结肠癌患者血清miR-370-3p、ANO1表达变化及其临床意义.pdf

山东医药2023 年第 63 卷第 31 期结肠癌患者血清miR-370-3p、ANO1表达变化及其临床意义张乐，李昊泽，刘凯东，白月奎北京市海淀医院普外科，北京100091摘要：目的探讨血清微小RNA-370-3p（miR-370-3p）、茴香胺1（ANO1）表达与结肠癌病理特征及术后复发的关系。方法选取94例接受腹腔镜手术治疗的结肠癌患者为结肠癌组、50例结肠息肉患者为良性病变组、50名健康体检者为对照组。用实时荧光定量PCR法检测各组血清miR-370-3p、ANO1表达。术后随访3年，复发31例（复发组）、未复发63例（未复发组）。在线网站TargetScan预测miR-370-3p与ANO1的靶向关系，用Pearson相关法分析结肠癌患者血清miR-370-3p与ANO1 mRNA表达的相关性；多因素Logistic回归分析结肠癌患者术后复发的影响因素；用受试者工作特征（ROC）曲线分析血清miR-370-3p、ANO1 mRNA对结肠癌患者术后复发的预测价值。结果结肠癌组血清miR-370-3p表达低于良性病变组、对照组（P均0.05），ANO1 mRNA表达高于良性病变组、对照组（P均0.05）。在线网站TargetScan预测miR-370-3p与ANO1在649655和676682处有结合位点，结肠癌患者血清miR-370-3p与ANO1 mRNA中表达呈负相关（r=-0.609，P0.05）。血清miR-370-3p、ANO1 mRNA表达在不同分化程度、TNM分期、侵犯浆膜、淋巴结转移结肠癌患者中差异有统计学意义（P均0.05）。TNM分期期、侵犯浆膜、淋巴结转移和ANO1 mRNA1.64为术后复发的独立危险因素，miR-370-3p0.74为独立保护因素（P均0.05）。ROC曲线分析显示，血清miR-370-3p、ANO1 mRNA联合预测结肠癌患者术后复发的曲线下面积（0.876）大于二者单独预测的曲线下面积（0.786、0.783），比较差异有统计学意义（P均0.05）。结论结肠癌患者血清miR-370-3p低表达、ANO1 mRNA高表达，与肿瘤分化程度、TNM分期、侵犯浆膜、淋巴结转移和术后复发有关，二者联合预测结肠癌患者术后复发的价值较高。关键词：结肠癌；微小RNA-370-3p；茴香胺1；临床病理特征；复发doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2023.31.005 中图分类号：R735.3 文献标志码：A 文章编号：1002-266X（2023）31-0019-05Expression changes of serum miR-370-3p and ANO1 in colon cancer patients and the clinical significanceZHANG Le，LI Haoze，LIU Kaidong，BAI YuekuiDepartment of General Surgery，Beijing Haidian Hospital，Beijing 100091，ChinaAbstract：Objective To investigate the relationships between serum microRNA-370-3p（miR-370-3p）and anoctamin 1（ANO1）expression and the pathological characteristics of colon cancer and recurrence after laparoscopic surgery.Methods Ninety-four cases of colon cancer patients undergoing laparoscopic surgery（the colon cancer group），50 cases of colon polyp patients（the benign lesion group），and 50 cases of healthy individuals（the control group）were selected.Real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction was used to detect serum miR-370-3p and ANO1 mRNA expression of each group.Patients were followed up for 3 years after laparoscopic surgery；there were 31 cases of recurrence（recurrence group）and 63 cases of non-recurrence（non recurrence group）.Online website TargetScan was used to predict the targeting relationship between miR-370-3p and ANO1，and Pearson correlation method was used to analyze the correlation between serum miR-370-3p and ANO1 mRNA expression in colon cancer patients.Multivariate Logistic regression analysis was used to analyze the influencing factors for postoperative recurrence in colon cancer patients after laparoscopic surgery.The value of serum miR-370-3p and ANO1 mRNA in predicting postoperative recurrence in colon cancer patients was ana基金项目：北京市外籍高层次人才资助计划项目（J202011）。