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姜黄素通过 NLRP3 炎性体信号通路在肺泡巨噬细胞焦亡模型中的作用机制吴启文,姚叶萍(广州医科大学附属第四医院感染科,广东 广州 511300)摘 要 目的:研究姜黄素通过 NLRP3 炎性体信号通路在 LPS/尼日利亚菌素诱导肺泡巨噬细胞焦亡的作用机制。方法:大鼠巨噬细胞系 NR8383,正常复苏后,用含 10%胎牛血清、80%F12K 培养基在 37、5%CO2的条件下培养,每 23 天传代1 次。将对数生长期细胞 NR8383 离心处理,800 r/min,10 min,离心后对细胞进行计数,之后接种于 96 孔板中,每孔接种 2104个细胞,每孔加 100 l 的细胞培养液。接种 12 h 后随机分为空白对照组、姜黄素组、LPS 组、LPS+姜黄素组、LPS+尼日利亚菌素处理组、LPS+尼日利亚菌素+姜黄素处理组,按照程序对细胞进行加样处理,然后置培养板于 37,5%CO2孵箱中培养,3 个重复/组。各组分别加入相应的药物或试剂后,置培养板于 37,5%CO2孵箱中培养。2 h 后加入 CCK-8 进行反应,3 h 后检测各组细胞的 OD 值。加样反应 2 h 后,Western 印迹检测细胞中 NLRP3、GSDMD 等焦亡相关蛋白表达情况。结果:细胞培养在有血清的情况下,与空白组相比,姜黄素提高细胞活力,促进细胞增殖。细胞培养在无血清的情况下,与 LPS 组相比,LPS+姜黄素组降低细胞活力,抑制细胞增殖;同时在无血清的情况下,与 LPS+尼日利亚菌素组比较,LPS+姜黄素+尼日利亚菌素组提高细胞活力,促进细胞增殖。Western 印迹法检测结果显示,与空白对照组比较,姜黄素组细胞的 Caspase-1 升高有点大,NLRP3 略微升高,GSDMD 略下降,由于三个凋亡蛋白趋势不一致,未能能说明姜黄素对于正常细胞会产生什么影响。与 LPS 组比较,姜黄素+LPS 组细胞的 NLRP3、Caspase-1、GSDMD 三个凋亡蛋白均上升,结果提示细胞凋亡更加严重了。与LPS+尼日利亚菌素组比较,LPS+尼日利亚菌素+姜黄素组细胞的 NLRP3、Caspase-1、GSDMD 三个凋亡蛋白均一致下降,而且下降幅度较大,结果提示在这个模型的条件下,姜黄素有抑制细胞凋亡的作用。结论:综合细胞增殖率和 Western 印迹检测结果,姜黄素可能具有促进 LPS 诱导的细胞凋亡的作用,但对 LPS 和尼日利亚菌素诱导的细胞凋亡显示出一定的抑制作用。关键词 姜黄素;NLRP3;细胞焦亡;巨噬细胞基金项目:广州市科技计划项目项目编号:202102080578通讯作者:姚叶萍 急性肺损伤是由感染、创伤等多种原因引起的肺部急性严重疾病,其中感染是主要因素1。目前有研究发现细胞焦亡参与急性肺损伤过程,其可能机制是由 NLRP3 炎性体信号通路介导2。感染诱导的 ALI 目前抗生素是主要治疗方法,但是由于抗生素的不合理应用,细菌耐药率不断升高,甚至出现超级细菌,引起了高度重视。因此中医药在治疗ALI 方面的彰显治疗价值。研究证实姜黄素在预防及治疗肺损伤中具有一定的保护作用,可减轻 LPS诱导的急性肺损伤小鼠炎性反应,其关键分子靶点可 能 与 THF-1/SMAD、Akt/Erk、MAPK/NF-B、Notch2/Hes-1、TLR4/MyD88/NF-B 等多条信号通路相关3-5。目前关于姜黄素在感染性 ALI 中调控细胞焦亡机制尚未见相关报道。因此,本研究将在LPS/尼日利亚菌素诱导 ALI 细胞模型中研究姜黄素通过阻断 NLRP3 炎性体信号通路抑制细胞焦亡改善 ALI 的作用及机制,旨在为发现姜黄素治疗ALI 的可能性及机制提供试验依据。1 资料与方法1.1 材料1.1.1 细胞:大鼠巨噬细胞系 NR8383,购自中科院上海细胞库。1.1.2 主要试剂:姜黄素购自上海麦克林生化科技有限公司;脂多糖(LPS)购自 Biosharp 公司;F12K培养基购自北京索莱宝生物科技有限公司;胎牛血清购自武汉普诺赛生命科技有限公司);双抗(链霉素+青霉素)购自思拓凡生物科技有限公司;尼日利亚菌素购自麦克林公司;BCA 法蛋白含量检测试剂盒购自南京凯基生物发展有限公司;CCK-8 购自日本同仁化工;NLRP3 抗体(Anti-NLRP3 antibody)、Caspase-1+p10+p12 抗体(Anti-pro Caspase-1+p10+p12 antibody)、GSDMD 抗体(Anti-GSDMD antibody)均购自美国 Abcam 公司;磷酸酶抑制剂购自南京凯基生物发展有限公司,本次研究经过本院医学伦理委员会同意。1.2 方法1.2.1细胞分组及模型建立:大鼠巨噬细胞系NR8383 在含有 10%胎牛血清、80%F12K 培养基中培养,消化传代后接种 12 h 后进行分组,分为空白对照组、姜黄素组、LPS 组、LPS+姜黄素组、LPS+尼日利亚8433吉林医学 2023 年 12 月第 44 卷第 12 期菌素处理组、LPS+尼日利亚菌素+姜黄素处理组,并对细胞进行加药处理,给药方法如下:空白对照组:使用预先加入 10%胎牛血清的 F12K 培养基正常培养,不使用任何药物刺激;姜黄素组:使用预先加入10%胎 牛 血 清 的 F12K 培 养 基 正 常 培 养,加 入10 mol/L 姜黄素进行刺激,2 h 后进行检测。