壳聚糖_BMP-2质粒温敏水凝胶复合体促犬牙槽骨再生的研究.pdf

872研究论著新医学 2023 年12 月第 54 卷第 12 期壳聚糖/BMP-2 质粒温敏水凝胶复合体促犬牙槽骨再生的研究李慧 吉秋霞【摘要】目的 进行壳聚糖/BMP-2 质粒温敏水凝胶复合体系 CS/CSn（pDNA-BMP2）-GP 的构建，对犬牙槽骨再生中此复合体系的作用进行分析。方法 将 4 只比格犬第 2、3 前磨牙建立牙周炎模型，实验牙齿随机划分为 3 组：CS/CSn-GP 组、CS/CSn（pDNA-BMP2）-GP 组、空白对照组。CS/CSn-GP 组注入不含 BMP-2 的壳聚糖水凝胶复合体（CS/CSn-GP）；CS/CSn（pDNA-BMP2）-GP 组注入壳聚糖/BMP-2 质粒温敏水凝胶复合体 CS/CSn（pDNA-BMP2）-GP，空白对照组不注入任何材料。8 周后处死，采用 Masson 染色法观察牙周炎部位牙槽骨再生状况；钙钴法观察骨缺损部位碱性磷酸酶（ALP）表达状况。结果 Masson 染色显示 CS/CSn-GP 组与 CS/CSn（pDNA-BMP2）-GP 组，均有不同程度的牙槽骨再生，CS/CSn（pDNA-BMP2）-GP 组再生显著；钙钴法显示 CS/CSn（pDNA-BMP2）-GP 组 ALP 强阳性，CS/CSn-GP 组 ALP 弱阳性，空白对照组为阴性。3 组 ALP 阳性部位着色的平均光密度值比较，CS/CSn（pDNA-BMP2）-GP组 CS/CSn-GP组空白对照组，两两比较P均0.05。结论 CS/CSn-GP复合修复体系对牙槽骨再生有着积极影响，包载 pDNA-BMP-2 后，有着更显著的促牙槽骨再生作用。【关键词】牙周炎；壳聚糖纳米粒；组织工程支架；骨形态蛋白 2；温敏水凝胶The promoting effect of chitosan thermosensitive hydrogel complex with chitosan nanoparticles carrying BMP-2 plasmid DNA on alveolar bone regeneration in beagle dogs Li Hui，Ji Qiuxia.Department of Stomatology，Beijing Friendship Hospital，Capital Medical University，Beijing 100000，China Corresponding author，Ji Qiuxia，E-mail:jqx_【Abstract】Objective To construct the chitosan/BMP-2 plasmid thermosensitive hydrogel complex CS/CSn（pDNA-BMP2）-GP，and evaluate the effect of this composite system on alveolar bone regeneration in beagle dogs.Methods Periodontitis models were established in the second and third premolars from 4 beagle dogs.All teeth were randomly divided into three groups：CS/CSn-GP group，CS/CSn（pDNA-BMP2）-GP group and blank control group.In the CS/CSn-GP group，CS/CSn-GP was injected.In the CS/CSn（pDNA-BMP2）-GP group，CS/CSn（pDNA-BMP2）-GP was injected.In the blank control group，no material was injected.All animals were sacrificed 8 weeks later.The alveolar bone regeneration in periodontitis was observed by Masson staining.The expression of alkaline phosphatase（ALP）in bone defects was observed by calcium and cobalt staining.Results Masson staining showed that different degrees of alveolar bone regeneration