肝纯片对睡眠剥夺致肝损伤大鼠的影响.pdf

医药前沿 2024年4月 第14卷第11期 综合医学 119肝纯片对睡眠剥夺致肝损伤大鼠的影响王晨萱，余婧婷，詹 扬，孙登龙，程小英（江中药业股份有限公司 江西 南昌 330103）【摘要】目的：探讨肝纯片对睡眠剥夺致肝损伤的影响。方法：选取 40 只雄性 Wistar 大鼠，适应性饲养 1 周后，将大鼠随机分为正常对照组、模型组、低剂量肝纯片干预组（120 mg/kg）；高剂量肝纯片干预组（240 mg/kg）各 10 只。所有大鼠放入多平台水环境睡眠剥夺箱，构建睡眠剥夺致肝损伤模型，每隔 1 天大鼠进行称重，计算大鼠的肝比重，检测反映肝功能的指标，评价大鼠的肝脏组织学变化。结果：对照组大鼠体重随着时间逐渐升高，模型组和肝纯片干预组的大鼠体重低于正常对照组，差异有统计学意义（P 0.05）；肝纯片干预组大鼠的体重与模型组比较，差异无统计学意义（P 0.05）。对照组大鼠体重随着时间逐渐升高，模型组和肝纯片干预组的大鼠体重低于正常对照组，差异有统计学意义（P 0.05）；肝纯片干预组大鼠的体重与模型组比较，差异无统计学意义（P 0.05），见图（a）。干预后，模型组的肝比重高于对照组、低剂量肝纯片干预组、高剂量肝纯片干预组，差异有统计学意义（P 0.05）。肝纯片干预 9、16、21 d，模型组的 ALT 和 AST 水平均高于对照组，差异有统计学意义（P 0.05）。其中，干预 9、16 d 时，高、低剂量肝纯片组的 ALT 和 AST 水平低于模型组，但两两比较，差异无统计学意义（P 0.05）。干预 21 d 时，高、低剂量肝纯片组的 ALT 和 AST 水平高于模型组，但两两比较，差异无统计学意义（P 0.05）。干预后 16 d,TP 含量随着睡眠剥夺的处理而降低，提示肝脏蛋白质合成功能的下降。干预后，高、低剂量肝纯片组的 TP 含量高于模型组，差异有统计学意义（P 0.05）。干预后 21 d，模型组的 TP 含量低于对照组，差异有统计学意义（P 0.05）。干预后 21 d，模型组大鼠血清中的 ALP 水平显著升高，但高、低剂量肝纯片组的 ALP 水平与模型组比较，差异无统计学意义（P 0.05）。H&E 染色结果显示肝纯片能够有效保护肝细胞免遭损伤。结论：肝纯片在造模和干预 16 d 时具有一定的改善剥夺睡眠致肝损伤的效果。【关键词】肝损伤；睡眠剥夺；肝纯片；大鼠；肝保护效果【中图分类号】R338.63【文献标识码】A【文章编号】2095-1752（2024）11-0119-05睡眠剥夺即由于环境或个体原因而无法获得足够的不受干扰的夜间睡眠1。目前，关于 SD 引发的全身异常机制尚不明确，但有研究者提出剥夺睡眠可能会增加能量消耗并加剧代谢活动2。基于现代社会压力大，由于各种生活及工作上的原因，人们的睡眠时间受到严重剥夺，对个体健康以及生命安全可造成严重不良影响3。本研究将采用大鼠剥夺睡眠模型模拟人类睡眠不足的社会现象，从而探讨 SD 对大鼠肝功能、氧化应激的影响，同时针对肝纯片 SD 诱导肝损伤的保护作用进行分析，现报道如下。1 资料与方法1.1 材料（1）实验试剂及仪器：显齿蛇葡萄提取物（由江中药业固体车间提供），自制水平台站立剥夺睡眠设施。（2）实验动物：雄性 Wistar 大鼠（9 周龄，300 350 g）共计 40 只，由江苏集萃药康生物科技股份有限公司提供，许可证号为 SCXK（苏）2018-0008。将所有大鼠置于（242）的受控温度下，相对湿度 45%65%；12 h 的光照/黑暗循环，并在整个实验过程中大鼠自由获取食物和水。本次试验由本单位动物实验伦理委员会审核并批准（批号：20230719）。1.2 方法1.2.1 实验分组及给药 适应性饲养 1 周后，将大鼠随机分为正常对照组、模型组、低剂量肝纯片干预组（120 mg/kg）、高剂量肝纯片干预组（240 mg/kg）各10只。按上述剂量以 20 mg/kg 的剂量灌胃给药，1 次/d，连续给药 21 d。