层不连续性：样品进入浓缩胶有一个堆积浓缩样品进入浓缩胶有一个堆积浓缩效应效应(缓冲液缓冲液pH8.3)pH8.3)蛋白质从蛋白质从“”极向极向“”极移极移动，从浓缩胶进入分离胶，速动，从浓缩胶进入分离胶，速度变慢，堆积浓缩。度变慢，堆积浓缩。缓冲缓冲液液浓缩胶浓缩胶分离胶分离胶第46页A.样品浓缩效应四个不连续性造成样品浓缩效应原四个不连续性造成样品浓缩效应原理包含理包含：l凝胶层不连续性：凝胶层不连续性：样品进入浓缩胶有一个堆积浓缩样品进入浓缩胶有一个堆积浓缩效应效应(缓冲液缓冲液pH8.3)pH8.3)蛋白质从蛋白质从“”极向极向“”极移极移动，从浓缩胶进入分离胶，速动，从浓缩胶进入分离胶，速度变慢，堆积浓缩。度变慢，堆积浓缩。缓冲缓冲液液浓缩胶浓缩胶分离胶分离胶第47页B.电荷效应l蛋白质样品进入分离胶后蛋白质样品进入分离胶后 pHpH增大增大(pH 8.9)(pH 8.9)，GlyGly解离度增解离度增大，不存在快、慢离子之分，大，不存在快、慢离子之分，蛋白质样品在均一电场强度和蛋白质样品在均一电场强度和pHpH条件下泳动。条件下泳动。l因为各种蛋白质因为各种蛋白质pI不一样，所载不一样，所载有效电荷不一样，所以质点有效电荷不一样，所以质点 有有效迁移率不一样，形成不一样效迁移率不一样，形成不一样区带。区带。缓冲缓冲液液浓缩胶浓缩胶分离胶分离胶第48页C.分子筛效应l分离胶孔径小，各分子因分离胶孔径小，各分子因为大小和形状不一样，所为大小和形状不一样，所受阻力不一样，表现出不受阻力不一样，表现出不一样一样 泳动速度，即分子筛泳动速度，即分子筛作用。分子量小，形状为作用。分子量小，形状为球形泳动速度最快。球形泳动速度最快。缓冲缓冲液液浓缩胶浓缩胶分离胶分离胶第49页试验一试验一 离子交换层析法分离氨基酸离子交换层析法分离氨基酸一、试验目标一、试验目标 学习用阳离子交换树脂分离氨基酸学习用阳离子交换树脂分离氨基酸 操作方法和基本原理操作方法和基本原理二、原理二、原理氨基酸氨基酸PIPI不一样，在同一不一样，在同一pHpH下所带电荷数量和性下所带电荷数量和性质不一样，与树脂亲和力就有差异，所以可依质不一样，与树脂亲和力就有差异，所以可依据亲和力从小到大次序依次被洗脱下来。据亲和力从小到大次序依次被洗脱下来。l阳离子交换树脂：可供交换是阳离子；阳离子交换树脂：可供交换是阳离子；l阴离子交换树脂：可供交换是阴离子；阴离子交换树脂：可供交换是阴离子；第50页离子交换层析法分离氨基酸离子交换层析法分离氨基酸三、操作步骤三、操作步骤1 1、装柱、装柱装柱是装柱是最关键最关键一步。一步。重力沉降法装柱重力沉降法装柱陆续不停地添加糊状物，使其形成胶粒床面上陆续不停地添加糊状物，使其形成胶粒床面上有胶粒连续有胶粒连续均匀地沉降均匀地沉降，直至装柱物完全沉降，直至装柱物完全沉降至适当柱床体积为止。至适当柱床体积为止。柱表面一直要保持着一层溶剂柱表面一直要保持着一层溶剂(普通普通l l3cm3cm柱高柱高)柱任何一部分绝对柱任何一部分绝对不能不能“流干流干”。第51页1 1、装柱、装柱l层析柱形状，普通直径层析柱形状，普通直径 与高度比为与高度比为l l：1515为宜。为宜。l柱形必须依据层析介质和柱形必须依据层析介质和 分离目标而定。待分离物分离目标而定。待分离物 质性质相近，柱越质性质相近，柱越细长细长，则分离效果越好，但流速则分离效果越好，但流速 较慢。在样品组分并不复较慢。在样品组分并不复 杂情况下，采取杂情况下，采取“矮胖矮胖柱柱”。