聚乳酸_羟基乙酸磁性微球的制备及其姜黄素负载.pdf

第 43 卷第 5 期2023 年 10 月林 产 化 学 与 工 业Chemistry and Industry of Forest ProductsVol.43 No.5Oct.2023 收稿日期:2022-05-23 基金项目:国家重点研发计划资助项目(2019YFB1309703);北京市自然科学基金(2202034)作者简介:李桂芳(1997),女,山东泰安人,硕士生,主要从事林产精细化工研究 通讯作者:雷建都,教授,博士生导师,研究领域为精细化工与生物医药;E-mail:ljd2012 。doi:10.3969/j.issn.0253-2417.2023.05.013聚乳酸/羟基乙酸磁性微球的制备及其姜黄素负载LI Guifang李桂芳,康玲玲,朱华泰,赵静养,雷建都,宋先亮(北京林业大学 林业生物质材料与能源教育部工程研究中心,北京 100083)摘 要:以聚乳酸/羟基乙酸(PLGA)共聚物为药物装载材料、油酸改性的四氧化三铁(Fe3O4OA)纳米颗粒为磁性功能材料,制备姜黄素/PLGA 磁性微球,考察了乳化方法、高速均质速度、水油相体积比、PLGA 用量、水相聚乙烯醇(PVA)质量分数、Fe3O4OA用量和姜黄素用量对磁性微球粒径的影响,并通过光学显微镜、激光粒度仪、紫外分光光度计、振动样品磁强计、热重分析仪等对其形貌及理化性能进行分析。研究结果显示:姜黄素/PLGA 磁性微球的最佳制备工艺为选用搅拌-均质两步乳化法、高速均质15 000 r/min、水油相体积比 10 1、PLGA 用量 100 mg、水相 PVA 质量分数 1%、Fe3O4OA用量 40 mg 和姜黄素用量40 mg,此条件下制备的微球表面光滑,粒径较均一,多分散性指数(PDI)为0.38,平均粒径为 3.60 m,微球的磁感应强度为 14.12(A m2)/kg,含磁量约为 27.98%。载药微球的包封率为 97.09%,载药率为 6.40%,在体外释放实验中表现出明显的缓释效果。关键词:姜黄素;聚乳酸/羟基乙酸;油酸改性的四氧化三铁;磁性微球中图分类号:TQ35;R944.9 文献标志码:A 文章编号:0253-2417(2023)05-0095-07引文格式:李桂芳,康玲玲,朱华泰,等.聚乳酸/羟基乙酸磁性微球的制备及其姜黄素负载J.林产化学与工业,2023,43(5):95-101.Preparation of Polylactic Acid/Glycolic Acid Magnetic Microspheres andTheir Loading of CurcuminLI Guifang,KANG Lingling,ZHU Huatai,ZHAO Jingyang,LEI Jiandu,SONG Xianliang(Engineering Research Center of Forestry Biomass Materials&Energy,Ministry of Education,Beijing ForestryUniversity,Beijing 100083,China)Abstract:The curcumin/polylactic acid/glycolic acid(PLGA)magnetic microsphere was innovatively prepared by a stirring-homogenization two-step emulsification method using PLGA copolymer as drug loading material and oleic acid-modified triirontetraoxide(Fe3O4 OA)nanoparticles as the magnetic functional material.Impacts of the emulsification method,high-speedhomogenization speed,water oil volume ratio,PLGA dosage,mass fraction of aqueous polyvinyl alcohol(PVA),the dosage ofFe3O4OA and curcumin on the particle size of magnetic microspheres were examined.The morphology and physicochemicalproperties of curcumin/PLGA magnetic microspheres