第一作者简介：张乐（1983-），男，博士研究生，副主任医师，主要研究方向为减重手术，疝、胃食管反流的临床诊治。E-mail：通信作者简介：白月奎（1967-），男，博士研究生，主任医师，主要研究方向为胃肠道肿瘤、普外科疾病的临床诊治。E-mail：开放科学（资源服务）标识码（OSID）19山东医药2023 年第 63 卷第 31 期lyzed using receiver operating characteristic（ROC）curves.Results The expression of serum miR-370-3p in the colon cancer group was lower than that in the benign lesion group and control group（both P0.05），and the expression of ANO1 mRNA was higher than that in the benign lesion group and control group（both P0.05）.The online website TargetScan predicted that there were binding sites between miR-370-3p and ANO1 at 649-655 and 676-682，and there was a negative correlation between the expression of miR-370-3p and ANO1 mRNA in the colon cancer patients（r=0.609，P0.05）.There were significant differences in serum miR-370-3p and ANO1 mRNA expression levels among patients with different degrees of differentiation，TNM stage，plasma membrane invasion，and lymph node metastasis（all P0.05）.TNM stage III-IV，plasma membrane invasion，lymph node metastasis，and ANO1 mRNA1.64 were independent risk factors for recurrence after laparoscopy，and miR-370-3p0.74 was an independent protective factor（all P0.05）.ROC curve showed that the area under the curve of serum miR-370-3p combined with ANO1 mRNA（0.876）in predicting the recurrence after laparoscopy in patients with colon cancer was greater than that of miR-370-3p and ANO1 mRNA alone（0.786，0.783）（both P0.05）.Conclusion Serum miR-370-3p and ANO1 mRNA expression in colon cancer patients was associated with the degree of differentiation，TNM stage，plasma membrane invasion，lymph node metastasis and post-laparoscopic recurrence，and the combined serum miR-370-3p and ANO1 mRNA expression was of high value in predicting post-laparoscopic recurrence in colon cancer patients.Key words：colon carcinoma；microRNA-370-3p；anoctamin 1；clinicopathologic features；recurrence近年来，结肠癌发病率较直肠癌有增多趋势，尤其在4165岁人群中1-2。腹腔镜手术是治疗结肠癌的有效手段，但仍有部分患者术后复发，严重影响患者预后3。术后残留肿瘤细胞恶性进展是结肠癌复发的重要原因4。研究表明，微小RNA（miRNA）能 调 控 多 种 靶 基 因 参 与 结 肠 癌 发 生、发 展5。miR-370-3p是一种与肿瘤相关miRNA，其异常表达与结肠癌细胞增殖、分化、迁移和侵袭有关6。有研究证实，miR-370-3p与急性髓系白血病复发有关7。茴香胺1（ANO1）是一种钙激活氯通道蛋白，能通过激活多条信号通路促进结肠癌恶性进展8，且与非小细胞肺癌复发有关9。本研究探讨血清miR-370-3p、ANO1表达与结肠癌临床病理特征及术后复发的关系，以期为改善患者预后提供参考。1 资料与方法 1.1临床资料选取2018年1月2019年12月本院收治的94例结肠癌患者为结肠癌组，均接受腹腔镜手术治疗，男55例、女39例；年龄4275（59.75 8.42）岁；肿瘤最大径5 cm 26例、5 cm 68例；肿瘤分化程度：低分化 41 例、中高分化 53 例；TNM 分期10：期25例、期16例、期42例、期13例；侵犯浆膜36例、淋巴结转移39例。纳入标准：经病理检查确诊为结肠癌，符合相关诊断标准10；初次确诊；具备腹腔镜术适应证（TNM分期期根治性切除手术、期局部根治性手术）11。排除标准：入院前已接受抗肿瘤治疗患者；年龄0.05）。各组患者或家属知情同意，且签署知情同意书；本研究经医院伦理委员会批准。1.2血清miR-370-3p、ANO1表达检测采用实时荧光PCR法。