第52页2 2、平衡、平衡 l层析柱正式使用前，必须平衡至所需层析柱正式使用前，必须平衡至所需pHpH和离子强度，普和离子强度，普通用起始缓冲液在恒定压力下走柱，其洗脱体积相当于通用起始缓冲液在恒定压力下走柱，其洗脱体积相当于4-64-6倍倍床体积，使交换剂充分平衡，柱床稳定。装好柱床体积，使交换剂充分平衡，柱床稳定。装好柱必须必须均匀，无纹路，不含气泡均匀，无纹路，不含气泡，柱顶交换剂沉积表面十，柱顶交换剂沉积表面十分平坦。分平坦。l本试验平衡体积：本试验平衡体积：606080mL80mLl调整流速：调整流速：0.5mL/min0.5mL/min或或8-128-12滴滴/min/min第53页3 3、加样、加样 l上样量：上样量：0.3-0.5mL0.3-0.5mLl0.5mL0.5mL缓冲液冲洗加样处缓冲液冲洗加样处2 2次次注意：注意：加样同时开始搜集加样同时开始搜集加样时且勿搅动树脂床面加样时且勿搅动树脂床面第54页4 4、洗脱与搜集、洗脱与搜集 l尽可能维持衡定柱压尽可能维持衡定柱压l每每2 2分钟搜集一管，共搜集分钟搜集一管，共搜集2525管管5 5、氨基酸判定、氨基酸判定 每个搜集管每个搜集管 1mL1mL水合茚三酮水合茚三酮沸水浴沸水浴15min15min比色测定比色测定绘制洗脱曲线绘制洗脱曲线第55页试验二试验二 SDS-PAGE分离蛋白质分离蛋白质一、试验目标一、试验目标 掌握掌握SDS-PAGESDS-PAGE工作原理和操作方法工作原理和操作方法二、原理二、原理不一样蛋白质含有不一样分子量，并在一定不一样蛋白质含有不一样分子量，并在一定pHpH溶溶液中带有不一样电荷。但经过液中带有不一样电荷。但经过SDSSDS处理后蛋白质，处理后蛋白质，分子表面完全被负电荷所覆盖，所以在电泳时，分子表面完全被负电荷所覆盖，所以在电泳时，电泳迁移率近取决于蛋白质分子量大小而与其电泳迁移率近取决于蛋白质分子量大小而与其所带电荷性质无关。所带电荷性质无关。l分子筛效应分子筛效应l浓缩效应浓缩效应第56页SDS-PAGE分离蛋白质分离蛋白质三、操作步骤三、操作步骤第57页第58页1.1.安装膜具安装膜具第59页装封胶条，注意封胶条平面朝下，不能有裂口装封胶条，注意封胶条平面朝下，不能有裂口第60页盖上凹玻璃盖上凹玻璃第61页将凹玻璃冲外装进槽里将凹玻璃冲外装进槽里第62页将楔子插进，将底部插紧将楔子插进，将底部插紧 第63页2.配制凝胶溶液配制凝胶溶液w胶配制(平行电泳两块胶板)胶母液：8.4ml 配胶缓冲液：13ml 蒸馏水：4ml 10%TEMD：0.2ml，混匀 10%AP：0.2ml，混匀 3.灌胶，加到顶部，往返倾斜去气泡灌胶，加到顶部，往返倾斜去气泡第64页插入梳子插入梳子第65页胶凝后用夹子将玻璃夹出胶凝后用夹子将玻璃夹出第66页用夹子夹紧玻璃将封胶条轻轻撕掉用夹子夹紧玻璃将封胶条轻轻撕掉第67页旋转旋转180180度，凹玻璃向里度，凹玻璃向里第68页将玻璃放进槽内将玻璃放进槽内第69页加缓冲液加缓冲液第70页4.4.样品制备：样品制备：将将0.5ml 0.5ml 样品液，样品液，0.25ml 10%SDS 0.25ml 10%SDS和和0.25ml 0.25ml 1%1%巯基乙醇于小试管中，置巯基乙醇于小试管中，置100100水浴中煮水浴中煮沸沸3 3分钟后，取出冷却，然后，加入分钟后，取出冷却，然后，加入0.25ml 0.25ml 上样缓冲液（上样缓冲液（0.05%0.05%溴酚兰溴酚兰+40%+40%蔗糖溶液），蔗糖溶液），混合。取出混合样品混合。取出混合样品4040微升加入样品槽，每微升加入样品槽，每个样品重复两个。