were analyzed by optical microscope,laser particle sizer,ultravioletspectrophotometer,vibrating sample magnetometer and thermogravimetric analyzer,respectively.The results showed that theoptimal preparation process for curcumin/PLGA magnetic microspheres was the stirring homogenization two-step emulsificationmethod,with a high-speed homogenization speed of 15 000 r/min,a water oil phase volume ratio of 10 1,a PLGA dosage of100 mg,a water phase PVA mass fraction of 1%,the Fe3O4OA dosage of 40 mg and the dosage of 10 mg curcumin.Underthese conditions,the surface of the microspheres was smooth,the particle size was homogeneous,the polydispersity index(PDI)was 0.38,the average particle size was 3.60 m,the magnetic induction strength of the microspheres was 14.12(A m2)/kg,and the magnetic content was about 27.98%.The encapsulation rate of drug-laden microspheres was 97.09%,and the drugloading was 6.40%,which showed a significant sustained release effect in the in vitro release assay.Key word:curcumin;polylactic acid/glycolic acid;oleic acid modified ferric oxide;magnetic microspheres96 林 产 化 学 与 工 业第 43 卷姜黄素是从姜黄属植物根茎中提取出来的天然活性成分,具有抗肿瘤、抗菌、消炎、抗病毒、促进伤口愈合等多种药用功效1-3。但是,姜黄素有水溶性和稳定性差的缺点,为达到治疗效果需多次给药,临床应用受限4。将姜黄素包裹在微球5、纳米粒6、脂质体7中,可以提高其稳定性,增强生物利用度。磁性微球作为一种靶向给药技术引起了人们的关注,通过施加外磁场,药物缓释磁性微球集中于靶器官,可缓慢释药,降低毒副作用8。金鑫等9采用乳化-溶剂挥发法制备了地塞米松聚乳酸/羟基乙酸(PLGA)磁性微球并对其形貌及体外释放性能进行表征,结果显示:该微球缓释时间长、磁响应较好、生物相容性良好,但是,该方法制备的微球粒径不均一。谌亮等10采用三相微流控技术制备了 PLGA 微球,其粒径分布较窄,球形圆整度极好,计算得到的离散系数(CV)为 3.83%,分散性良好。任平伟等11采用膜乳化法和微流控法 2 种乳化技术制备出单分散水包油(W/O)乳液,乳液粒径的 CV 分别为10.60%和 3.90%,均表现出良好的单分散性。但是,文献报道的工艺均需要特定的设备,制备过程复杂,难以实现规模化生产。本研究采用搅拌-均质两步乳化法制备姜黄素/PLGA 磁性微球,即先在低速搅拌分散后、再用高速均质乳化,而后将溶剂挥发制得磁性微球。通过改变制备条件来优化微球形态、粒径分布及其载药量、包封率,得到姜黄素/PLGA 磁性微球的较优工艺。1 实 验1.1 材料与仪器聚乳酸/羟基乙酸(PLGA)共聚物,重均相对分子质量(Mw)约 44 000,济南岱罡生物工程有限公司;姜黄素(质量分数 98%),百灵威科技有限公司;油酸(OA,质量分数 90%),西格玛试剂;FeCl36H2O(质量分数 99%)、FeCl24H2O(质量分数 98%),上海麦克林生化科技有限公司;聚乙烯醇(PVA),Mw约27 000,罗恩试剂;磷酸盐缓冲溶液(PBS),0.01 mol/L,北京雷根生物技术有限公司。NH3 H2O、HClO4、二氯甲烷(DCM)、无水乙醇、无水甲醇,均为分析纯;所用水均为去离子水。