1.2.2 多平台水环境睡眠剥夺模型的建立 将模型组、肝纯片低剂量、高剂量给药组大鼠放入放置于88 cm117 cm60 cm 的多平台水环境睡眠剥夺箱。箱内放置18个直径6.3 cm、高8 cm的圆形平台，实验期间，水箱内装水至水面到平台以下 2 cm 处，各实验组大鼠被放置在不同的平台上，当大鼠进入快速眼动睡眠时，肌肉张力会丧失，大鼠出现点头或者掉落情况，在接触水面后惊醒从而达到睡眠剥夺的目的。将各实验组大鼠通过水平台站立，每日剥夺睡眠22 h，睡眠 2 h（14:0016:00）。正常对照组大鼠被放入未装水的环境对照箱平台上（大鼠可在平台上自由睡觉），其他实验条件与实验组相同，实验流程见图 1，实验持续 21 d。图 1 水平台站立剥夺睡眠流程120 医药前沿 2024年4月 第14卷第11期 综合医学1.2.3 体重与肝重测量 每日测量并记录大鼠体重，睡眠剥夺实验结束后取大鼠肝组织，称重并记录肝重。1.2.4 血清生化指标检测 谷丙转氨酶（Alanine aminotransferase,ALT）主要存在于各种细胞中，尤以肝细胞为最，整个肝脏内转氨酶含量约为血中含量的100 倍3。只要有 1%的肝细胞坏死，ALT 就会释放入血，便可使血中酶活性增高 1 倍，因此转氨酶（尤其是ALT）是肝细胞损害的敏感标志。谷草转氨酶（Aspartate aminotransferase,AST）主要分布在心肌，其次是肝脏、骨骼肌和肾脏等组织中4。正常时血清中的 AST 含量较低，但相应细胞受损时，细胞膜通透性增加，胞浆内的 AST 释放入血，故其血清浓度可升高，AST/ALT大于 1 时，提示有肝实质的广泛损害，预后不良。蛋白质合成是健康肝脏最重要的功能之一，总蛋白（total protein,TP）水平可用于区分正常肝脏和受损肝脏。总胆红素（Total bilirubin,TBIL）是直接胆红素和间接胆红素的总和。血清总胆红素的测定是肝功能检查中的一项重要检测项目5。能准确地反映黄疸的程度。结果显示，各组大鼠的血清 TBIL 水平没有明显变化，可能是由于睡眠剥夺导致的肝损伤没有达到发生黄疸，影响胆红素分泌的程度。碱性磷酸酶（Alkaline phosphatase,ALP）以游离的形式存在于人体的肝脏、小肠以及骨骼中，在碱性环境中能水解磷酸酯产生磷酸。人体的血清中大部分 ALP 来源于肝脏，因此 ALP 常被作为检测肝脏疾病的指标之一。在睡眠剥夺实验过程中，分别在肝纯片干预第 9、16 及 21 d，通过大鼠眼眶取血，通过离心（3 000g，10 min）收集血清样品，储存在 80。根据适当的试剂盒方案分析 ALT、AST、TP、ALP 含量。1.2.5 染色 睡眠剥夺实验结束后，通过颈椎脱臼法将各组大鼠处死，从腹腔中取出肝脏，选择肝脏的左叶进行病理切片检查。取部分左叶肝组织，固定在 10%磷酸盐缓冲盐水缓冲福尔马林中，24 h 以上，后进行石蜡包埋处理。将石蜡包埋的肝组织切成 4 m 厚的肝组织切片，使用苏木精-伊红染色法处理后用显微镜观察组织病理学变化。1.3 统计学方法通过 GraphPad Prism 8.0 统计软件分析数据，计量资料表达方式为（x s），实施 t 检验，采用单因素方差（One-way ANOVA）分析，以 Dunnet 法作组间两两比较，P 0.05 表示差异有统计学意义。2 结果2.1 大鼠体重及肝重变化图 2a 显示，对照组大鼠体重随着时间逐渐升高，21 d 后逐渐达到平台稳定期，相比与对照组，造模 5 d后大鼠的体重均降低，提示造模影响大鼠健康；相比于模型组，肝纯片给药有提升体重的趋势，但始终维持在200 g 左右，各组之间差异无统计学意义（P 0.05）。图 2b 为各组大鼠的肝重比变化，相比于对照组，模型组大鼠的肝重比升高（P 0.01）；相比于模型组，高、低剂量肝纯片给药后大鼠的肝重比降低（P 0.01）。结果表明，睡眠剥夺大鼠存在肝损伤情况，且提示肝纯片给药后可减轻大鼠肝损伤情况。时间 0 5 10 15 20 25 d对照组模型组低质量组高质量组400350300250200150体重/g（a）86420 对照组 模型组 低质量组 高质量组肝重比/%（b）注：（a）各组大鼠体重变化图；（b）各组大鼠肝重变化图。