was noted in the CS/CSN-GP and CS/CSn（pDNA-BMP2）-GP groups，and significant regeneration was noted in the CS/CSn（pDNA-BMP2）-GP group.Calcium and cobalt staining revealed strongly-positive ALP in the CS/CSn（pDNA-BMP2）-GP group，weakly-positive ALP in the CS/CSN-GP group，and negative result in the blank control group.The average optical density value in the ALP-positive staining area in the CS/CSn（pDNA-BMP2）-GP group was higher than that in the CS/CSn-GP group，followed by that in the blank control group（all P 0.05）.Conclusions CS/CSn-GP composite repair system exerts positive effect on alveolar bone regeneration.Inclusion of pDNA-BMP2 can significantly promote the effect on alveolar bone regeneration.【Key words】Periodontitis；Chitosan nanoparticle；Tissue engineering scaffold；BMP-2；Thermosensitive hydrogel牙周病作为成人缺牙的主要原因，主要是指由牙周致病菌感染所引起的，发生在牙周支持组织的慢性细菌性感染性疾病，在全球范围内普遍存在1-4。牙周病导致的口腔内微生物稳态的破坏，基金项目：国家自然科学基金青年科学基金（81401526）作者单位：100000 北京，首都医科大学附属北京友谊医院口腔科（李慧）；266071 青岛，青岛大学附属医院口腔科（吉秋霞）通信作者，吉秋霞，E-mail:jqx_ DOI：10.3969/j.issn.0253-9802.2023.12.0062023 年12 月第 54 卷第 12 期873新医学 还可能增加各种全身疾病的发生风险，例如类风湿性关节炎、结肠炎、系统性红斑狼疮、心肌梗死和阿尔茨海默病等5-8。因此，有效治疗牙周炎并促进牙周组织再生对人类健康至关重要。传统的牙周治疗包括基础治疗、手术治疗、全身和局部施用抗生素等，在恢复牙周组织的生理结构和功能上，受主动诱导组织再生修复能力缺失的影响，均无法实现理想的牙槽骨再生效果9。在分子生物学、细胞生物学、组织工程技术有着更深入研究的背景下，在促进牙槽骨再生方面，联合使用组织工程和基因靶向治疗及干细胞归巢技术广受期望。本研究拟构建壳聚糖/BMP-2 质粒温敏水凝胶复合修复体系 CS/CSn（pDNA-BMP2）-GP，研究该复合体系在犬牙槽骨再生中的作用。材料与方法一、材 料1.动 物4 只 29 月龄比格犬，体质量 1516 kg，购自青岛博隆实验动物有限公司。2.试剂与仪器三聚磷酸钠（TPP，医药级，含量 99）购自上海精细化工材料研究所；pDNA-BMP2 购自青岛大学医学院中心实验室；多聚甲醛粉、，-GP（分析纯）购自国药集团化学试剂有限公司；壳聚糖（医级，脱乙酰度 90%）购自桓台县金湖甲壳制品有限公司；SM2000R 型病理组织切片机（Leica Biosystems，德国）。本研究已获得青岛大学医学院附属医院伦理委员会批准。二、方 法1.CS/CSn-GP 支架与 CS/CSn（pDNA-BMP2）-GP复合支架的制备称取0.1 g CS，用0.1 mol/L乙酸定容至100 mL，搅拌 1 h，得到 1 mg/mL 的 CS 溶液。称取 0.1 g的 TPP，用三蒸水定容至 100 mL，得到 1 mg/mL 的TPP 溶液。吸取 0.5 mL 的 TPP（aq）和 5 mL 的CS（aq），质量比为110，进行搅拌，时长为0.5 h，然后进行 5 min 超声震荡，静置 15 min，进行过滤处理，获得无菌 CSn 溶液。取 1 L pDNA-BMP2与 10 L CSn 加入 Eppendorf 管中，室温下均匀漩涡 30 s，即可制备成 N/P 等于 51 的 CSn（pDNA-BMP2）。