LW300-28CT 光学显微镜;FSH-2A 高速均质机,金坛区西城新瑞仪器厂;UV759CRT 型紫外分光光度计,上海佑科有限公司;Mastersizer3000 马尔文激光粒度仪,马尔文仪器公司;7404 型振动样品磁强计,美国 LakeShore 公司;Riga Ku TG-DTA8122 热重分析仪,日本理学公司。1.2 姜黄素/PLGA 磁性微球的制备1.2.1 Fe3O4OA 的合成 参考文献12的方法,将1.07 g(5.3 mmol)的 FeCl2 4H2O 和2.86 g(10.6 mmol)的 FeCl3 6H2O 按物质的量比 12 加入 30 mL 水中,搅拌溶解,通氮除氧 30 min,升温至 60。在快速搅拌下加入 NH3 H2O 调 pH 值至 9,当体系变为黑色后,滴加 1.4 mL 的油酸,恒温保持 10 min,随后升温至 90,继续搅拌反应30 min。然后降至室温,加入2 mol/L 的 HClO4调 pH 值至4,将黑色沉淀通过磁场分离进行洗涤,制备得到油酸改性 Fe3O4(Fe3O4OA)磁性纳米颗粒(粒径 8 nm),保存在乙醇中备用。1.2.2 PLGA 磁性微球负载姜黄素 称取适量 PVA 溶于 PBS 溶液(pH 值为 7.4)中,充分溶解后得到一定质量分数的 PVA 溶液,后续作为水相使用。称取一定量的 PLGA、Fe3O4OA、姜黄素溶于 1 mL 二氯甲烷/甲醇(体积比 91)混合溶剂中,作为油相。在 160 r/min 搅拌下将油相滴加到 PVA 溶液中,搅拌 3 min,得到初乳液,而后迅速取出,再高速均质 3 min,得到终乳液。将终乳液在 600 r/min 下搅拌2 h,挥发有机溶剂,得到固化微球。最后 3 000 r/min 离心,用去离子水洗涤,冷冻干燥得到姜黄素/PLGA 磁性微球。在合成过程中不添加 Fe3O4OA 纳米颗粒和姜黄素得到搅拌-均质 PLGA 空白微球,仅添加 Fe3O4OA 制备 PLGA 磁性微球。1.2.3 直接均质法制备 PLGA 空白微球 称取一定量的 PLGA 溶于1 mL 二氯甲烷/甲醇(体积比91)混合溶剂中,作为油相。将油相直接滴入到一定体积的 PVA 溶液(水相)中,置于均质机高速均质分散,得到终乳液。将终乳液 600 r/min 搅拌2 h,挥发有机溶剂,得到固化微球。最后3 000 r/min 离心,用去离子水洗涤,冷冻干燥得到均质 PLGA 空白微球。第 5 期李桂芳,等:聚乳酸/羟基乙酸磁性微球的制备及其姜黄素负载97 1.3 微球载药性能1.3.1 姜黄素标准曲线的建立 精密称取姜黄素标准品 10 mg,与10 mL 甲醇配制成1.00 g/L 的姜黄素甲醇溶液,然后分别稀释成质量浓度为 0.05、0.10、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00、3.00 mg/L 的系列标准溶液。利用紫外分光光度计测定不同质量浓度的姜黄素标准溶液在特定吸收波长处的吸光度(A),做 3 次实验,取平均值。通过全波长扫描法确定姜黄素的最大吸收波长在 432 nm 处,并对其标准溶液进行吸光度测定,得到质量浓度(C)与吸光度(A)的回归方程 A=0.295 8C+0.008 5,R2=0.999 7(线性范围:0.05 3.00 mg/L)。1.3.2 微球载药率与包封率 精密称量姜黄素/PLGA 磁性微球 10 mg,加入二氯甲烷/无水甲醇(体积比为 124)混合溶液破乳溶解,外加磁场作用下静置沉淀,在波长 432 nm 处测定上清液的吸光度,根据标准曲线计算药物质量,根据式(1)、(2)计算包封率(EE)、载药率(DL):EE=m1/m2 100%(1)DL=m1/m3 100%(2)式中:m1包封的姜黄素质量,mg;m2微球中姜黄素的总质量,mg;m3姜黄素微球的总质量,mg。1.3.3 微球的体外释放 精确称量冻干后的载药磁性微球 20 mg,溶于5 mL 不同 pH 值的 PBS 缓冲液中,而后移入截留分子质量(MWCO)为3 500 u 的透析袋中,浸泡在45 mL 相应 pH 值的 PBS 缓冲液中,在摇床中恒温(37,150 r/min)振荡。定时取出上清液 1 mL,并补充 PBS 缓冲液 1 mL,在 432 nm 波长处测定上清液吸光度,按式(3)计算药物累积释放率(Q)。Q=(Cn+Cn-1+Cn-2+C1)V/(m DL)100%(3)式中:Cn各时间点测得的药物质量浓度,mg/L;V释放介质的体积,mL;m微球的质量,mg。