肝重比变化（模型组vs.对照组，#P0.1，#P0.05；给药组vs.模型组，*P0.05）。2.2 血清转氨酶水平变化肝纯片干预 9、16、21 d，模型组的 ALT 和 AST 水平均高于对照组，差异有统计学意义（P 0.05）。其中，干预 9、16 d 时，高、低剂量肝纯片组的 ALT 和AST 水平低于模型组，但两两比较，差异无统计学意义（P 0.05）。干预 21 d 时，高、低剂量肝纯片组的ALT 和 AST 水平高于模型组，但两两比较，差异无统计医药前沿 2024年4月 第14卷第11期 综合医学 121学意义（P 0.05）。见图 3。2.3 其他肝功能生化指标变化实验数据显示，干预后 16 d，TP 含量随着睡眠剥夺的处理而降低。干预后，高、低剂量肝纯片组的 TP 含量高于模型组，其中低剂量肝纯片改善效果最佳。干预后21 d，模型组的 TP 含量低于对照组，差异有统计学意义（P 0.05）。肝纯片干预后，TP 含量有所升高，但无显著差异。干预后 21 d，模型组大鼠血清中的 ALP 水平显著升高，但高、低剂量肝纯片组的 ALP 水平与模型组比较，差异无统计学意义（P 0.05）。见图 4。80604020020015010050020015010050040030020010003002001000100500 对照组 模型组 低质量组 高质量组 对照组 模型组 低质量组 高质量组 对照组 模型组 低质量组 高质量组 对照组 模型组 低质量组 高质量组 对照组 模型组 低质量组 高质量组 对照组 模型组 低质量组 高质量组ALT/（UL1）AST/（UL1）AST/（UL1）AST/（UL1）ALT/（UL1）ALT/（UL1）（a）（d）（b）（e）（c）（f）注：（a）肝纯片给药干预第 9 天血清 ALT 水平；（b）肝纯片给药干预第 16 天血清 ALT 水平；（c）肝纯片给药干预第 21 天血清 ALT 水平；（d）肝纯片给药干预第9天血清AST水平；（e）肝纯片给药干预第16天血清AST水平；（f）肝纯片给药干预第21天血清AST水平（模型组vs.对照组，#P0.01，#P0.05；给药组 vs.模型组，*P 0.05）。图 3 血清转氨酶水平变化图（a）（b）（c）（d）40302010070605040706050408006004002000 对照组 模型组 低质量组 高质量组 对照组 模型组 低质量组 高质量组 对照组 模型组 低质量组 高质量组 对照组 模型组 低质量组 高质量组TP/（gL1）TP/（gL1）ALP/（gL1）T-Bil/（molL1）注：（a）肝纯片给药干预后第 16 天的血清 TP 水平；（b）肝纯片给药干预后第 21 天的血清 TP 水平；（c）肝纯片给药干预后第 16 天的血清 TBIL 水平；（d）肝纯片给药干预后第 21 天的血清 ALP 水平（模型组 vs.对照组，#P 0.01，#P 0.05；给药组 vs.模型组，*P 0.05）。图 4 各组大鼠生化指标变化图122 医药前沿 2024年4月 第14卷第11期 综合医学2.4 HE 染色为了进一步观察肝脏损伤情况，将各组大鼠肝脏进行 HE 染色。正常组肝脏结构清晰，肝窦排列规整，细胞形态正常，而模型组肝细胞严重肿胀，胞质疏松呈网状，大部分肝细胞均发生气球样变，细胞坏死严重；相比于模型组，高剂量组的肝细胞水肿明显减少，出现轻微坏死。而低剂量组的肝细胞排列整齐，仅少量肝细胞出现轻微的水肿。结果表明，肝纯片能够有效保护肝细胞免遭损伤，其中低剂量给药组的改善效果最佳，这与血清 ALT和 AST 的结果一致。见图 5。图 5 各组大鼠肝脏 HE 染色3 讨论作为生命的必不可少的重要过程，睡眠为机体复原的重要过程，对于维持机体健康能够发挥重要作用4。但是随着生活压力和工作压力不断加重，生活节奏日益加快，熬夜人群占比不断增加，甚至成为部分人群的生活常态，严重损害其生命健康，可导致机体重要脏器功能受损。