取0.2 g CS，加入8 mL的0.1 mol/L乙酸，使用磁力搅拌器进行搅拌，持续时长为 2 h，待充分溶解后进行除杂，过滤，使用高压蒸汽进行灭菌（设置的条件为121，10 min），置入4 冰箱保存；使用 2 mL 双蒸水溶解 0.56 g，-GP，而后磁力搅拌器持续搅拌 5min 至充分溶解，使用滤膜（孔径为 0.22 m）过滤后，在 4 冰箱中保存滤液。对以上两种溶液，进行 15 min 的冰浴，然后以 2 8的比例，在 CS 溶液中逐滴加入，-GP 与 CS 溶液，并进行 10 min 的持续搅拌，就能够获得质量浓度为 2%的 CS 溶液和 5.6%质量浓度的，-GP 凝胶溶液。溶胶经 37 的恒温水浴后，转变为凝胶，形成 Cs/，-GP 温敏水凝胶。取适量 CS/CSn（pDNA-BMP2），加入 Cs/，-GP 温敏水凝胶中，进行磁力搅拌，使得纳米粒能够均匀散布，从而实现 CS/CSn（pDNA-BMP2）-GP 复合体系的制备。使用等量的去离子水，替代以上制备中使用的 pDNA-BMP2，不变动其他步骤，就可实现 CS/CSn-GP 复合修复体系的制备。2.CS/CSn-GP 复合支架系统及 CS/CSn（pDNA-BMP2）-GP 复合修复体系的性质检测扫描电镜观察：取少量的 CS/CSn-GP 溶液真空喷金，对表面形态进行检测并拍照。温敏性测定：制备 CS/CSn-GP 复合支架系统及 CS/CSn（pDNA-BMP2）-GP 复合修复体系，采用试管倒置法检测水凝胶在室温 37 时的溶胶-凝胶转变。3.实验动物模型的建立及分组根据 Kim 等10建模方法建立第二、三前磨牙牙周炎模型。从 4 只比格犬第二、三前磨牙（共 32颗牙，16 象限）选取 15 个象限的 30 颗牙齿随机分成 3 组：每个象限内牙齿为同一组，每组包含 5 个象限的 10 颗牙齿，A 组为 CS/CSn（pDNA-BMP2）-GP 组（n=10），B 组为 CS/CSn-GP 组（n=10），C 组为空白对照组（n=10）。实验使用的各种器械进行高压消毒，动物称重后，速眠新 0.40.8 mg/kg 肌注麻醉。对口内、口外使用碘酊进行消毒，铺无菌巾，对实验牙行翻瓣术，翻开黏膜骨膜瓣至前庭沟，对根面作平整处理，对残留肉芽组织进行去除，结合分组的差异，置入相应材料。A 组注入 CS/CSn（pDNA-BMP2）-GP 复合体，B 组注入CS/CSn-GP 复合体，C 组作为空白对照组仅做手术，不注入任何修复材料，组织瓣冠向复位，以 4-0 号线缝合。在术后 5 d 内，连续肌注青霉素 2106单位，以避免发生感染；流质软食喂养 1 周，以避免2023 年12 月第 54 卷第 12 期874新医学 术区受到咬合力的影响。术后 8 周，处死实验犬，取颌骨，标本分切，常规 4%多聚甲醛固定。行Masson 染色观察新生骨组织。行钙钴法测定 ALP强度表达。三、统计学处理采用 SPSS 19.0 和 GraphPad Prism 5.0 进行统计分析。正态分布定量资料用表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用 LSD 法。=0.05（双侧）。结 果一、扫描电镜观察扫描电镜（图 1）可见，CSn 纳米粒为规则球形，在复合体系中分散性好。见图 2。在 25 下，CS/CSn-GP 和 CS/CSn（pDNA-BMP2）-GP 复合修复体系可长时间保持溶胶状，在37 下，能够向凝胶状转变（图 2B、D）。三、Masson 染色结果Masson染色结果见图3。CS/CSn（pDNA-BMP2）-GP 组（图 3A）具有更多的新生骨（NB）、新生牙周膜（PDL）。平行排列的新生沙比纤维（SF）插入新生牙槽骨内。而 CS/CSn-GP 组（图 3B）只见少量 NB 形成，及少量的 SF，空白对照组（图 3C）只见极少 NB 生成，SF 极少。NB及PDL高度统计结果见图4。CS/CSn（pDNA-BMP2）-GP 组 NB 高度最高，CS/CSn-GP 组次之，空白对照组最低，两两比较差异均有统计学意义（P 均 0.05），而2 组与空白对照组相比，差异均有统计学意义（P均 0.01）。四、ALP 活性测定钙钴法染色结果见图 5。ALP 阳性部位被染为深棕色或黑色，CS/CSn（pDNA-BMP2）-GP 组（图5A）与 CS/CSn-GP 组（图 5B）同空白对照组（图5C）相比较，ALP 阳性部位有着更明显的着色。CS/CSn（pDNA-BMP2）-GP 组与 CS/CSn-GP 组相比较，ALP 阳性部位有着更明显的着色，呈深棕黑色。3 组 ALP 阳性部位的平均光密度（AOD）统计结果见图 6。