LPS 组:更换无血清培养基 12 h 后,细胞培养基中加入LPS 溶液(终浓度为100 ng/ml),2 h 后进行检测。LPS+姜黄素组:更换无血清培养基 12 h 后,细胞培养基中加入姜黄素(终浓度为 10 mol/L)和 LPS 溶液(终浓度为100 ng/ml)进行刺激,2 h 后进行检测。LPS+尼日利亚菌素处理组:更换无血清培养基 12 h后,细 胞 培 养 基 中 加 入 LPS 溶 液(终 浓 度 为100 ng/ml),4 h 后实验孔加入尼日利亚菌素溶液(终浓度为 10 mol/ml),2 h 后收细胞进行检测。LPS+尼日利亚菌素+姜黄素处理组(3 个重复):更换无血清培养基 12 h 后,细胞培养基中加入姜黄素(终浓度10 mol/L)和 LPS 溶液(终浓度为 100 ng/ml),4 h后实验孔加入尼日利亚菌素溶液(终浓度为10 mol/ml),2 h 后收细胞进行检测。1.2.2 CCK8 法测定各组细胞的活力:大鼠巨噬细胞系 NR8383 细胞,正常复苏后,用含 10%胎牛血清、80%F12K 培养基在 37、5%CO2的条件下培养,每 2 3 天传代 1 次。将 对 数 生 长 期 细 胞NR8383 离心处理,800 r/min,10 min,离心后对细胞进行计数,之后接种于 96 孔板中,每孔接种 2104个细胞,每孔加 100 l 的细胞培养液。接种 12 h 后进行分组,并对细胞进行加药处理,6 个孔/组。各组分别加入相应的药物或试剂后,置培养板于37,5%CO2孵箱中培养 2 h。2 h 后加入 CCK-8 进行反应,3 h 检测各组细胞的 OD 值。1.2.3 Western 印迹法检测细胞中蛋白表达水平:大鼠巨噬细胞系 NR8383 细胞接种在 196 孔培养板内,各组给药 2 h 后弃去培养基,加入裂解液提取细胞内的蛋白,根据蛋白浓度的检测结果将含有 20 l蛋白的样本用于蛋白质印迹检测,依次进行 SDS-PAGE 电泳、电转 PVDF 膜、5%脱脂牛奶封闭、特异性一抗孵育、辣根过氧化物酶二抗孵育,最后在显影系统内采用电化学发光法曝光得到目的 蛋白 NL-RP3、Caspase-1、GSDMD 及内参蛋白的条带,根据条带的灰度值计算蛋白表达水平。1.3统计学方法:所有数据应用 SPSS21.0 软件进行2及 t 检验;计量资料数据方差齐,或数据经转换后方差齐,则采用组间两两比较的单因素方差分析方法;若数据经转换后方差仍不齐,采用秩和检验进行统计分析。百分率的比较采用秩和检验进行统计分析。P0.05 为差异有统计学意义。2 结果2.1姜黄素对 LPS 和尼日利亚菌诱导焦亡细胞增殖率的影响:胞培养在有血清的情况下,与空白组(0.9770.088)相比,姜黄素(1.1110.106)提高细胞活力,促进细胞增殖。细胞培养在无血清的情况下,与 LPS 组(0.7460.026)相比,LPS+姜黄素组(0.6740.036)降低细胞活力,抑制细胞增殖,差异有统计学意义(P0.01);同时在无血清的情况下,与 LPS+尼日利亚菌素组(0.1380.003)相比,LPS+姜黄素+尼日利亚菌素组(0.1440.006)提高细胞活力,差异有统计学意义(P0.05),促进细胞增殖。2.2 Western 印迹检测姜黄素对 LPS 和尼日利亚菌诱导焦亡细胞 NLRP3、GSDMD 蛋白表达情况:与空白对照组比较,姜黄素组细胞的 Caspase-1 略微降低,NLRP3 和 GSDMD 均呈现升高的趋势。与 LPS 组比较,姜黄素+LPS 组细胞的 NLRP3、Caspase-1 两个凋亡蛋白均上升,GSDMD 凋亡蛋白均下降。与 LPS+尼日利亚菌素组比较,LPS+尼日利亚菌素+姜黄素组细胞的 NLRP3、Caspase-1、GSDMD 三个凋亡蛋白均一致下降,而且下降幅度较大,提示在这个模型的条件下,姜黄素有抑制细胞凋亡的作用。见图 1。图 2 Western 印迹法检测 NLRP3、Caspase-1 和GSDMD 蛋白在细胞中的表达9433吉林医学 2023 年 12 月第 44 卷第 12 期3 讨论 ALI 是常见的临床危及重症,关于 ALI 的发病机制以及治疗 ALI 是目前医学领域的研究热点。感染是 ALI 常见的发生因素,其中内毒素脂多糖是重要因素之一。研究发现,细胞焦亡与机体在病原体感染时的炎性反应有密切的关系。细胞焦亡是经由Gasdermin 家族蛋白介导的质膜膜孔形成的可调控性细胞死亡,经常但并不总因炎性反应性 Caspase的活化而完成6。肺泡巨噬细胞约占肺内白细胞总数的 95%,巨噬细胞焦亡可以上调炎性反应水平,进一步加重免疫反应失控,参与 ALI 的发展进程7。