结构生物学介绍和进展省公共课一等奖全国赛课获奖课件.pptx

结构生物学结构生物学董宇辉董宇辉BSRF，IHEP，CAS第1页结构生物学定义结构生物学定义顾名思义，结构生物学就是研究各种生物顾名思义，结构生物学就是研究各种生物大分子（蛋白质、核酸、糖类等）结构，大分子（蛋白质、核酸、糖类等）结构，结构与功效关系，以及怎样在生物体内发结构与功效关系，以及怎样在生物体内发挥作用学科。挥作用学科。第2页结构主要性结构主要性生物大分子功效主要取决于其结构。生物大分子功效主要取决于其结构。结构异常会引发功效改变，也是所谓结构异常会引发功效改变，也是所谓“构构像病像病”原因。原因。第3页疯牛病等构像病罪魁祸首疯牛病等构像病罪魁祸首Prion正常正常Prion致病致病Prion因为结构改变，因为结构改变，造成了疯牛病、克造成了疯牛病、克雅氏病（雅氏病（Creutzfeldt-Jacob Disease；CJD）等传染性脑海绵）等传染性脑海绵状病变（状病变（TSE）。）。第4页分子生物学：分子生物学：当代生物学主流方向当代生物学主流方向分子生物学是当代生物学中最主要学科，分子生物学是当代生物学中最主要学科，几乎每年诺贝尔化学奖，生理学或医学奖几乎每年诺贝尔化学奖，生理学或医学奖都授予这方面研究。都授予这方面研究。研究各种生物大分子功效以及在生物体中研究各种生物大分子功效以及在生物体中生物化学过程，是分子生物学最主要任务。生物化学过程，是分子生物学最主要任务。第5页结构在当代生物学里中心地位结构在当代生物学里中心地位在分子生物学中，结构是非常主要内容。在分子生物学中，结构是非常主要内容。只有在取得对应分子结构后才能深入地研只有在取得对应分子结构后才能深入地研究其功效和生化过程。究其功效和生化过程。第6页举例举例酶蛋白：只有在了解了酶活性中心结构以酶蛋白：只有在了解了酶活性中心结构以及怎样与底物结合后，才能真正了解这种及怎样与底物结合后，才能真正了解这种酶作用机理；酶作用机理；对肌肉中肌动蛋白和肌球蛋白结构有了详对肌肉中肌动蛋白和肌球蛋白结构有了详细了解，才能说明肌肉收缩和非肌肉细胞细了解，才能说明肌肉收缩和非肌肉细胞运动机理。运动机理。第7页Nobel in Structure一共有一共有11项诺贝尔奖授予生物分子结构方项诺贝尔奖授予生物分子结构方面研究。面研究。有结构解析方法研究，也有主要生物分有结构解析方法研究，也有主要生物分子结构和功效研究工作。子结构和功效研究工作。第8页The Nobel Prize in Physiology or Medicine 1962Francis HarryCompton Crick James DeweyWatsonMaurice Hugh Frederick Wilkins for their discoveries concerning the molecular structure of nucleic acids and its significance for information transfer in living materialFrom http:/nobelprize.org/nobel_prizes/第9页The Nobel Prize in Chemistry 1962Max Ferdinand Perutz John Cowdery Kendrew for their studies of the structures of globular proteinsFrom http:/nobelprize.org/nobel_prizes/第10页The Nobel Prize in Chemistry 1964Dorothy Crowfoot Hodgkinfor her determinations by X-ray techniques of the structures of important biochemical substancesFrom http:/nobelprize.org/nobel_prizes/第11页The Nobel Prize in Chemistry 1982Aaron Klugfor his development of crystallographic electron microscopy and his structural elucidation of biologically important nucleic acid-protein complexesFrom http:/nobelprize.org/nobel_prizes/第12页The Nobel Prize in Chemistry 1985Herbert A.HauptmanJerome Karlefor their outstanding achievements in the development of direct methods for the determination of crystal structuresFrom