个样品重复两个。第71页5.5.加加 样样第72页6.6.电泳电泳第73页电泳：电泳：接通电源，电流恒定为接通电源，电流恒定为80mA，待溴酚兰指示，待溴酚兰指示剂移至离下端剂移至离下端0.5cm（约（约3小时），切断电小时），切断电源，拔去插头，倒出电极缓冲液于大烧杯中源，拔去插头，倒出电极缓冲液于大烧杯中（如此缓冲液欲重用时，应把正负电极液分（如此缓冲液欲重用时，应把正负电极液分别贮存）。别贮存）。第74页7.7.剥剥 胶胶第75页8 8 染色：染色：考马斯亮蓝染色，详见教材考马斯亮蓝染色，详见教材 9 9 脱色脱色第76页凝胶（脱色之后）结果分析凝胶（脱色之后）结果分析 1、计算迁移率（、计算迁移率（Rm值）：计算公式见教材。值）：计算公式见教材。2 2、绘制标准曲线：以标准蛋白亚基、绘制标准曲线：以标准蛋白亚基R Rm m值为横坐标，值为横坐标，以对应分子量对数值为纵坐标，即可绘制出测以对应分子量对数值为纵坐标，即可绘制出测定蛋白质分子量标准线图。定蛋白质分子量标准线图。3 3、计算未知蛋白亚基样品分子量：依据未知样品、计算未知蛋白亚基样品分子量：依据未知样品样样R Rm m值，从上述标准曲线图中即可查出其分子值，从上述标准曲线图中即可查出其分子量。量。第77页试验三试验三 DNS法测定还原糖法测定还原糖一、试验目标一、试验目标 掌握还原糖定量测定原理和方法掌握还原糖定量测定原理和方法二、原理二、原理在碱性溶液中，还原糖变为烯二醇，烯二醇可被在碱性溶液中，还原糖变为烯二醇，烯二醇可被3 3，5 5二硝基水杨酸（二硝基水杨酸（DNSDNS）氧化为糖酸，加热）氧化为糖酸，加热深入产生一个红棕色氨基化合物，在一定浓度深入产生一个红棕色氨基化合物，在一定浓度范围内，棕红色物质颜色深浅程度与还原糖量范围内，棕红色物质颜色深浅程度与还原糖量成正比，以此测定糖量。成正比，以此测定糖量。第78页三、操作步骤三、操作步骤1 1、葡萄糖标准曲线绘制、葡萄糖标准曲线绘制详见教材详见教材2 2、还原糖制备、还原糖制备 样品：苹果样品：苹果 滤液测定前稀释滤液测定前稀释4倍倍 其余操作见教材其余操作见教材3 3、样品酸水解和总糖提取、样品酸水解和总糖提取 滤液测定前稀释滤液测定前稀释2倍倍 其余操作见教材其余操作见教材4 4、苹果样品中总糖和还原糖测定、苹果样品中总糖和还原糖测定详见教材详见教材第79页试验四试验四 多酚氧化酶制备、性质和多酚氧化酶制备、性质和影响原因影响原因一、试验目标一、试验目标 学习从组织细胞中制备酶方法学习从组织细胞中制备酶方法 掌握多酚氧化酶作用、化学性质及影响原因掌握多酚氧化酶作用、化学性质及影响原因二、原理二、原理l多酚氧化酶催化儿茶酚氧化成儿茶醌，深入聚合成多酚氧化酶催化儿茶酚氧化成儿茶醌，深入聚合成褐色物质；褐色物质；l经过反应液颜色改变可大致判断反应程度，进而推经过反应液颜色改变可大致判断反应程度，进而推测酶作用及活力大小；测酶作用及活力大小；l酶是生物催化剂，易受到各种原因影响，如温度、酶是生物催化剂，易受到各种原因影响，如温度、pHpH、底物浓度、酶浓度等。、底物浓度、酶浓度等。第80页三、操作步骤三、操作步骤1 1、酶制备、酶制备150g150g土豆土豆（3 3组）组）150mL NaF150mL NaF溶液溶液匀浆匀浆四层纱布四层纱布过滤过滤每组取每组取50mL50mL16g16g固体硫酸铵固体硫酸铵4430min30min离心离心15min15min4000r/min4000r/min沉淀溶于沉淀溶于15mL15mL缓冲液中缓冲液中粗酶液粗酶液第81页2 2、多酚氧化酶作用、多酚氧化酶作用三、操作步骤三、操作步骤酶液酶液邻苯二酚邻苯二酚水水现象现象管管115d15d管管215d15d管管315d15d3737水浴反应，每间隔水浴反应，每间隔5min5min振荡，观察颜色改变，共振荡，观察颜色改变，共25min25min。