姜黄素是姜科姜黄属植物姜黄根茎中提取的一种脂溶性酚类物质。近年来多项研究显示:姜黄素能够通过调节多个信号通路的关键分子靶点,发挥抗炎、抗氧化、抗细胞凋亡、抗病毒、抗癌和免疫调节等活性,从而保护脏器功能8-11。细胞焦亡是机体重要的免疫反应,能快速清除各种病原微生物,限制病菌生长,在拮抗感染和内源性危险信号中发挥重要作用12-14。Rhl S 及 Kaya-gaki N 等学者研究发现,焦亡能发生在括大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和李斯特菌等感染宿主细胞的细菌上,同时破坏细菌和宿主细胞,周围未被感染的健康细胞则无任何损伤15-16。本研究提示姜黄素可能抑制感染细胞增殖的能力,从而加速机体清除病原。2018 年 Kambara 等17发现不依赖 Caspase 酶切割 GSDMD 引发中性粒细胞焦亡现象,揭示细胞焦亡发生由其识别水解的底物 Gasdermin 家族蛋白决定,不由 Caspase 酶决定。本研究提示 LPS 诱导巨噬细胞焦亡损伤模型中,姜黄素可以通过非 NL-RP3-Caspase-1 途径通过下调 GSDND 蛋白,从而抑制细胞焦亡,具体机制尚待进一步实验验证。GSDMD 蛋白介导细胞焦亡过度发生的伴随大量的包括 IL-1、IL-18 等炎性细胞因子的释放,因此过度的焦亡可能诱导大量炎性细胞的浸润,导致强烈的炎性反应,机体可能出现败血症等严重不良反应18-19。本研究结果提示在这个细胞焦亡剧烈的条件下,姜黄素有通过 NLRP3 炎性体信号通路抑制细胞焦亡的作用。本研究通过实验证实姜黄素能够显著减轻 LPS/尼日利亚菌素所致致肺泡巨噬细胞的焦亡反应,其机制可能与其抑制抑制 NLRP3 炎性体信号通路有关。本研究存在不足之处,未同时进行 IL-1、IL-18 炎性因子的检测。目前细胞焦亡的分子机制仍在进一步探索中,姜黄素在生物体内的安全性如何,作用的具体的分子机制如何,均需更多的研究深入探讨。4 参考文献1 Agarwal R,Aggarwal AN,Gupta D,et al.Etiology and outcomes of pulmonary and extrapulm onary acute lung injury/ARDS in a re s piratory ICU in North IndiaJ.Chest,2006,130(3):724-729.2 Ren Y,Zhou Z,Yan G,et al.Curcumin relieves paraquat induced lung injury through inhibiting the thioredoxin interacting protein/NLR pyrin domain containing 3 mediated inflammatory pathwayJ.Mol Med Rep,2019,20(6):5032-5040.3 Kim J,Jeong SW,Quan H,et al.Effect of curcumin(Cur-cuma longa extract)on LPS-induced acute lung injury is media-ted by the activation of AMPKJ.J Anesth,2016,30(1):100-108.4 Ma JQ,Mu ST,Yan DL.Effect of curcumin on the inflam-matory response and notch 2/HES-1 pathway in rats with sepsis-associated acute lung injuryJ.Progress Anatomical Sci,2020,26(1):83-85,89.5 邵 奇,王倩梅,马善波,等.姜黄素对急性肺损伤小鼠炎症反应的改善作用J.中成药,2019,41(10):2349-2353.6 Galluzzi L,Vitale I,Aaronsons A,et al.Molec ular mecha-nisms of cell death:recommendations of the Nomenclature Com-mittee on cell death 2018J.Cell Death Differ,2018,25(3):486-541.7 Zhang Xiao,Li QJ,Sun LX.Research advances of alveolar macrophage pyroptosis in the mechanism of acute lung injuryJ.Int J Anesth Resus,2020,41(11):1112-1115.8 刘化进.姜黄素对大鼠心肌缺血再灌注损伤的保护作用及其机制D.南京:南京医科大学,2018.9 石境懿,夏 利,贾钦尧,等.姜黄素对百草枯致急性肺损伤小鼠肺组织 MAPK 通路蛋白表达的影响J.临床肺科杂志,2018,23(4):728-731.10 田 硕,白明.