http:/nobelprize.org/nobel_prizes/第13页The Nobel Prize in Chemistry 1988for the determination of the three-dimensionalstructure of a photosynthetic reaction centreJohannDeisenhoferRobertHuber HartmutMichelFrom http:/nobelprize.org/nobel_prizes/第14页The Nobel Prize in Chemistry 1997Paul D.BoyerJohn E.WalkerJens C.Skoufor their elucidation of the enzymatic mechanism underlying thesynthesis of adenosine triphosphate(ATP)for the first discovery of an ion-transporting enzyme,Na+,K+-ATPaseFrom http:/nobelprize.org/nobel_prizes/第15页The Nobel Prize in Chemistry John B.FennKoichi TanakaKurt Wthrichfor the development of methods for identification and structure analyses of biological macromoleculesfor their development of soft desorption ionisation methods for mass spectrometric analyses of biological macromoleculesfor his development of nuclear magnetic resonance spectroscopy for determining the three-dimensional structure of biological macromolecules in solutionFrom http:/nobelprize.org/nobel_prizes/第16页The Nobel Prize in Chemistry Peter AgreRoderick MacKinnonfor discoveries concerning channels in cell membranesfor the discovery of water channelsfor structural and mechanistic studies of ion channelsFrom http:/nobelprize.org/nobel_prizes/第17页The Nobel Prize in Chemistry for his studies of the molecular basis of eukaryotic transcription From http:/nobelprize.org/nobel_prizes/第18页The Nobel Prize in Chemistry for studies of the structure and function of the ribosomeVenkatraman RamakrishnanThomas A.SteitzAda E.YonathFrom http:/nobelprize.org/nobel_prizes/第19页内螺旋内螺旋外螺旋外螺旋选择筛选择筛钾离子通道三维结构图诺贝尔化学奖钾离子透过细胞膜输运行为，对体内或是大脑中神钾离子透过细胞膜输运行为，对体内或是大脑中神经信号传导至关主要。然而离子通道选择性透过行经信号传导至关主要。然而离子通道选择性透过行为却困扰了生物学家许多年。为却困扰了生物学家许多年。第20页钾离子通道离子导通机理钾离子通道离子导通机理经过钾离子通道三维结经过钾离子通道三维结构，解释了它对离子选构，解释了它对离子选择性透过机理。（择性透过机理。（1）“多离子透过多离子透过”过程：原过程：原先通道里有三个钾离子先通道里有三个钾离子被束缚在里面，只有体被束缚在里面，只有体积适当钾离子才能经过积适当钾离子才能经过撞击，将另一个钾离子撞击，将另一个钾离子从相反方向弹出，而体从相反方向弹出，而体积较小纳离子不行。积较小纳离子不行。（2）通道内氨基酸残基结构，模拟了钾离子在溶液中水合状）通道内氨基酸残基结构，模拟了钾离子在溶液中水合状态。只有水合钾离子能够在通道内如同在水溶液内一样自由地态。只有水合钾离子能够在通道内如同在水溶液内一样自由地运动。运动。