壳寡糖-酪蛋白美拉德反应产物的优化制备及抗氧化活性.pdf

1272023年第9期中国食品添加剂China Food Additives试验研究收稿日期：2022-08-24 作者简介：李飞寰（1997-），女，硕士，研究方向：食品加工与安全。*通信作者：赵永亮（1966-），女，博士，教授，研究方向：生物制药。壳寡糖-酪蛋白美拉德反应产物的优化制备 及抗氧化活性李飞寰，赵永亮*，姚启悦，赵春杰，任军华，王欢，安星亮（河南工业大学生物工程学院，郑州 450001）摘 要：以壳寡糖与酪蛋白为反应物，通过建立湿法美拉德反应体系，制备壳寡糖-酪蛋白美拉德反应产物（CC-MRPs）。以还原力为指标，通过单因素与响应面试验优化壳寡糖（COS）与酪蛋白（Cas）美拉德反应条件，并测定其对 1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH 自由基）、2，2-连氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二铵盐（ABTS+自由基）、羟基自由基（OH 自由基）的清除能力。结果表明 CC-MRPs 最优反应条件组合为：初始 pH 10.9，反应温度 120，反应时间 2.7 h、COSCAS 质量比 3.91。在此条件下形成的 5 mg/mL CC-MRPs 的还原力为 1.390.04。此外 CC-MRPs 对 OH 自由基的清除率与 4 mg/mL 以及 5 mg/mL 维生素 C 相当，DPPH 自由基清除率显著弱于维生素 C，5 mg/mL CC-MRPs 对 ABTS+自由基的清除率显著高于维生素 C。关键词：壳寡糖；酪蛋白；美拉德反应产物；抗氧化性中图分类号：TS202.3 文献标识码：A 文章编号：1006-2513（2023）09-0127-07doi：10.19804/j.issn1006-2513.2023.09.017Optimization of preparation of Maillard reaction products from chitosan oligosaccharide-casein and their antioxidant activityLI Feihuan，ZHAO Yongliang*，YAO Qiyue，ZHAO Chunjie，REN Junhua，WANG Huan，AN Xingliang（College of Bioengineering，Henan University of Technology，Zhengzhou 450001）Abstravt：Maillard reaction products（CC-MRPs）were prepared with chitosan oligosaccharide and casein.The Maillard reaction conditions were optimized by single factor and response surface tests.The scavenging abilities of CC-MRPs to 1，1-diphenyl-2-trinitrophenylhydrazine（DPPH），2，2-diazo-bis（3-ethyl-benzothiazole-6-sulfonic acid）diammonium salt（ABTS+）and hydroxyl radical（OH）were determined.The results showed that the optimal reaction conditions for CC-MRPs were：initial pH 10.9，reaction temperature 120，reaction time 2.7 h，and the mass ratio to COSCAS was 3.91.Under the above conditions，the reduction force of 5 mg/mL CC MRPs was 1.39 0.04.In addition，the scavenging rate of OH radical by CC MRPs was similar to that of 4 mg/mL and 5 mg/mL of vitamin C，the scavenging rate of DPPH radical was significantly weaker than that of vitamin C，and 5 mg/mL CC MRPs scavenging rate of ABTS+radical was significantly higher than that of vitamin C.Key words：chitosan oligosaccharide；casein；maillard reaction products；antioxidant activity1282023年第9期中国食品添加剂China Food Additives试验研究众所周知，人体生命代谢过程中产生大量对细胞造成氧化损伤的自由基，随之而来的是癌症等一系列疾病1-2。