金枪鱼泡吻棘头虫的分离与鉴定.pdf

栏目编辑 宋迁红病 害 防 治2023.8目前国内外罕有报道金枪鱼感染棘头虫。本研究在进口金枪鱼体内发现了大量棘头虫感染，经过形态学观察和分子生物学鉴定，证实该寄生虫为泡吻棘头虫。泡吻棘头虫能够通过吻突刺进鱼肠道黏膜造成机械损伤，容易造成继发感染，同时会消耗营养物质，造成鱼体消瘦，其代谢产物能够扰乱鱼体组织细胞的正常生理功能，导致免疫力下降。一、材料和方法1.主要试剂及仪器福尔马林(38%甲醛溶液)、甘油(丙三醇)均为分析纯，购自南京化学试剂股份有限公司；氯化钠、乙酸、95%乙醇均为分析纯，购自国药集团化学试剂有限公司；MagMAXCORE核酸提取试剂盒购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司；Taq DNA聚合酶和DL 2000 marker购自宝日医生物技术(北京)有限公司；体视显微镜为蔡司Discovery V8，PCR仪为ABI VERITI。2.金枪鱼临床检查2023年1月，江苏口岸进口冰鲜金枪鱼被送至实验室检测，观察鱼鳃和体表后将内脏取出，依次剖解心、肝、食道、胃、肠进行观察，在肠腔内发现疑似泡吻棘头虫，虫体的泡与颈部已经穿过肠壁，躯体仍在肠道中，将虫体从肠壁剥离，置于加有生理盐水的培养皿中，清除虫体周围杂物。3.虫体形态学观察将虫体透明化后作进一步形态学观察。将初步鉴定的可疑虫体置于热乙醇中，待虫体伸直后用巴氏液(0.85 克氯化钠和3毫升福尔马林溶液溶于蒸馏水97毫升中)固定，再用10%甘油乙醇(10毫升甘油溶于90毫升70%乙醇中)透明处理，在体视显微镜下观察虫体内部形态特征。4.分子生物学鉴定将整个虫体用核酸提取试剂盒提取基因组DNA，以18S和28S rRNA基因为分子标记来鉴定物种种类。18S的引物参考马振华等(2011)，5R:5-CTTGGCAAATGCTTTCGC-3和 1F:5-TACCTGGTTGATCCTGCCAGTAG-3；8R:5-ACGGGCGGTGTGTAC-3 和 3F:5-GTTCGATTCCGGAGAGGGA-3；9R:5-GATCCTTCCGCAGGTTCACCTAC-3和A2.0：5-ATGGTTGCAAAGCTGAAAC-3。28S 的引物 F:5-ACCCSCTGAAYTTAAGCA-3，R:5-AACTCTCTCMTTCARAGTTC-3。50微升PCR反应体系：10PCR缓冲液5.0微升、氯化镁5.0微升、dNTPs 2.0微升、正向引物和反向引物各 1.0 微升、耐热 DNA 聚合酶0.5微升、DNA模板2.5微升，加灭菌去离子水至总体积 50 微升。PCR 反应条件：94、3 分钟；94、30 秒；48、30 秒；72、2 分钟，共30个循环；72、5分钟。扩增产物由上海生工生物 工 程 有 限 公 司 测 序。将 测 序 结 果 在 NCBIGenBank 数据库中比对，用 MEGA 11 构建系统发育树。二、结果1.虫体形态学观察结果将金枪鱼内脏取出后观察，表面无异常，剖开肠道后发现了大量虫体，分布于整个肠腔内，虫体乳白色，呈长圆柱形，由吻、颈和躯干三个部分组成，体长616毫米；颈部较短，体表光滑无体棘。虫体透明处理后在体视显微镜下观察内部形态：吻部呈圆柱形，长400900微米，具有1517纵列吻钩，颈部位于吻部和躯干之间，呈棒球杆状，在基部逐渐变宽、变粗；颈部前缘靠近吻的位置，形成一个大的球状泡，吻鞘从吻的末端延伸至躯干内部，有两个吻腺，吻腺末端逐渐变宽超过吻鞘(图1)。