1.4 分析表征1.4.1 形貌分析 取 1 滴姜黄素/PLGA 磁性微球溶液滴于载玻片上,通过光学显微镜观察其形貌,并通过 Image J 软件测量微球的粒径大小。1.4.2 磁感应强度称取一定量的 Fe3O4 OA 和姜黄素/PLGA 磁性微球,利用振动样品磁强计(VSM)对 Fe3O4 OA 和姜黄素/PLGA 磁性微球进行磁性能分析。1.4.3 热重分析 控制热重分析条件为:氮气气氛,25 650,升温速度为 10 /min。热重分析检测后剩余的质量为微球中所含的 Fe3O4的质量,按式(4)计算 Fe3O4在 Fe3O4OA 中的质量分数,从而得到 Fe3O4OA 与姜黄素/PLGA 磁性微球的质量比值,即可视为微球的含磁量。=(1-m失/m总)100%(4)式中:Fe3O4占 Fe3O4OA 的质量分数,%;m失Fe3O4OA 纳米颗粒分解的质量,mg;m总Fe3O4OA纳米颗粒的质量,mg。a.搅拌-均质 stirring-homogenization;b.直接均质 direct homogenization图 1 不同乳化方法制备的 PLGA 空白微球的光学显微镜照片Fig.1 Optical microscopic photos of PLGA blank microsphereswith different emulsification methods2 结果与讨论2.1 姜黄素/PLGA 磁性微球制备工艺探讨2.1.1乳化方法的影响乳化方法是影响微球均一性的重要因素,选择合适的乳化方法可以制备粒径均一的微球。采用直接均质法和搅拌-均质两步乳化法制备 PLGA 空白微球,通过二者的显微镜图对比,如图 1 所示,可以发现采用搅拌-均质两步乳化法制备的微球比较均一,平均粒径为(2.10 0.34)m。这主要是因为第一步低速搅拌时获得了乳滴粒径较大且不均一的初乳液,然后再将初乳液高速均质时,大的乳滴更容易破碎变98 林 产 化 学 与 工 业第 43 卷小,经溶剂挥发后便获得了粒径较均一的乳滴和微球。因此,后续实验采用搅拌-均质两步乳化法制球。2.1.2 高速均质速度的影响 均质速度是影响微球粒径大小的直接因素,分别控制高速均质速度为9 000、12 000、15 000 和18 000 r/min,研究其对微球粒径及分布的影响,结果见图2(a)。由图可知,随着均质速度的增加,微球的粒径逐渐减小。当高速均质速度为15 000 和18 000 r/min 时,微球均表现出较小的粒径和较好的均一性,粒径分别为(2.10 0.35)m 和(1.90 0.31)m,出于安全及能耗的考虑,故选择 15 000 r/min 进行后续的实验。a.高速均质速度 high speed homogenization speed;b.水油相体积比 volume ratio of water to oil phase;c.PLGA 用量 PLGA dosage;d.PVA 质量分数 PVA mass fraction;e.Fe3O4OA 用量 Fe3O4OA dosage;f.姜黄素用量 curcumin dosage图 2 不同条件对微球粒径的影响Fig.2 Effect of different conditions on the particle size of microspheres2.1.3 水油相体积比的影响 水油比是乳液稳定性和分散性的决定因素,水的比例越大,液滴之间的间距越大,不易发生吞并现象,且整个乳液体系的黏度降低,乳滴更容易被打散,从而获得粒径更小的乳滴。分别控制水油体积比为 51、101、151 和201,油相体积为1 mL,研究其对微球粒径大小及均一性的影响,结果见图2(b)。从图2(b)可以看出,水油比值为5 时,微球粒径相对较大,随着水油比的增加,粒径较小的微球越来越多,当水油比值为 10 时,粒径(2.20 0.35)m,粒径分布相对均一,故采用水油比 101 进行后续实验。2.1.4 PLGA 用量的影响 PLGA 的用量决定了油相的黏度,油相黏度增加,对流减小,可以制备更加均一的微球。考察了60、80、100 和120 mg 的 PLGA 用量对微球粒径及均一性的影响,结果见图2(c)。随 PLGA 用量的增加,微球粒径增大。当 PLGA 用量为 100 mg 时,粒径(2.10 0.32)m,微球的粒径分布较为均一,故选择 100 mg PLGA 用量进行后续实验。2.1.5 水相 PVA 质量分数的影响 PVA 作为一种表面活性剂,可以使油水相界面更加稳定,从而影响微球的粒径13。考察了 0.5%、1.0%、2.0%和 3.0%的水相 PVA 质量分数对微球粒径大小及分布的影响,结果见图 2(d)。