为了抵消过量自由基损害，需及时补充外源性抗氧化剂。然而，大多数报道与使用的人工合成抗氧化剂会产生肝损伤、癌症等副作用3。天然美拉德反应产物（Maillard reaction products，MRPs）含有还原酮、类黑精以及杂环化合物等抗氧化性物质，已成为近年来研究趋势4。壳寡糖（Chiooligosaccharide，COS）是自然界少有的天然碱性寡糖，作为壳聚糖水解产物，具有与其相似的解离性质，以及低溶血活性与低细胞毒性。另外，由于壳聚糖分子量大，溶解度低，使其应用范围受到一定限制，而壳寡糖具有的短链结构以及游离氨基酸，使其具有更好的生物活性、易被人体吸收利用以及在更大的 pH 值范围内有较好的溶解性等特性5。目前已有学者制备具有抗氧化活性的壳寡糖-氨基酸 MRPs：闫芳等6优化制备壳寡糖-赖氨酸制备条件，所得 MRPs 表现出对 DPPH 等自由基的强清除率；孙涛等7制备了高 DPPH 自由基清除率的低聚壳聚糖与-丙氨酸/天冬酰胺的 MRPs。酪蛋白（Casein，Cas）是从牛乳中分离出的一类全价蛋白质，经美拉德改性后，具有良好的乳化性、抗氧化性等8。目前，已有试验研究了 Cas 与不同糖反应生成具有功能活性的美拉德反应产物的制备条件9。研究证明，蛋白质与糖类的 MRPs抗氧化性与温度、时间、pH 值、质量比有关10。目前利用 COS 与 Cas 制备抗氧化性 MRPs 的研究比较少见。本研究以 COS 与 Cas 为原料，通过建立湿法美拉德反应体系，制备壳寡糖-酪蛋白美拉德反应 产 物（Chitosan oligosaccharide casein Maillard reaction product，CC-MRPs），并以还原力为指标，利用单因素与响应面试验探究 MRPs 具有强抗氧化性的最优条件；同时以维生素 C 作为对 照，探 究 CC-MRPs 与 维 生 素 C 对 ABTS+、DPPH、OH 自由基清除率，为 CC-MRPs 作为天然抗氧化剂在功能性食品中的应用提供理论 依据。1 材料与方法1.1 材料与试剂壳寡糖（脱乙酰度 90.14%）：上海麦克林生化科技有限公司；酪蛋白（生化试剂）：美国 Sigma 公司；氢氧化钠、盐酸（分析纯）：天津市科密欧化学试剂有限公司；三氯乙酸（TCA）、铁氰化钾、FeCl3（分析纯）：天津市光复科技发展有限公司；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、2，2-连氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二铵盐（ABTS）（分析纯），上海生工生物工程技术服务有限公司；水杨酸、过硫酸钾、过氧化氢（分析纯）：上海源叶生物科技有限公司。1.2 仪器与设备FiveEasy 台式 pH 计：上海梅特勒-托利多仪器有限公司；Tecan Infinite M1000 PRO 多功能酶标仪：上海新领生物科技发展有限公司；ALC-2103 电子天平：北京赛多利斯仪器系统有限公司；UMB-24 干式恒温器：北京优晟联合科技有限公司；TGL-16C 台式高速离心机：上海菲恰尔分析仪器有限公司。1.3 方法1.3.1 COS 与 Cas 储备液的制备将 Cas 用少量 0.1 mol/L NaOH 溶液润湿后，溶解于 pH7.0 的 PBS 中，使储备液质量浓度为50 g/L；其次，称取一定质量 COS，溶解于去离子水，得到质量浓度为 50 g/L 的储备液。1.3.2 COS-Cas 美拉德反应产物的制备参考许春雨11制备方法，并稍作改进。控 制 COS 与 Cas 的 总 浓 度 为 5 mg/mL，按 照VCasVCOS=13 量取一定体积的 Cas 与 COS，用去离子水补充溶液体积至 10 mL，调节溶液 pH至 10，在 130 金属浴下反应 2 h，立即放入冰水浴中停止反应，所得产物保存在 4，备用。1.3.3 单因素试验分别研究初始 pH 值、反应温度、反应时间与 COSCas 质 量 比 4 个 因 素 对 CC-MRPs 抗氧化性的影响。4 个因素变化范围为：初始 pH值 8、9、10、11、12、13；反应温度 90、100、110、120、130、140 ；反应时间 0、1、2、3、4、5 h；COSCas 质 量 比 12、11、21、1292023年第9期中国食品添加剂China Food Additives试验研究31、41、51。1.3.4 响应面试验采用响应面法中 Box-Behnken 设计（BBD），在单因素试验结果的基础之上，以初始 pH 值（X1）、反应温度（X2）、反应时间（X3）、COS 与Cas 质量比（X4）为自变量，以还原力（A700nm）为响应值进行试验设计，获得 CC-MRPs 最优反应条件。1.3.5 CC-MRPs 抗氧化性的测定a.还原力的测定 参考 Canabady-Rochelle 等12的方法并稍作调整。