姜黄素对大鼠糖尿病模型的影响J.中药药理与临床,2017,33(2):53-55.11 Zhang HB,Zhang YB,Chen YL,et al.Glutathione-re-sponsive self-delivery nanoparticles assembled by curcumin di-mer for enhanced intracellular drug deliveryJ.Int J Pharm,2018,549(1-2):230-238.12 Jorgensen I,Rayamajhi M,Miao EA.Programmed cell death as a defence against infection J.Nat Rev Immunol,2017,17:151-164.13 Miao EA,Leaf IA,Treuting PM,et al.Caspase-1-induced pyroptosis is an innate immune effector mechanism against intra-cellular bacteriaJ.Nat Immunol,2010,11:1136-1142.14 Aachoui Y,Leaf IA,Hagar JA,et al.Caspase-11 protects against bacteria that escape the vacuoleJ.Science,2013,339:0533吉林医学 2023 年 12 月第 44 卷第 12 期975-978.15 Rhl S,Broz P.Caspase-11 activates a canonical NLRP3 inflammasome by promoting K+effluxJ.Eur J Immunol,2015,45:2927-2936.16 Kayagaki N,Stowe IB,Lee B L,et al.Caspase-11 cleaves gasdermin D for non-canonical inflammasome signallingJ.Na-ture,2015,526:666-671.17 Kambara H,Liu F,Zhang X,et al.Gasdermin D exerts antiinflammatory effects by promoting neutrophil deathJ.Cell Rep,2018,22(11):2924-2936.18 Broz P,Pelegrn P,Shao F.The gasdermins,a protein family executing cell death and inflammationJ.Nat Rev Immu-nol,2020,20:143-157.19 Strowig T,Henao-Mejia J,Elinav E,et al.Inflammasomes in health and diseaseJ.Nature,2012,481:278-286.收稿日期:2022-10-18 编校:李晓飞肥厚型心肌病关键基因的鉴定及铁死亡机制巴文强1,李 艳2,李梦媛3(1.吉安市中心人民医院药剂科,江西吉安 343000;2.吉安市第三人民医院心理科,江西吉安 343000;3.南京医科大学第二附属医院药学部,江苏 南京 210011)摘 要 目的:利用生物信息学方法探究肥厚型心肌病(HCM)的关键基因、铁死亡基因和相关富集通路。方法:从GEO 数据库下载 GSE36961 和 GSE32453 数据集,筛选共同差异表达基因(DEGs)进行富集分析,构建蛋白质相互作用(PPI)网络并鉴定关键基因,用 GSE1145 数据集验证关键基因的表达,绘制关键基因的受试者工作特征(ROC)曲线。此外,检索Genecards 和 FerrDb 数据库,获得调控铁死亡基因并进行分析。结果:共筛选出 136 个共同 DEGs,富集分析显示共同 DEGs 与流体剪切应力和动脉粥样硬化、糖尿病并发症中的晚期糖基化终产物及其受体信号通路等相关。PPI 网络鉴定出 4 个关键基因,其中 CCL2、CEBPD 和 PIM1 在 HCM 中表达下调(均 P0.05),且对 HCM 有较高的诊断效能。另外,筛选出 ATF3、LPCAT3和 PIM1 等 10 个调控铁死亡抗 HCM 的可能作用靶标,介导流体剪切应力和动脉粥样硬化、铁死亡等信号通路调控铁死亡途径。结论:CCL2、CEBPD 和 PIM1 基因在 HCM 发病中具有重要作用,为 HCM 的诊断和治疗提供了参考,铁死亡相关基因为HCM 发病机制的探索提供了新的方向。