结果表明：CS/CSn（pDNA-BMP2）-GP 组最高，CS/CSn-GP 组次之，空白对照组最低，两两比较差异均有统计学意义（P 0.05）。讨 论在组织再生领域内，可原位注射和生物降解的温敏水凝胶应用非常广泛11。它主要有以下优点：第一，温敏水凝胶在室温状态下为稳定流体表 1 CS/CSn-GP 和 CS/CSn（pDNA-BMP2）-GP 复合修复体系在 25 和 37 的成胶时间修复体25 37 1 min3 min5 min7 min1 min3 min5 min7 minCS/CSn-GP+CS/CSn（pDNA-BMP2）-GP+注：表示不成胶，表示成胶。图 1 CS/CSn-GP 扫描电镜图像二、温敏性测定CS/CSn-GP 和 CS/CSn（pDNA-BMP2）-GP 复合修复体系溶胶-凝胶转变速率与温度、时间的关系见表 1。在 25 下，CS/CSn-GP 和 CS/CSn（pDNA-BMP2）-GP 复合修复体系可长时间保持溶胶状，而在 37 下，3 min 内就能够向凝胶状转变。试管倒置法测定 CS/CSn-GP 和 CS/CSn（pDNA-BMP2）-GP 合修复体系溶胶-凝胶转变的实验结果2023 年12 月第 54 卷第 12 期875新医学 注：A 为 25 时 CS/CSn-GP 复合修复体系，B 为 37 时 CS/CSn-GP 复合修复体系，C 为 25 时 CS/CSn（pDNA-BMP2）-GP 复合修复体系，D 为 37 时 CS/CSn（pDNA-BMP2）-GP 复合修复体系。图 2 修复体溶胶-凝胶转变的实验结果 注：A 为 CS/CSn（pDNA-BMP2）-GP 组，B 为 CS/CSn-GP 组，C 为空白对照组；NB 为新生骨，PDL 为新生牙周膜，SF为新生沙比纤维，CV 为毛细血管；上图：100，下图：200。图 3 Masson 染色结果2023 年12 月第 54 卷第 12 期876新医学 注：*P 0.05，*P 0.05。图 4 3 组 NB 及 PDL 高度统计图注：A 为 CS/CSn（pDNA-BMP2）-GP 组，B 为 CS/CSn-GP 组，C 为空白对照组；上图：100，下图：200。图 5 钙钴法染色结果状，而在机体体温下，水凝胶会由流体变为胶体。故而，在局部治疗中，只需要利用注射器就能够向病变位置进行温敏水凝胶的靶向注入，无需进行手术，使得手术创伤能够尽可能地减轻，让患者获得更好的舒适度和接受度。第二，对注射型生物材料尤为重要的是，流体状的温敏水凝胶能够随着注射位置的变化而形成不定形水凝胶，从而避免受形状不规则的影响发生机体损伤。第三，载药性温敏水凝胶能够实现对药物的持续缓注：*P 0.05，*P 0.01。图 6 3 组 ALP 阳性部位的 AOD 统计结果释，不只是在改善药物不良反应及减少给药次数上有积极效果，对提升治疗靶向性、改善患者的舒适度等也有着积极作用。在组织工程技术进一步发展的背景下，在基因传递载体的研究中，纳米粒的研究是热点。作为天然的阳离子多糖，壳聚糖的生物相容性良好，可与 DNA 有效结合，对DNA 能够起到保护作用，以免被核酸酶降解，故而是非病毒基因传递的理想载体之一12-14。壳聚糖纳米粒的制备，可运用的方法较多，具体有共价交联法、乳化交联法、离子交联法、去溶剂法、大分子复合法15-16。其中，离子交联法采用TPP 交联剂对壳聚糖进行离子诱导，进行壳聚糖纳米粒的制备。离子交联法在室温条件下就可实现，具有较好的可行性，反应条件温和，不需要2023 年12 月第 54 卷第 12 期877新医学 使用到有机溶剂，制备出的纳米粒在粒径上可调且尺寸均一，是最多使用到的一种制备方法17。在本研究中，采用离子交联法制备 CS/CSn-GP 和 CS/CSn（pDNA-BMP2）-GP 复合修复体系。骨组织工程的构成三要素是生长因子、细胞和支架。其中，生长因子和支架有着重要作用。作为骨缺损修复治疗应用的一种新方法，骨组织工程在临床上也获得应用。BMP2 在体内诱导中体现出强大的作用，已被看作是有着最强大骨诱导能力的一种生长因子，也是可单独诱导骨组织形成的仅有的一种局部生长因子18。但因其极易被降解和变性的特点，目前临床应用较为局限。纳米微球（NPs）的显著特征是表面积大、直径小，能够为药物突破生物屏障及穿透细胞膜并积聚至目标位置带来帮助，使得药物具有更高的利用率及更强的靶向作用，故而在药物输送系统中有着良好作用19-20。采用试管倒置法对 CS/CSn-GP 和 CS/CSn（pDNA-BMP2）-GP 复合修复体系温敏性进行检测表明，在25 下，两者均为溶胶状，而在 37 下，3 min内两者就能够向凝胶状转变。