取样品溶液 2 mL 加入pH 6.6 的 0.2 mol/L 磷酸盐缓冲液与 1%铁氰化钾溶液各 2 mL，50 水浴 20 min 后冷却，随后加入 10%三氯乙酸溶液 2 mL，经 10000 r/min 离心10 min 后取上清液，加入去离子水 2 mL 与 0.1%氯化铁溶液 400 L，静置 10 min 后，测定 A700nm。b.DPPH 自由基清除能力的测定 参照 Xu等13报道的方法并稍作调整。分别取 0.5、1、2、3、4、5 mg/mL 样品溶液与 DPPH 溶液各 1 mL，避光反应 30 min 后，测定反应液于 517 nm波长处的吸光度，同时以只添加 DPPH 溶液作为对照组，以只添加样品溶液作为除色组。按照公式（1）计算 DPPH 自由基清除率：%1001%/DPPHBCA自由基清除率（1）式中：A 为试验组的吸光度；B 为对照组的吸光度；C 为除色组的吸光度。c.ABTS+自由基清除能力的测定 参考 Re等 14报道的方法并稍作调整。分别取 0.5、1、2、3、4、5 mg/mL 样 品 溶 液 1 mL 与 ABTS 工作 液（A734nm=0.70.02）9 mL 混 合 反 应 5 min，于 734 nm 波长处测定其吸光度。同时做只添加ABTS+工作液的对照组和只添加样品的除色组。按照公式（2）计算 ABTS+自由基清除率：%1001%/DPPHBCA自由基清除率%1001%/ABTSBCA自由基清除率%1001%/OHACB自由基清除率%1001%/ABTSBCA自由基清除率+（2）式中：A 为实验组的吸光度；B 为对照组的吸光度；C 为除色组的吸光度。d.OH 自由基去除能力测定 参考 Chen 等15报道的方法并进行适当调整。分别取 0.5、1、2、3、4、5 mg/mL 样品溶液 1 mL 与 FeSO4溶液、水杨酸溶液、H2O2溶液各 1 mL，40 反应 1 h，于510 nm 波长处测定吸光度。同时，以不加样品溶液作为空白组，样品溶液与 H2O2溶液作为吸收组。按照公式（3）计算 OH 自由基清除能力：%1001%/OHACB自由基清除率（3）式中 A 为空白组的吸光度；B 为样品组的吸光度；C 为吸收组的吸光度。1.3.6 数据处理采用 SPSS 20.0 统计软件对数据进行单因素方差分析，（P0.05 时差异显著）；Design-Expert 13.0 软 件 设 计 Box-Behnken 组 合 试 验；Origin 2021 进行绘图；以上所有试验均重复三次，结果取平均值，并以平均值 标准偏差表示。2 结果与分析2.1 反应条件对 CC-MRPs 还原力的影响2.1.1 初始 pH 对 CC-MRPs 还原力的影响由图 1 可知，当初始 pH 为 810时，随初始 pH 的增加，CC-MRPs 还原力呈现增长的趋势，当初始 pH 为 10 时，CC-MRPs 还原力为1.230.01，达到最大值。分析原因，可能是由于酸性环境时，由于氨基质子化，1，2-烯醇化反应容易进行，导致葡基胺无法产生。而在碱性环境时，由于氮原子影响，糖碱基 C1电子密度增加，导致 1，2-烯醇化难以进行，进而转向 2，3-烯醇化即形成更多抗氧化物质16。这与赵晶等17对酪蛋白与还原糖的美拉德反应研究结果一致。综上，初始 pH 选择 9、10、11 进行后续组合试验。8910111213还原力/A700nm初始pH00.250.50.7511.251.5bbacde图 1 初始 pH 对 CC-MRPs 还原力的影响Figure 1 Effect of initial pH on the reducing power of WPP-MRPs注：各组间不同字母表示差异显著（P0.05），下同。1302023年第9期中国食品添加剂China Food Additives试验研究2.1.2 反应温度对 CC-MRPs 还原力的影响由图 2 可知，当反应温度为 90120时，随反应温度的增加，CC-MRPs 还原力呈现增长的趋势，当反应温度为 120时，CC-MRPs 还原力为 1.310.04，达到最大值。这可能是由于随着反应温度带来的热量增加，氨基与羧基反应更加快速，短时间形成更多的 CC-MRPs（包含类黑、还原酮以及含 N、S 杂环化合物）18。当反应温度继续增加时，产物因不稳定而分解，导致 CC-MRPs 还原力呈现下降趋势。该结果与Lan 等19的研究一致。综上，反应温度选择110、120、130 进行后续组合试验。9010011012013014000.250.50.7511.251.5aabcdc还原力/A700nm反应温度/图 2 反应温度对 CC-MRPs 还原力的影响Figure 2 Effect of reaction temperature on the reducing power of WPP-MRPs2.1.3 反应时间对 CC-MRPs 还原力的影响由图 3 可知，当反应时间为 03 h 时，随反应时间的增加，CC-MRPs 还原力呈现先急剧后缓慢增长的趋势，当反应时间为 3h 时，CC-MRPs 还原力为 1.230.02，达到最大值。这可能是由于随着反应时间增加，氨基与羧基反应更加充分，美拉德反应中间产物经一系列反应形成的类黑精以及挥发性杂环物质增多18。当反应时间继续增加时，产物分解，导致 CC-MRPs 还原力呈现下降趋势。