第82页3 3、多酚氧化酶化学性质、多酚氧化酶化学性质三、操作步骤三、操作步骤酶液酶液变性剂变性剂邻苯邻苯二酚二酚反应反应现象现象管管115d15d3737水浴水浴10min10min管管210d10d三氯乙三氯乙酸，酸，2min10d3737水浴水浴10min10min管管315d苯硫脲结晶，苯硫脲结晶，5min15d3737水浴水浴10min10min3737水浴反应，水浴反应，10min10min。第83页4 4、底物专一性、底物专一性三、操作步骤三、操作步骤酶液酶液邻苯二酚邻苯二酚间苯二酚间苯二酚对苯二酚对苯二酚现象现象管管115d15d管管215d15d管管315d15d3737水浴反应，每间隔水浴反应，每间隔5min5min振荡，观察颜色改变，共振荡，观察颜色改变，共25min25min。第84页5 5、底物浓度影响、底物浓度影响三、操作步骤三、操作步骤3737水浴反应，水浴反应，1min1min。酶液酶液邻苯二酚邻苯二酚水水反应反应现象现象管管15d1d39d3737水浴水浴1min1min管管25d10d30d3737水浴水浴1min1min管管35d40dd3737水浴水浴1min1min第85页6 6、酶浓度影响、酶浓度影响三、操作步骤三、操作步骤3737水浴反应，水浴反应，2min2min。酶液酶液邻苯二酚邻苯二酚水水反应反应现象现象管管115d15d3737水浴水浴2min2min管管21d15d14d3737水浴水浴2min2min第86页7 7、H H+浓度影响浓度影响三、操作步骤三、操作步骤3737水浴反应，水浴反应，5min5min。0.8%HCl0.3%乳酸乳酸0.2%乳酸乳酸0.01%Na2CO30.5%Na2CO3酶液酶液邻苯邻苯二酚二酚现象现象管管140d8d7d管管240d8d7d管管340d8d7d管管440d8d7d管管540d8d7d第87页试验五试验五 碱性蛋白酶活力测定（福碱性蛋白酶活力测定（福林酚试剂法）林酚试剂法）一、试验目标一、试验目标 学习测定蛋白酶活力方法学习测定蛋白酶活力方法 掌握分光光度计原理和使用方法掌握分光光度计原理和使用方法二、原理二、原理酪蛋白酪蛋白蛋白酶蛋白酶酪氨酸酪氨酸比色测定比色测定钼蓝钼蓝钨蓝钨蓝酪氨酸酪氨酸福林酚福林酚第88页1 1、样品处理、样品处理三、操作步骤三、操作步骤详见教材详见教材2 2、比色测定、比色测定4 4支试管，分别加入支试管，分别加入1mL1mL酶液酶液4040预热预热2 23min3min空白管空白管平行管平行管1mL 2%1mL 2%酪蛋白酪蛋白4040，10min10min1mL 2%1mL 2%酪蛋白酪蛋白4040，15min15min2mL 2mL 三氯乙酸三氯乙酸4040，15min15min2mL 2mL 三氯乙酸三氯乙酸4040，10min10min过滤，分别取过滤，分别取1mL1mL滤液滤液（1）（2）（3）第89页三、操作步骤三、操作步骤2 2、比色测定、比色测定过滤，分别取过滤，分别取1mL1mL滤液滤液（3）分别加入分别加入5mL Na5mL Na2 2COCO3 3溶液溶液1mL1mL福林酚试剂福林酚试剂（4）4040反应反应20min20min（5）（6）比色测定比色测定A A680680，管，管做参比做参比第90页三、操作步骤三、操作步骤3 3、绘制标准曲线、绘制标准曲线（1 1）按教材表）按教材表3 32222加各种试剂，加各种试剂，福林酚试剂最终加入；福林酚试剂最终加入；（2 2）摇匀，）摇匀，40 40反应反应20min20min；（3 3）比色测定）比色测定A A680680，管，管1 1做参比；做参比；（4 4）绘制标准曲线，求）绘制标准曲线，求K K值。