第21页钾离子通道钾离子通道Rod MacKinnon,Rockefeller University Potassium ion(center red ball)in the K+Channel at 3.2 resolution.Preferential flow of K+ions constitutes the electrical current in nerve cells.Science280,69-77(1998)Cell95,649-655(1998)Science289,123-127()Nature414,37-42()Nature414,43-48()Nature415,287-294()Cell 111,967-965()Nature 423,3341()第22页结构生物学进展：结构生物学进展：Road to structures without crystals董宇辉董宇辉BSRF，IHEP，CAS第23页Outline同时辐射（同时辐射（Synchrotron Radiation）小角散射（小角散射（Small Angle X-ray Scattering）自由电子激光（自由电子激光（Free Electron Laser）第24页同时辐射同时辐射Synchrotron RadiationLet there be light:and there was light.-Genesis第25页X射线晶体学和NMR是蛋白质结构测定主要技术http:/www.pdb.org/pdb/statistics/holdings.do，10月2日99.2%99.2%测定方法测定方法蛋白质结构蛋白质结构X射线晶体学射线晶体学74768NMR9616EM综合方法综合方法45851Other165总数总数85058第26页各种生各种生物基因物基因组和功组和功效基因效基因组数据组数据基因基因克隆克隆蛋白制备蛋白制备结构测定结构测定结构测定结构测定样品制备样品制备蛋白结构蛋白结构蛋白质结构测定流程蛋白质结构测定流程靶标克隆表示可溶纯化结构15272148666408147484380.6.16 http:/secsg.org/cgi-bin/report.pl第27页取得生物大分子结构主要技术取得生物大分子结构主要技术核磁共振方法：分辨率与灵敏度不够，不能确定分子量很大结核磁共振方法：分辨率与灵敏度不够，不能确定分子量很大结构，要求样品浓度极高，测定效率低下（几个星期甚至几个月构，要求样品浓度极高，测定效率低下（几个星期甚至几个月数据搜集时间）。数据搜集时间）。晶体学方法：对样品要求过高，高质量晶体取得困难。晶体学方法：对样品要求过高，高质量晶体取得困难。试验耗时试验耗时 单晶难以取得单晶难以取得 相位解析需要特殊单晶相位解析需要特殊单晶 分辨率低分辨率低 灵敏度低灵敏度低 第28页How to obtain structures by protein crystallography?Expression/purificationcrystallizationX-ray diffractionphasingModel buildingRefined structure第29页蛋白质晶体蛋白质晶体衍射能力很弱：大部分原子为衍射能力很弱：大部分原子为C、N、O、S；晶体质量差，晶胞大；晶体质量差，晶胞大；相位问题处理困难。相位问题处理困难。理想光源必须含有以下特点：理想光源必须含有以下特点：高亮度：衍射能力很弱也能够得到好数据；高亮度：衍射能力很弱也能够得到好数据；准直性好：质量差、晶胞大晶体也能够进准直性好：质量差、晶胞大晶体也能够进 行试验；行试验；能量可调：多波长反常散射处理相位问题。能量可调：多波长反常散射处理相位问题。同时辐射恰好提供了适合光源。同时辐射恰好提供了适合光源。第30页什么是同时辐射？什么是同时辐射？靠靠近近光光速速运运动动电电子子或或正正电电子子在在改改变变运运动动方方向向时时放放出出电电磁磁辐辐射射，因因为为是是在在同同时时加加速速器器上发觉，所以称为同时辐射。上发觉，所以称为同时辐射。这这种种辐辐射射强强度度高高、覆覆盖盖频频谱谱范范围围广广，能能够够任任意意选选择择所所需需要要波波长长且且连连续续可可调调，所所以以成成为一个科学研究新光源。为一个科学研究新光源。第31页同时辐射装置示意图同时辐射装置示意图Booster储存环储存环部分图片来自部分图片来自SSRL第32页三种发光元件三种发光元件弯转磁铁弯转磁铁扭摆器扭摆器(Wiggler)波荡器波荡器(undulator)图片来自图片来自SSRL第33页发光元件发光元件光束线光束线试验站试验站第34页同时辐射亮度（单位同时辐射亮度（单位时间，单位面积，单时间，单位面积，单位立体角，一定光子位立体角，一定光子能量范围内光子数）能量范围内光子数）和转靶和转靶X光机比较。光机比较。图片来自图片来自MAX IV设计汇报设计汇报第35页Divergence2p p立体角：立体角：1801毫弧度：毫弧度：0.06 三代光源甚至到达三代光源甚至到达10微弧度微弧度第36页实际蛋白质单晶实际蛋白质单晶真实单晶体内部不真实单晶体内部不是完美，能够看是完美，能够看成有一系列小晶成有一系列小晶体镶嵌而成，每个体镶嵌而成，每个小晶体能够认为是小晶体能够认为是完美晶体。