综上，反应时间选择 1、2、3 h 进行后续组合试验。2.1.4 COS：Cas 质量比对 CC-MRPs 还原力的影响由图 4 可知，随着 COS：Cas 质量比增加时，CC-MRPs 呈现先增长后平稳的趋势。分析其原因，可能是随着 COS 浓度的增加，美拉德反应更加充分，导致 CC-MRPs 还原力增加20。当COS：Cas 质量比为 3151 范围内时，CC-MRPs 还原力无显著性差异（P0.05），分别为1.13、1.16 与 1.17。该研究结果与徐红萍等16研究的美拉德反应改性壳聚糖产物体外抗氧化能力的研究有相似的结果。综上，选择 COS：Cas 质量比范围为 3151 进行后续组合试验。12112131415100.250.50.7511.251.5abcddd还原力/A700nmCOSCas质量比图 4 COS：Cas 质量比对 CC-MRPs 还原力的影响Figure 4 Effect of Cos：CAS mass ratio on the reducing power of WPP-MRPs2.2 响应面试验结果基于单因素实验结果，采用 BBD 对最优反应条件进行进一步研究。响应面试验设计的因素以及水平见表 1，响应面试验设计方案及结果见表 2。以 CC-MRPs 的还原力（Y）为响应值，对试验所得实际值进行多元拟合分析。得到以 CC-MRPs 还原力对初始 pH（X1）、反应温度（X2）、反应时间（X3）与 COS：Cas 质量比（X4）的回归模型如公式所示。Y=1.33+0.0125 X1-0.0642 X2+0.0358 X3+0.1292 X4 -0.0025 X1 X2+0.0050 X1 X3-0.0500 X1 X4+0.0250 X2 X3+0.0050 X2 X4-0.0875 X3 X4-0.0942 X12-0.0842 X22-0.1268 X32-0.1018 X42对二元多次回归方程进行显著性检验，结果01234500.250.50.7511.251.5abccdd还原力/A700nm反应时间/h图 3 反应时间对 CC-MRPs 还原力的影响Figure 3 Effect of reaction time on the reducing power of WPP-MRPs1312023年第9期中国食品添加剂China Food Additives试验研究见表 3。P 值大小表示各项显著性，P 值越小，说明影响越显著。一次项 X2、X3与 X4，交互项 X1 X4、X3 X4，以及所有二次项均显示 P0.01，因素影响极显著。一次项 X1，交互项 X1 X2、X1 X3、X2 X3、X2 X4的 P 值均 0.05，说明因素对还原力影响不显著。失拟项 P=0.1462 0.05，表明该模型失拟项不显著。模型 P0.01 表明此模型极显著。此外，该模型决定系数 R2=0.9772，校正系数 R2=0.9544，即利用该模型可解释 95.44%的还原力。通过以上数据分析可以说明此模型对实验数据拟合充分，可靠性良好。可用于预测 CC-MRPs 的还原力大小。通过求解回归方程，可得到 CC-MRPs 的最优反应条件为初始 pH 10.85，反应温度 120.13，反 应 时 间 2.65 h、与 COSCas 质 量 比3.871，此反应条件下，CC-MRPs 的还原力预测值为 1.37。结合实际操作，将最优反应条件调整为初始 pH 10.9，反应温度 120，反应时间 2.7 h、与 COSCas 质量比 3.91，对此条件进行验证实验，得到 CC-MRPs 还原力实际值为1.390.04，与预测值相符。表 1 响应面设计因素与水平表Table 1 Factors and levels in response surface design水平因素X1初始 pH 值X2反应温度/X3反应时间/hX4 COSCas质量比-1911013101012024111113035：1表 2 响应面试验设计及结果Table 2 Design and results of response surface experiments试验号因素还原力（A700nm）X1X2X3X4实际值预测值1-1-1001.031.20 21-1001.111.23 3-11001.161.08 411001.251.10 500-1-10.840.85 6001-11.071.10 试验号因素还原力（A700nm）X1X2X3X4实际值预测值700-111.281.28 800111.161.18 9-100-10.960.94 10100-11.081.07 11-10011.291.30 1210011.211.23 130-1-101.051.17 1401-101.110.99 150-1101.081.19 1601101.241.12 17-10-101.091.07 1810-101.051.08 19-10101.161.13 2010101.141.16 210-10-10.941.08 22010-11.070.95 230-1011.211.33 