随水相质量分数的增加,微球粒径反而减小,当 PVA 的质量分数为 1.0%时,粒径(1.70 0.29)m,微球的粒径相对均一,故选择 1.0%的水相质量分数进行后续实验。2.1.6 Fe3O4OA 用量的影响Fe3O4OA 纳米颗粒作为一种磁性功能材料,可以赋予微球靶向性。考察了 20、30、40 和 50 mg 的 Fe3O4OA 用量对微球的粒径及均一性的影响,结果见图 2(e)。随着Fe3O4OA用量的增多,微球的粒径逐渐增大,这主要是因为微球中的磁性纳米颗粒存在相互作用。当Fe3O4OA 的用量为40 mg 时微球粒径分布较为均一,粒径为(3.40 0.40)m,故选择40 mg 的 Fe3O4OA第 5 期李桂芳,等:聚乳酸/羟基乙酸磁性微球的制备及其姜黄素负载99 加入量进行后续实验。图 3 姜黄素用量对微球载药性能的影响Fig.3 Effect of curcumin dosage on drugloading performance2.1.7 姜黄素用量的影响姜黄素的用量直接影响了载药磁性微球的载药量和包封率,考察了 5.1、8.1、10.0 和 13.0 mg 的姜黄素用量对载药磁性微球的影响。姜黄素的加入对微球的粒径影响不大,平均粒径均约为 3.00 m,如图 2(f)所示。但随着姜黄素的加入量增加,微球的载药量逐渐增加,包封率先增加后降低,如图 3 所示。这主要是因为载体材料 PLGA 对药物的包封能力有限,当超过限度,包封率会出现下降的趋势。当姜黄素加入量为10.0 mg 时包封率最高,故选择较优条件为10.0 mg的姜黄素加入量。综上,制备微球的最优工艺条件为:选用搅拌-均质两步乳化法,高速均质转速为 15 000 r/min,水油相体积比为 101,PLGA 用量为 100 mg,PVA 的质量分数为 1%,Fe3O4OA的用量为 40 mg,姜黄素的用量为 10 mg,此条件下制得的微球包封率为 97.09%,载药率为 6.40%。2.2 姜黄素/PLGA 磁性微球的理化性能2.2.1 形貌分析 按照上述最优条件制备姜黄素/PLGA 磁性微球,显微镜下观察到该微球表面光滑,粒径分布较为均一,如图 4(a)和(b)所示。采用 Image J 软件测量微球粒径为(3.50 0.56)m,通过激光粒度仪测得平均粒径为 3.60 m,粒径分布较窄,多分散性指数(PDI)为 0.38。图 4 姜黄素/PLGA 磁性微球的光学显微镜照片(a)、粒径分布(b)及磁滞曲线(c)Fig.4 Photo of optical microscope(a),particle size distribution(b)and hysteresis curves(c)ofcurcumin/PLGA magnetic microspheresa.0 min;b.1 min;c.3 min图 5 姜黄素/PLGA 磁性微球的磁吸附效果Fig.5 Magnetic adsorption effect of curcumin/PLGAmagnetic microspheres2.2.2磁感应强度图 4(c)为 Fe3O4OA 和姜黄素/PLGA 磁性微球在 298.15 K 下的磁滞曲线。由图可知,与 Fe3O4 OA 的饱和磁化强度(68.69 A m2/kg)相比,姜黄素/PLGA 磁性微球(14.12 A m2/kg)明显下降。主要原因是聚合物对 Fe3O4OA 的包覆,PLGA 包覆层减弱了 Fe3O4OA 纳米颗粒之间的相互作用,从而降低了聚合物磁性微球的饱和磁化强度,但是从图 5 可以看出目前的磁化强度仍然可以实现对微球的磁控。2.2.3 热重分析 根据文献14报道,通过热重分析可以测定磁性微球中 Fe3O4OA 的质量分数。控制热重分析条件为氮气气氛,25 650,升温100 林 产 化 学 与 工 业第 43 卷速率为 10 /min。图 6 为 Fe3O4OA、姜黄素/PLGA 微球和姜黄素/PLGA 磁性微球的 TG 曲线。由图可知,随着温度的上升,样品逐渐失重。姜黄素/PLGA 微球从 250 开始失重,当温度达到 350 时几乎完全分解。Fe3O4 OA 纳米颗粒从160 开始失重,此阶段为油酸的分解,当温度达到400 时趋于平衡,剩余的物质为 Fe3O4。通过式(4)计算得到,Fe3O4OA 纳米颗粒中油酸的质量分数约为 11.88%,Fe3O4的质量分数约为 88.12%。