睡眠剥夺属于强烈应激源，可导致机体受损并生成各种应激反应，导致器官受损。肝脏中线粒体丰富，而由线粒体生成的 ATP 为活性氧的主要来源，睡眠剥脱可引发氧化应激反应，机体启动应激状态后体内氮自由基与活性氧自由基增加，受氧化应激状态影响，机体氧化系统与抗氧化系统出现紊乱，分泌大量活性物质，使医药前沿 2024年4月 第14卷第11期 综合医学 123得机体内分泌系统与免疫系统平衡受损5-6。中医认为肝内魂之居、将军之官，主疏泄及藏血，可调畅气机、安神养魂。肝纯片主要成分包括显齿蛇葡萄糖提取物、硬脂酸酶、交联羧甲基纤维素钠以及微晶纤维素等，可对化学性肝损伤发挥辅助性保护作用；有效清除肝脏脂肪、毒素以及代谢垃圾，有利于循环通畅恢复；有效修复受损细胞，促进肝细胞生长，还可保护肝细胞；通过形成保护层的方式避免肝细胞受损，使病毒活动能量获得化解，促进肝功能恢复；使转氨酶下降及黄疸消除，有利于肝功能恢复；使细胞免疫力得到显著提高，有助于增强肝脏抵御侵害能力及自我修复能力7-8。本研究采用水平台站立剥夺大鼠睡眠，从而导致肝损伤，同时给予高、低剂量显齿蛇葡萄提取物干预，通过检测大鼠的血清生化指标和 H&E 染色以判断大鼠的肝脏损伤程度和显齿蛇葡萄提取物干预的影响9-10。本研究结果显示，对照组大鼠体重随着时间逐渐升高，模型组和肝纯片干预组的大鼠体重低于正常对照组（P 0.05）。干预后，模型组的肝比重高于对照组、低剂量肝纯片干预组、高剂量肝纯片干预组（P 0.05）。提示肝纯片可能具有一定的改善睡眠剥夺致肝损伤的效果。干预后 16 d，TP 含量随着睡眠剥夺的处理而降低，提示肝脏蛋白质合成功能的下降。干预后，高、低剂量肝纯片组的 TP 含量高于模型组，其中低剂量肝纯片改善效果最佳。干预后 21 d，模型组的 TP 含量低于对照组（P 0.05）。说明此时的模大鼠仍处于肝损伤状态，肝纯片干预后，TP 含量有所升高，但无显著差异。干预后 21 d，模型组大鼠血清中的 ALP 水平显著升高，但高、低剂量肝纯片组的 ALP 水平与模型组比较，差异无统计学意义（P 0.05）。此外，本研究通过 HE 染色进一步检验了研究结果。综上所述，肝纯片可以改善睡眠剥夺造成肝功能以及肝脏异常，改善肝损伤，低剂量肝纯片能够取得最佳的肝脏保护效果。【参考文献】1 HERNNDEZ SANTIAGO K,LPEZ-LPEZ A L,SNCHEZ-MUOZ F,et al.Sleep deprivation induces oxidative stress in the liver and pancreas in young and aging ratsJ.Heliyon,2021,7(3):e06466.2 MCALPINE C S,KISS M G,RATTIK S,et al.Sleep modulates haematopoiesis and protects against atherosclerosisJ.Nature,2019,566(7744):383-387.3 OCALAN B,CAKIR A,KOC C,et al.Uridine treatment prevents REM sleep deprivation-induced learning and memory impairmentJ.Neurosci Res,2019,148:42-48.4 BESEDOVSKY L,LANGE T,HAACK M.The sleep-immune crosstalk in health and diseaseJ.Physiol Rev,2019,99(3):1325-1380.5 YI C.Repair effect and mechanism of skipjack(kat-suwonus pelamis)oligopeptides on liver injury in sleep deprived 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