这些完美晶体。这些小晶体取向无序小晶体取向无序程度以程度以“镶嵌度镶嵌度”表表征。征。第37页分子置换法（分子置换法（Molecular Replacement，MR）同晶置换法（同晶置换法（Isomorphous Replacement，IR，SIR/MIR）反常散射法（反常散射法（Anomalous Dispersion，AD，SAD/MAD）直接法（直接法（Direct method）Phasing methods第38页Energy range同时辐射覆同时辐射覆盖了一个很盖了一个很宽频谱范围，宽频谱范围，从远红外到从远红外到硬硬X光。而光。而X光机只能光机只能提供几个分提供几个分立光子能量。立光子能量。第39页MIR（多对同晶置换）（多对同晶置换）设法在蛋白质晶体设法在蛋白质晶体中加入一些重金属中加入一些重金属离子，同时晶体结离子，同时晶体结构不发生大改变构不发生大改变（同晶置换），置（同晶置换），置换前后结构因子关换前后结构因子关系。系。第40页一个同晶置换能够得到两个可能解。一个同晶置换能够得到两个可能解。第41页两个同晶置换就能够得到唯一解。两个同晶置换就能够得到唯一解。第42页“同时辐射同时辐射+硒代硒代+样品冷冻样品冷冻”已经已经成为解析全新结构标准方法。成为解析全新结构标准方法。第43页多波长反常衍射（多波长反常衍射（MAD）MIR能够解析全新结构，假如能够得到足能够解析全新结构，假如能够得到足够同晶置换晶体话。够同晶置换晶体话。假如蛋白质里有金属离子存在，就能够使假如蛋白质里有金属离子存在，就能够使用用MAD方法。方法。硒代。硒代。第44页原子散射因子原子散射因子第45页MAD选择吸收边附近几个波长，相当于几个不选择吸收边附近几个波长，相当于几个不一样完全同晶置换。一样完全同晶置换。分子生物学提供了硒代伎俩，对于解析全分子生物学提供了硒代伎俩，对于解析全新结构非常有利。新结构非常有利。关键是衍射试验使用关键是衍射试验使用X射线（能量）波长必射线（能量）波长必须可变！须可变！第46页同时辐射作用同时辐射作用同时辐射加入，大大提升了结构测定速度。同时辐射加入，大大提升了结构测定速度。第47页PDB(Protein Data Bank)图片来自图片来自http:/www.pdb.org/蛋白质结构增加蛋白质结构增加第48页同时辐射促进了蛋白质结构解析同时辐射促进了蛋白质结构解析1980-1990年，取得解析蛋白质数量大幅度增年，取得解析蛋白质数量大幅度增加；加；1980左右，同时辐射开始应用到蛋白质结构左右，同时辐射开始应用到蛋白质结构解析中，解析中，1990年各种技术趋于成熟，同时辐年各种技术趋于成熟，同时辐射大规模应用于生物大分子结构解析。射大规模应用于生物大分子结构解析。第49页生物学家评论生物学家评论生物大分子结构测定影响了生物学几乎全生物大分子结构测定影响了生物学几乎全部领域。部领域。几乎每个星期都有激感人心结构发表在如几乎每个星期都有激感人心结构发表在如Science和和Nature这么杂志上。这么杂志上。生物大分子晶体学已经比其它任何学科更生物大分子晶体学已经比其它任何学科更多地得益于同时辐射应用。多地得益于同时辐射应用。-Steven E.Ealick，Cornell Univ.第50页MAD试验波长选择试验波长选择f1f2f3f4第51页四个可选择波长四个可选择波长f1：peak，f最大；最大；f2：inflection，f最大；最大；f3：high energy remote；f4：low energy remote。流行做法：一边搜集数据，一边解析结构。流行做法：一边搜集数据，一边解析结构。普通完成普通完成f1数据搜集，进行数据搜集，进行f2数据搜集时就数据搜集时就完成相位解析了。完成相位解析了。第52页几个波长？几个波长？理论上理论上2个波长就足够破解双解了，不过有个波长就足够破解双解了，不过有直接法帮助，直接法帮助，1个波长也就足够了。个波长也就足够了。当然波长越多会越好，不过试验时间延长当然波长越多会越好，不过试验时间延长往往会带来不可预知原因：辐射损伤，仪往往会带来不可预知原因：辐射损伤，仪器设备不稳定等。器设备不稳定等。第53页反常衍射分类反常衍射分类单波长反常衍射：单波长反常衍射：SAD；多波长反常衍射：多波长反常衍射：MAD。第54页Peak波长得到相角波长得到相角 三个波长得到相角三个波长得到相角烯醇酶烯醇酶-磷酸酶磷酸酶 E1 第55页人源人源“Coactosin-like”蛋白蛋白peak与与h-remote组合组合 三个波长三个波长第56页同时辐射蛋白质晶体学发展同时辐射蛋白质晶体学发展更小晶体：生长晶体是蛋白质晶体学瓶颈，更小晶体：生长晶体是蛋白质晶体学瓶颈，假如能够解析小晶体结构将使得许多困难假如能够解析小晶体结构将使得许多困难结组成为可能。结组成为可能。更自动化试验流程：不论是解析结构还是更自动化试验流程：不论是解析结构还是在药品研究中应用，大量尝试需要自动化在药品研究中应用，大量尝试需要自动化流程。流程。