关键词 肥厚型心肌病;关键基因;铁死亡;生物信息学基金项目:江西省卫健委科技计划项目项目编号:SKJP220228843;吉安市科技计划项目项目编号:20222-026804Identification of hub genes related to hypertrophic cardiomyopathy and analysis of ferroptosis mechanismBA Wen-qiang1,LI Yan2,LI Meng-yuan3(1.Department of Pharmacy,Central Peoples Hospital of Jian,Jian 343000,China;2.Department of Psychiatry,Jian Third Peoples Hospital,Jian 343000,China;3.Department of Pharmacy,The Second Affiliated Hospital of Nanjing Medical University,Nanjing 210011,China)Abstract:Objective To explore the hub genes,ferroptosis related genes and related enrichment pathways of hypertrophic cardio-myopathy(HCM)by bioinformatics methods.Method The GSE36961 and GSE32453 datasets were downloaded from the Gene Ex-pression Omnibus(GEO)database,the common differentially expressed genes(DEGs)were screened out and enrichment analysis was performed.Then,a protein-protein interaction(PPI)network of the common DEGs was established and to screen hub genes.The GSE1145 dataset was used to verify the expression of hub genes,and ROC curves of hub genes were drawn to identify.Genecards and FerrDb database were searched to obtain and analyze the genes regulating ferroptosis.Results The results of enrichment analysis of 136 common DEGs suggest that the common DEGs were related to fluid shear stress and atherosclerosis and advanced glycosylation end products-receptor of advanced glycosylation end products signaling pathway in diabetic complications et al.After constructing of PPI network,the four hub genes were identified,among which CCL2,CEBPD and PIM1 are lowly expressed in HCM(all P0.05),and had highly diagnostic efficiency for HCM.In addition,ten possible targets regulating ferroptosis and anti-HCM disease were selected,including ATF3,LPCAT3 and PIM1 et al.Ferroptosis pathway is regulated by mediating fluid shear stress and atherosclerosis and fer-roptosis signaling pathways.Conclusion The CCL2,CEBPD and PIM1 genes play an important role in the pathogenesis of HCM,pro-viding a reference for the diagnosis and treatment of HCM.Ferroptosis related genes could provide us with a novel direction for explora-tion of the pathogenesis of HCM.Key Words:Hypertrophic cardiomyopathy;Hub genes;Ferroptosis;Bioinformatics 肥厚型心肌病(HCM)是以心肌肥厚为主要特点,严重患者可能会并发房颤、心力衰竭及心源性猝1533吉林医学 2023 年 12 月第 44 卷第 12 期