图1泡吻棘头虫形态学观察徐晔，段宏安，周毅，窦维伟，王凤芝，王静，丁超(连云港海关综合技术中心，江苏 连云港222000)基金项目：南京海关科研项目(2023KJ22)57栏目编辑 宋迁红病 害 防 治2023.82.18S 和 28S rRNA 基因鉴定该寄生虫 18SrRNA基因测序后(2301 isolate)经NCBI数据库比对发现，该寄生虫与泡吻棘头虫属相似性为99.83%，其28S rRNA基因与长颈棘头虫属相似性为96.69%。以邻接法构建系统进化树(图2)，寄生虫样品均被划分为泡吻科，结合形态学观察结果，确定该寄生虫为泡吻棘头虫属。三、讨论金枪鱼素有“海底黄金”的美誉，因其肉质滑嫩鲜美，富含糖类、蛋白质、胆固醇、维生素、钙、磷、铁等元素，尤其是其中的二十二碳六烯酸(DHA)、二十碳五烯酸(EPA)等n-3多不饱和脂肪酸含量极高，是国际营养学会推荐的绿色无污染的三大营养鱼之一。金枪鱼保持较高体温的能力使其能够在更深的深度和更高的纬度的冷水中迅速寻找猎物。从全球金枪鱼的生产来看，目前世界金枪鱼主要来自大洋性捕捞和过洋性捕捞，养殖的金枪鱼占比极少，仅在日本、西班牙等国有部分养殖。中国黄鳍金枪鱼养殖起步较晚，目前仅有中国水产科学研究院南海水产研究所热带水产研究开发中心进行相关研究。作为全球公认的高端营养食材，金枪鱼在全球拥有广阔的消费市场。从国内市场看，近年来随着中产阶级和富裕人群数量激增，金枪鱼消费已经成为家庭消费中的一个重要组成部分。M R Deveney等(2005)发现寄生虫很少对养殖的南方蓝鳍金枪鱼健康构成威胁。但是 LachlanCoff等(2022)研究发现血吸虫感染被认为是日本和澳大利亚养殖的蓝鳍金枪鱼最重要的健康问题。Truong Dinh Hoai等(2022)报道2019年从零售店销售的几例生黄鳍金枪鱼肌肉组织中存在未知的白色结节性囊肿，镜检后确诊为多黏孢子虫，从而引发了公众对越南生食海鱼的健康担忧。Rie Murata等(2021)认为避免生食金枪鱼腹侧肌肉能够预防异尖线虫的感染。据中国海关编码，中国进出口的金枪鱼主要分为黄鳍金枪鱼、大西洋蓝鳍金枪鱼、太平洋蓝鳍金枪鱼、南方蓝鳍金枪鱼、长鳍金枪鱼、大眼金枪鱼和其他金枪鱼，运输方法是冷冻、新鲜或冷藏两类。金枪鱼的食物种类比较多，有鲭鱼、鳗鱼、虾类、蟹类、乌贼等。人工饲养的金枪鱼，主要饲喂的也是鱼虾等动物性饲料。金枪鱼通过食物、环境感染寄生虫的风险较高。欧盟委员会条例规定食品经营者必须确保生的或半生的水产品经过冷冻处理来杀死可能危及消费者健康的活体寄生虫。冷冻处理的方式包括-20下不少于 24 小时，或-35下不少于15小时，但是美国FDA在“鱼及渔业产品危害及控制指南”中规定了冷冻处理的方式来杀灭寄生虫不适用于厚度超过15厘米的大鱼。金枪鱼是体形较大的海鱼，一般能长到23米长，常规的冷冻处理方式不能够杀灭其体内的寄生虫。无论捕捞还是养殖的金枪鱼，如果食用后没有将其内脏妥善处理，传播寄生虫的风险很高，建议有关单位加强金枪鱼的检疫监管，减少传播寄生虫的风险。四、小结本研究报道了金枪鱼肠腔内大量感染了棘头虫，虫体头部钻入肠壁，造成鱼体机械损伤；形态学和分子生物学的研究表明该案例中的棘头虫是泡吻棘头虫。本研究结果对金枪鱼棘头虫病的诊断和防治具有重要的参考价值。18S28S图2基于18S和28S的棘头虫发育树分析58