第57页当前，当前，10微米左右质量良好微米左右质量良好晶体已经能够解析出生物大晶体已经能够解析出生物大分子结构。（分子结构。（ESRF，发表，发表于于J.Mol.Biol.,367,310-318.）SSRF：可能到达：可能到达5微米。微米。不过有相当多生物大分子不过有相当多生物大分子只能够取得只能够取得1微米左右微微米左右微晶，如左图所表示与老年晶，如左图所表示与老年性痴呆相关蛋白质极难形性痴呆相关蛋白质极难形成大单晶。成大单晶。当前同时辐射装置希望能提供当前同时辐射装置希望能提供1微米聚焦光斑解析这些微米聚焦光斑解析这些 m大小晶体结构。将大大降低生物大分子结晶门槛，大小晶体结构。将大大降低生物大分子结晶门槛，极大地推进结构生物学研究和药品研发进展。极大地推进结构生物学研究和药品研发进展。1 m量级蛋白质晶体结构解析量级蛋白质晶体结构解析第58页Summary同时辐射提供了解析蛋白质结构最适合光同时辐射提供了解析蛋白质结构最适合光源。源。同时辐射广泛应用，分子生物学技术发展同时辐射广泛应用，分子生物学技术发展以及蛋白质晶体学理论、软件完善，使得以及蛋白质晶体学理论、软件完善，使得解析蛋白质结组成为相对比较常规技术。解析蛋白质结组成为相对比较常规技术。第59页小角散射小角散射Small Angle X-ray ScatteringSimplest is the best.第60页取得生物大分子结构困难取得生物大分子结构困难核磁共振方法：分辨率与灵敏度不够，不能确定分子量很大结核磁共振方法：分辨率与灵敏度不够，不能确定分子量很大结构，要求样品浓度极高，测定效率低下（几个星期甚至几个月构，要求样品浓度极高，测定效率低下（几个星期甚至几个月数据搜集时间）。数据搜集时间）。晶体学方法：对样品要求过高，晶体不是想得到就能得到。晶体学方法：对样品要求过高，晶体不是想得到就能得到。试验耗时试验耗时 单晶难以取得单晶难以取得 相位解析需要特殊单晶相位解析需要特殊单晶 分辨率低分辨率低 灵敏度低灵敏度低 第61页NMR技术能够研究溶液状态蛋白，不过受到很多限制测定一系列二维、三维测定一系列二维、三维核磁共振谱，经过谱峰核磁共振谱，经过谱峰位置计算原子之间键长、位置计算原子之间键长、键角、二面角等立体化键角、二面角等立体化学参数，从而得到整个学参数，从而得到整个分子三维结构。分子三维结构。存在限制：存在限制：灵敏度不够：需要很浓溶液灵敏度不够：需要很浓溶液分辨率不高：存在分子量上限分辨率不高：存在分子量上限（39kD）采集速度慢：样品稳定性问题采集速度慢：样品稳定性问题缺乏弱相互作用和中间体捕捉缺乏弱相互作用和中间体捕捉技术技术膜蛋白结构测定方法不完善膜蛋白结构测定方法不完善第62页蛋白质晶体学问题主要在于样品得到晶体得到晶体探测衍射点强度探测衍射点强度确定衍射相位确定衍射相位得到电子密度分布得到电子密度分布进而取得原子位置进而取得原子位置主要问题：主要问题：单晶难于制备，尤其是复合物单晶难于制备，尤其是复合物解析相位需要特殊晶体解析相位需要特殊晶体第63页小角散射（小角散射（SAXS）不需要晶体，在溶液中就可进行试验。不需要晶体，在溶液中就可进行试验。不受分子量限制。不受浓度限制。不受分子量限制。不受浓度限制。试验时间短，对样品稳定性要求低。试验时间短，对样品稳定性要求低。仪器设备简单，能够开展原位试验。仪器设备简单，能够开展原位试验。图片来自图片来自RIKEN SPring-8 Center Dr.Tetsuro Fujisawa第64页小角散射所需样品小角散射所需样品50微升溶液；微升溶液；蛋白浓度在蛋白浓度在0.1-10mg/ml；分子量在几千至几亿分子量在几千至几亿Da；单分散（单分散（mono-disperse）。）。图片来自图片来自RIKEN SPring-8 Center Dr.Tetsuro Fujisawa第65页小角散射优点小角散射优点对样品要求很低：溶液样品既可，分子量、对样品要求很低：溶液样品既可，分子量、浓度不拘，稳定性不用很高。浓度不拘，稳定性不用很高。有些时候结晶会引发一些结构上改变（因为有些时候结晶会引发一些结构上改变（因为结晶时候结晶时候packing force造成），小角散射试造成），小角散射试验在溶液中进行，更加好地反应生物大分子验在溶液中进行，更加好地反应生物大分子真实状态。真实状态。试验相对简单快速，提供了原位研究动态过试验相对简单快速，提供了原位研究动态过程可能性。程可能性。第66页小角散射（小角散射（1D）vs 衍射（衍射（3D）1条谱线条谱线上万个衍射点上万个衍射点结构信息（结构信息（3D）第67页图片来自图片来自RIKEN SPring-8 Center Dr.Tetsuro Fujisawa第68页小角散射缺点小角散射缺点小角散射得到信息量极少，要得到三维结小角散射得到信息量极少，要得到三维结构信息是很困难。只能得到一些比较粗略、构信息是很困难。只能得到一些比较粗略、低分辨信息，如生物大分子大小、形状等。低分辨信息，如生物大分子大小、形状等。衍射能够取得非常多衍射点强度，能够解衍射能够取得非常多衍射点强度，能够解析出三维结构来。