反映出 CS/CSn-GP复合支架的温敏性良好，而 CSn（pDNA-BMP2）的加入对温敏性并不存在影响。壳聚糖具有的矩阵结构对细胞增殖具有积极影响，能够使得细胞微环境中壳聚糖的浓度保持在较高水平，从而使得基因的表达获得延长，并使得基因治疗具有更好效果21。如果 CS/CSn（pDNA-BMP2）-GP 复合修复体系由溶液变成水凝胶，常规孔和多孔结会构成交联网络。水凝胶显现出的形态特征，对水和小分子的自由移动是有利的。扫描电镜显示，在支架中 CSn（pDNA-BMP2）呈均布状，并嵌入支架支柱内，反映出 CSn（pDNA-BMP2）与支架有着紧密的结合。纳米粒子和支架的三维结构，能够对 pDNA-BMP2 起到保护作用，避免发生快速扩散与降解。充分表明，CS/CSn（pDNA-BMP2）-GP复合修复体系是潜力巨大的基因载体支架系统。部分研究显示，对 PCLDs 增殖及向成骨方向分化，BMP-2 能够起到诱导作用，如果将 BMP-2 与材料复合，进行细胞支架的制备，能够显著改善牙周再生效率，而它功能的发挥，主要依赖的是改善细胞的 ALP 活性，提高骨钙蛋白和胶原蛋白含量22。对成骨细胞的分化趋势，ALP 水平的高低可予以客观表征。在本实验中，应用 CS/CSn（pDNA-BMP2）-GP 复合修复体系后，与其他 2 组相比较，ALP 活性明显更高；在仅应用 CS/CSn-GP 组的情形下，与空白对照组相比较，ALP 活性更高。反映出，在促进牙槽骨再生方面，CS/CSn-GP 复合修复体系有着良好的能力，包载 pDNA-BMP2 后，能够显著提升成骨能力；此外，在 CS/CSn-GP 复合修复体系与一定量的 BMP-2 复合后，Masson 染色观察到在 8 周有出现明显的新生牙槽骨样结构，反映出牙周膜细胞受成骨诱导因子的刺激作用，在支架中实现成骨向分化，且有着明显的效果。故而说明，CS/CSn-GP 复合修复体系是 pDNA-BMP2 的良好载体。本实验表明：CS/CSn-GP 复合修复体系对牙槽骨再生有着积极影响，包载 pDNA-BMP-2 后，有着更显著的促牙槽骨再生作用。本研究对在牙周骨组织缺损修复中应用 CS/CSn（pDNA-BMP2）-GP 复合体系的可行性问题作了初步分析，为后期实验奠定了基础。参 考 文 献1 Eke P I，Dye B A，Wei L，et al.Prevalence of periodontitis in adults in the United States：2009 and 2010.J Dent Res，2012，91（10）：914-920.2 Chen Y，Zhu B L，Wu C C，et al.Periodontal disease and tooth loss are associated with lung cancer risk.Biomed Res Int，2020，2020：5107696.3 Kinane D F，Stathopoulou P G，Papapanou P N.Periodontal diseases.Nat Rev Dis Primers，2017，3：17038.4 Otomo-Corgrl J，Pucher J J，Rethman M P，et al.State of the science：chronic periodontitis and systemic health.J Evid Based Dent Pract，2012，12（3 Suppl）：20-28.5 Nemesh O M，Honta Z M，Slaba O M，et al.Pathogenetic mechanisms of comorbidity of systemic diseases and periodontal pathology.Wiad Lek，2021，74（5）：1262-1267.6 Pessoa L，Aleti G，Choudhury S，et al.Host-microbial interactions in systemic lupus erythematosus and periodontitis.Front Immunol，2019，10：2602.7 Sanz M，Del Castillo A M，Jepsen S，et al.Periodontitis and cardiovascular diseases.consensus report.Glob Heart，2020，15（1）：1.8 Zhang Y，Chen J，Fu 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