姜黄素/PLGA 磁性微球从 250 开始失重,约 300 时趋于平衡,此时体系中有机物几乎完全分解,所剩质量为Fe3O4的质量,根据式(4)可以计算得到Fe3O4OA 纳米颗粒的质量(2.21 mg),Fe3O4 OA 纳米颗粒占姜黄素/PLGA 磁性微球(7.90 mg)的质量分数即为磁性微球含磁量,约为 27.98%。2.3 姜黄素/PLGA 磁性微球的体外释放模拟人体正常生理环境及肿瘤外微环境的释药情况,释放结果如图 7 所示。图 6 不同样品的热重分析Fig.6 Thermogravimetric analysis ofdifferent sample 图 7 姜黄素/PLGA 磁性微球的体外释放曲线Fig.7 In vitro release curves of PLGAmagnetic microspheres of curcumin由于肿瘤细胞增殖速度很快,其无氧呼吸代谢产生乳酸等酸性物质,导致其内外环境 pH 值降低15-16。血液等正常体液环境的 pH 值为 7.4,肿瘤细胞外微环境的 pH 值范围为 6.5 7.2,肿瘤细胞内环境的 pH 值范围为 4 615。姜黄素/PLGA 磁性微球作为一种注射制剂,存在环境主要是人体体液及肿瘤外微环境,因此,实验选用最优工艺条件制备微球在 pH 值 7.4 和 6.5 条件下进行药物体外释放。在药物释放的初期(1 h 内),释药率分别为 4.53%和 1.38%,未出现突释现象,说明微球对药物的包裹性好,且微球表面吸附的药物量较少。释放 168 h 后,药物累计释放率分别达到了 40.66%(pH 值7.4)和 80.75%(pH 值 6.5),表明姜黄素/PLGA 磁性微球在酸性环境下比中性环境下释放更快,这主要是因为在酸性条件下 PLGA 的酯键更容易断裂,降解速率更快16。分析在 pH 值 7.4 条件下的释放曲线可知,释放 408 h 后,曲线平缓,说明该微球缓慢释放药物,有明显的缓释效果。3 结 论3.1 创新采用搅拌-均质两步乳化法制备姜黄素/PLGA 磁性微球,通过单因素试验优化得到的最优制备条件为高速均质转速为 15 000 r/min,水油相体积比为 10 1,PLGA 用量为 100 mg,PVA 的质量分数为 1%,Fe3O4OA 的用量为40 mg,姜黄素的用量为10 mg。此条件下制备的姜黄素/PLGA 磁性微球粒径相对较小,约为 3.60 m,分布较为均一,PDI 达到 0.38,包封药物的能力较强,包封率可以达到97.09%,且具有超顺磁性(含磁量约为 27.98%)。可通过磁控靶向肿瘤组织,实现药物在病灶部位的富集。该方法只需要采用常规设备,操作简单且易于批量制备。3.2 体外释放结果证明姜黄素/PLGA 磁性微球具有明显的缓释功能,释药 168 h 后,药物累计释放率分别达到 40.66%(pH 值 7.4)和 80.75%(pH 值 6.5),在药物递送系统方面具有极大的潜能。第 5 期李桂芳,等:聚乳酸/羟基乙酸磁性微球的制备及其姜黄素负载101 参考文献:1SANTANA W,CAETANO B L,ANNUNZIO S,et al.Conjugation of superparamagnetic iron oxide nanoparticles and curcumin photosensitizer toassist in photodynamic therapyJ/OL.Colloids and Surfaces B:Biointerfaces,2020,196:1112972022-03-17.https:doi.org/10.1016/j.colsurfb.2020.111297.2CALDAS B S,NUNES C S,PANICE M R,et al.Manufacturing micro/nano chitosan/chondroitin sulfate curcumin-loaded hydrogel in ionicliquid:A new biomaterial effective against cancer cellsJ.International Journal of Biological Macromolecules,2021,180:88-96.3SAHEBKAR A,CICERO A F G,SIMENTAL-MENDIA L E,et al.Curcumin downregulates human tumor necrosis factor-levels:A systematicreview and meta-analysis of randomized controlled 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