析出三维结构来。相对于晶体学衍射，小角散射理论还不够相对于晶体学衍射，小角散射理论还不够成熟。成熟。第69页经典应用经典应用生物大分子（散射体）大小、分布；生物大分子（散射体）大小、分布；大致形状（球形、柱形、椭球形等）。大致形状（球形、柱形、椭球形等）。分子越大，试验越轻易：和晶体学恰好相分子越大，试验越轻易：和晶体学恰好相反。反。第70页最近发展最近发展能够拟合出生物大分子形状：能够拟合出生物大分子形状：Shape determination 利用一系列球谐函数表征分子外形，这个利用一系列球谐函数表征分子外形，这个外形（包络）之外密度为零，之内是均匀外形（包络）之外密度为零，之内是均匀密度。密度。或者用一系列虚拟原子（或者用一系列虚拟原子（dummy atoms）或者虚拟残基来描述生物大分子，调整这或者虚拟残基来描述生物大分子，调整这些虚拟原子或者虚拟残基位置来确定分子些虚拟原子或者虚拟残基位置来确定分子形状。形状。第71页M.B.Kozin,V.V.Volkov and D.I.SvergunJ.Appl.Cryst.(1997).30,811815用球谐函数展开来表示生用球谐函数展开来表示生物大分子形状。拟合展开物大分子形状。拟合展开系数，使得计算谱线与试系数，使得计算谱线与试验最靠近。需要正则化方验最靠近。需要正则化方法来进行拟合。法来进行拟合。程序：程序：gnomD.I.Svergun，J.Appl.Cryst.(1992).25,495503第72页用虚拟原子来表示生物大分子形状。模用虚拟原子来表示生物大分子形状。模拟退火这些虚拟原子位置，使得计算谱拟退火这些虚拟原子位置，使得计算谱线与试验最靠近。线与试验最靠近。程序：程序：damin 和和 gasborD.I.Svergun，Biophysical Journal(1999).76,28792886第73页重建晶体结构中丢失部分重建晶体结构中丢失部分晶体衍射中看不到部分普通都是一些柔性晶体衍射中看不到部分普通都是一些柔性loop区域。利用小角散射能够拟合出这区域。利用小角散射能够拟合出这些些loop区域来。区域来。程序：程序：credoPetoukhov,Eady,Brown,and Svergun，Biophysical Journal().83,31123125第74页生物大分子复合物生物大分子复合物已知各亚基分子结构，已知各亚基分子结构，而复合物结构未知；改而复合物结构未知；改变亚基相对位置及取向变亚基相对位置及取向来拟合试验谱线。来拟合试验谱线。程序：程序：masshaKonarev,Petoukhov and Svergun，J.Appl.Cryst.().34,527532第75页研究实例（一）研究实例（一）从基因到功效：从基因到功效：dCMP脱氨酶脱氨酶第76页Smu206：An unknown protein from S.mutanscatalyzes the deamination of dCMP to deoxyuridine-5-monophosphate(dUMP);contains a Zn2+which is important for the catalysis;catalytic activity depends on the feedback regulation based on the ratio of dCTP to dTTP,which are both the end products of the pyrimidine salvage pathway.From the gene sequence,smu206 from Streptococcus mutansUA159 should be deoxycytidylate deaminase.第77页orotic acidUMPCMPRNAdUMPdCMPdCDPdCTPdTMPdTDPdTTPDNAdCD is an enzyme involving in pyrimidine salvage pathway.It catalyses the deamination of dCMP to dUMP,which is thesubstrate of thymidylate synthase for producing TMP.dCD reduces the efficiency of anticancer and antiviral drugs via deamination at the nucleotide level,this indicates that dCD inhibitorshave potential applications in chemotherapy.第78页+H2OdCMP deaminasedCMPdUMPdCTPdTTPMg2+activatorinhibitorMg2+The deanimation of dCMP to dUMP.dCTP as activator whiledTTP as inhibitor.A Mg2+is necessary for the function of dCTPor dTTP.