2401011.351.21 2500001.311.33 2600001.341.33 2700001.321.33 2811001.351.10 2900001.311.33 表 3 回归模型系数的显著性检验报告Table 3 Significance of coefficients in regression model方差分析平方和自由度均方F 值P 值模型0.4895140.035042.860.0001*X10.001910.00192.300.1517X20.049410.049460.570.0001*X30.015410.015418.890.0007*X40.200210.2002245.440.0001*X1X20.000010.00000.03060.8635X1X30.000110.00010.12260.7315X1X40.010010.010012.260.0035*X2X30.002510.00253.060.1019X2X40.000110.00010.12260.73151322023年第9期中国食品添加剂China Food Additives试验研究方差分析平方和自由度均方F 值P 值X3X40.030610.030637.540.0001*X120.057610.057670.640.0001*X220.046010.046056.440.0001*X320.104210.1042127.750.0001*X420.067210.067282.330.0001*残差0.0114140.00008失拟项0.0101100.00103.060.1462误差0.001340.0003总和0.500928注：*表示差异显著（P0.05），*表示差异极显著（P0.01）。2.3 CC-MRPs 自由基清除活性结果2.3.1 DPPH 自由基清除率测定结果由图 5（a）、（b）、（c）可以看出，随着样品浓度的增加，CC-MRPs 与维生素 C 对自由基的清除率均呈现先增大后不变的趋势。图（a）表明，任意浓度下，CC-MRPs 相对于维生素 C 对DPPH 自由基清除率偏低（P0.05）。图（b）表明，当 样 品 浓 度 为 5 mg/mL 时，CC-MRPs 对ABTS+自由基的清除率显著高于维生素 C（P0.05），分 别 为 98.77%、94.93%。图（c）表明，在样品浓度为 4 mg/mL 与 5 mg/mL 下，CC-MRPs 对 OH 自由基的清除率与维生素 C 相当（P 0.05）。当 CC-MRPs 以及维生素 C 浓度为 4 mg/mL 时，CC-MRPs 与维生素 C 对 OH 自由基的清除率分别为 93.04%、93.74%。当 CC-MRPs以及维生素 C 浓度为 5 mg/mL 时，CC-MRPs 与维生素 C 对 OH 自由基的清除率分别为 94.75%、93.91%。5060708090100DPPH自由基清除率/%ABTS+自由基清除率/%OH自由基清除率/%样品浓度/(mg/mL)样品浓度/(mg/mL)（a）（b）样品浓度/(mg/mL)（c）CC-MRPs维生素CCC-MRPs维生素CCC-MRPs维生素C0.512345204060801000.5123450204060801000.512345图 5 CC-MRPs 与维生素 C 对自由基的清除率Figure 5 Scavenging free radical rate by CC-MRPs and vitamin C注：（a）、（b）、（c）：CC-MRPs 与维生素 C 对 DPPH、ABTS+、OH 自由基的清除率3 结论本研究以 CC-MRPs 还原力为指标，通过单因素结合响应面试验优化 CC-MRPs 反应条件为：初始 pH 10.9，反应温度 120，反应时间2.7 h、与 COSCas 质量比 3.91。在此条件下，5 mg/mL CC-MRPs 的还原力为 1.390.04。此外 CC-MRPs 对 OH 自由基的清除率与 4 mg/mL以及 5 mg/mL 维生素 C 相当，DPPH 自由基清除率显著弱于维生素 C，5 mg/mL CC-MRPs 对ABTS+自由基的清除率显著高于维生素 C。研究结果说明，CC-MRPs 有望作为天然抗氧化剂在功能性食品中的应用提供理论依据。参考文献：1彭青，卢云浩，何强.花椒与辣椒协同抗氧化作用评价研究 J.中国调味品，2022，47（1）：40-45.2刘速速，李文凯，孙华，等.元宝枫籽多肽的制备及其抗氧化性的研究 J.中国调味品，2021，46（8）：6-11.3梁凯，闫巧珍，王晓闻，等.小米多酚体外生物活性的研究 J.中国调味品，2022，47（1）：26-31.4胡燕，陈忠杰，李斌.美拉德反应产物的功能特性和安全性研究进展 J.食品工业，2016，37（10）：258-262.5朱新锋，黄永春，杨锋，等.低聚壳聚糖制备的研究 J.中国调味品，2019，44（10）：68-72.6闫芳，荆迎军，蒋悦颖，等.壳寡糖-赖氨酸美拉德反应产物的优化制备及抗氧化活性 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