值。4 4、酶活力计算、酶活力计算第91页试验六试验六 菜花中核酸分离与判定菜花中核酸分离与判定一、试验目标一、试验目标 学习和掌握从植物组织中分离核酸原理和方法学习和掌握从植物组织中分离核酸原理和方法 掌握定糖法测定核酸原理及操作方法掌握定糖法测定核酸原理及操作方法二、原理二、原理l核酸提取：三氯乙酸或高氯酸除酸溶小分子核酸提取：三氯乙酸或高氯酸除酸溶小分子 有机溶剂去脂类有机溶剂去脂类 浓盐溶液（浓盐溶液（1010NaClNaCl）提）提DNADNA 0.5M 0.5M高氯酸提高氯酸提RNARNAlRNARNA核糖测定核糖测定:苔黑酚法苔黑酚法lDNADNA脱氧核糖测定：二苯胺法脱氧核糖测定：二苯胺法第92页三、操作步骤三、操作步骤1 1、核酸分离、核酸分离菜花花冠菜花花冠20g 20g 20mL9520mL95乙醇海砂乙醇海砂匀浆匀浆抽滤抽滤滤渣滤渣抽滤抽滤提取物一提取物一搅拌均匀搅拌均匀抽滤抽滤20mL20mL丙酮丙酮滤渣滤渣20mL20mL丙酮丙酮搅拌搅拌5min5min抽滤抽滤滤渣滤渣20mL20mL高氯酸高氯酸冰盐浴冰盐浴搅拌搅拌抽滤抽滤滤渣滤渣20mL9520mL95乙醇乙醇滤渣滤渣20mL20mL丙酮丙酮搅拌搅拌5min5min抽滤至干抽滤至干滤渣滤渣40mL1040mL10氯化钠氯化钠沸水浴沸水浴15min15min抽滤抽滤滤渣滤渣滤液滤液重复重复一次一次20mL20mL高氯酸高氯酸7070水浴水浴20min20min抽滤抽滤滤液滤液提取提取物二物二第93页三、操作步骤三、操作步骤2 2、RNARNA和和DNADNA定性判定定性判定（1 1）二苯胺反应）二苯胺反应 按教材表按教材表3 31515加入各种试剂，反应加入各种试剂，反应后观察并统计结果。后观察并统计结果。（2 2）苔黑酚反应）苔黑酚反应 按教材表按教材表3 31616加入各种试剂，反应加入各种试剂，反应后观察并统计结果。后观察并统计结果。第94页试验七试验七 Bradford法测定蛋白质含量法测定蛋白质含量一、试验目标一、试验目标 学习考马斯亮蓝学习考马斯亮蓝G G250250染色法测定蛋白质含量染色法测定蛋白质含量原理和方法。原理和方法。二、原理二、原理l考马斯亮蓝考马斯亮蓝G G250250与蛋白质结合后引发染料最大吸与蛋白质结合后引发染料最大吸收光改变，从收光改变，从465nm465nm变为变为595nm595nm；l蛋白质染料复合物有较高消光系数，蛋白最低检蛋白质染料复合物有较高消光系数，蛋白最低检出量为出量为1 1微克，灵敏度高；微克，灵敏度高；l反应快速，反应快速，2min2min，且结合物在，且结合物在1h1h内稳定；内稳定；l干扰物质少。干扰物质少。第95页三、操作步骤三、操作步骤1 1、牛血清白蛋白标准曲线制作、牛血清白蛋白标准曲线制作按教材表按教材表3 31212加入试剂；加入试剂；反应反应2min2min，以，以1 1号管为参比，测定号管为参比，测定A595A595；绘制标准曲线。绘制标准曲线。2 2、未知样品中蛋白质浓度测定、未知样品中蛋白质浓度测定详见教材详见教材第96页