第79页Regulation of C&T amountsAGTCdCMPExcessive C meansinsufficient T,reactionstarts:dCTP activating;Excessive T,reactionsuppresses:dTTP inhibiting.dTTP inhibitingdCTP activating第80页Kinetic assay of Sm206:yes,it is Sm-dCDThe activity of dCMP;The regulation of dCTP/dTTP ratio.第81页Structure determination of Sm-dCDExpressed in E.coli.Purification,Crystallation.Zn found.Structure solved via Zn-MAD.Resolution of 2.8.Complex of enzyme,substrate analog PdR(pyrimidine-2-one deoxyribotide)and activator dCTP is also crtstallized.Structure solved to 1.65.第82页The crystalsSample:8mg/ml Sm-dCDReservoir:0.1M Tris-HCl,1.5M(NH4)2SO4,15%(v/v)glycerol.Growth under 20C,3 days.Dehydration was used to improve the diffraction.Sample:10mg/ml Sm-dCD,1mM PdR,5mM dCTP and 5mM MgCl2.Reservoir:0.1M MES,1.6M(NH4)2SO4,12%(v/v)dioxane.Growth under 20C,5 days.第83页Structure determination of Sm-dCD第84页The structure of Sm-dCDThe substrate analog PdR isfound as its hydrate derivativeDHOMP(3,4-dihydrouridine-5-monophosphate)第85页The hexamer of Sm-dCDThe allosteric regulator dCTP isfound between two monomers.第86页第87页Two different Zn ions第88页The roles of Zn in dCD functionOne Zn ion is important for the catalysis.It binds to His71,Cys99,Cys102 and DHOMP.These residues are highly conserved in all species.Another Zn ion does not come in direct contact with the substrate analog and the allosteric regulator.It plays a role in the loop stability,which shapes the site that binds the phosphate group of the substrate analog.The residues around this Zn ion are not conserved.Mammalian dCDs do not contain this Zn ion.第89页Conformation modification due to DHOMP and dCTP bindingApoenzyme:open conformation(blue);Complex:close conformation(red).第90页Modification of quaternary structureA dimer isolated from the hexamer.The binding of DHOMP and dCTP result in a denser hexamer and favorable for the protein function.Apoenzyme:blue;Complex:red.第91页Catalytic mechanism第92页研究实例（二）：研究实例（二）：CooA起源于光合细菌起源于光合细菌Rhodospirillum rubrumCO-oxidation activator protein(CooA)。CooA结合结合CO后造成构型改变，以结合特定后造成构型改变，以结合特定DNA。这个蛋白属于。这个蛋白属于catabolite