收集结肠癌组术前和良性病变组、对照组体检时空腹静脉血3 mL，3 000 r/min离心10 min（半径10 cm），留取血清，TRIzol试剂盒（沈阳万类生物科技有限公司）提取血清总RNA，微量分光光度计（武汉艾维斯特科技有限公司）鉴定RNA浓度和纯度合格后，用逆转录试剂盒（广州东盛生物科技有限公司）合成cDNA。逆转录条件：37 1 h、80 5 s。用实时荧光定量试剂盒（南京诺唯赞生物科技股份有限公司）进行实时荧光定量聚合酶链反应。反应体系 20 L：cDNA 1 L、上下游引物各 0.5 L、2TransStartTop Green qPCR SurperMix 10 L、无核酸酶水8.5 L；反应条件：95 90 s，95 30 s、63 30 s、72 15 s循环40次。分别以U6和GAPDH为内参，2-CT法计算血清miR-370-3p、ANO1相对表达量。miR-370-3p上游引物序列5-GCCTGCTGGGGT20山东医药2023 年第 63 卷第 31 期GGAACCTGGT-3，下游引物序列 5-GCAGGGTCCGAGGTATTC-3；U6上游引物序列5-CGCAAGGATGACACGCAAAT-3，下游引物序列5-GCAGGGTCCGAGGTATTC-3；ANO1上游引物序列5-CAGGCGGTGCCTATGTCTCA-3，下 游 引 物 序 列 5-GCTCCTCCACTTGGTGGTTT-3；GAPDH 上 游 引 物 序 列5-GACCTGACCTGCCGTCTAG-3，下游引物序列5-AGGAGTGGGTGTCGCTGT-3。1.3术后复发统计及分组结肠癌患者入院后均参 考腹 腔 镜 结 直 肠 癌 根 治 术 操 作 指 南（2018版）11接受腹腔镜手术治疗，术后通过门诊复查或电话进行定期随访，以手术时间为起点随访3年（第1 年 3 个月/次，后 2 年 6 个月/次），随访至复发或2022年12月。术后复发定义为术后出现新的肿瘤，包括腹腔、盆腔、淋巴结等局部复发和肝、脑、骨、肺等远处复发，经病理检查或增强CT、磁共振成像、超声等影像学检查确诊。随访3年，97例结肠癌患者复发31例（复发组）、未复发63例（未复发组）。1.4统计学方法采用SPSS28.0统计软件。符合正态分布的计量资料以-x s表示，两组比较采用t检验；在线网站TargetScan（https：/www.targetscan.org/vert_80/）预测 miR-370-3p 与 ANO1 的靶向关系；Pearson相关法分析结肠癌患者血清miR-370-3p与ANO1 mRNA表达的相关性；用单因素与多因素Logistic回归分析结肠癌患者术后复发的影响因素；用受试者工作特征（ROC）曲线分析血清 miR-370-3p、ANO1 mRNA对结肠癌患者术后复发的预测价值，曲线下面积比较用Delong检验。P0.05为差异有统计学意义。2 结果 2.1三组血清 miR-370-3p、ANO1 mRNA 表达比较见表1。2.2结肠癌患者血清miR-370-3p与ANO1 mRNA表达的关系在线网站TargetScan预测miR-370-3p与ANO1在649655和676682处有结合位点。Pearson相关分析结果显示，结肠癌患者血清miR-370-3p与ANO1 mRNA中表达呈负相关（r=-0.609，P0.05）。2.3血清miR-370-3p、ANO1 mRNA表达与结肠癌患者临床病理特征的关系见表2。2.4结肠癌患者术后复发的影响因素2.4.1单因素分析结果肿瘤分化程度、TNM 分期、侵 犯 浆 膜、淋 巴 结 转 移、miR-370-3p、ANO1 mRNA均为结肠癌患者术后复发的影响因素（P均0.05）。见表3。2.4.2多因素分析结果以单因素分析差异有统计学意义因素为自变量，术后复发（是/否=1/0）为因变量，多因素Logistic回归分析显示，TNM分期期、侵犯浆膜、淋巴结转移和ANO1 mRNA1.64为术后复发的独立危险因素，miR-370-3p0.74 为独立保护因素（P均0.05）。见表4。2.5血清miR-370-3p、ANO1 mRNA对结肠癌患者术后复发的预测价值ROC 曲线分析显示，血清miR-370-3p、ANO1 mRNA联合预测结肠癌患者术后复发的曲线下面积（0.876）大于二者单独预测的曲线下面积（0.786、0.783），比较差异有统计学意义（P均0.05）。见表5。3 讨论 miRNA是一类新兴表观遗传调控分子，能通过引发信使RNA（mRNA）的降解或转录后基因沉默，表1三组血清miR-370-3p、ANO1 mRNA表达比较（-x s）组别结肠癌组良性病变组对照组Pn945050miR-370-3p0.74 0.17*#1.23 0.231.27 0.160.05ANO1 mRNA1.64 0.33*#1.14 0.231.14 0.210.05注：与对照组比较，*P0.05；与良性病变组比较，#P0.05。表2血清miR-370-3p、ANO1 mRNA表达与结肠癌患者病理特征的关系（-x s）临床病理特征性别 男 女年龄 60岁 60岁肿瘤最大径 5 cm 0.050.050.050.050.050.050.050.050.050.050.050.050.0121山东医药2023 年第 63 卷第 31 期进而参与结肠癌发生、发展过程5。miR-370-3p是人染色体14q32.31上的一个miRNA，王晓欣等12研究报道，下调 miR-370-3p能靶向叉头盒蛋白 M1抑制骨肉瘤细胞增殖、迁移和侵袭。JIA等13研究报道，上调miR-370-3p表达能靶向Y染色体性别决定区盒转录因子4抑制宫颈癌细胞增殖、迁移、侵袭和糖酵解。上述研究表明，miR-370-3p在不同肿瘤中均发挥作用。LIU 等6利用大数据挖掘技术发现，miR-370-3p异常表达与结肠癌细胞进展有关。同时有研究报道，miR-370-3p异常表达与急性髓系白血病和乳腺癌复发有关7，14。因此推测miR-370-3p可能与结肠癌术后复发有关。本研究结果显示，结肠癌患者血清 miR-370-3p 表达降低，与分化程度、TNM分期、侵犯浆膜和淋巴结转移有关，miR-370-3p0.74 是术后复发的独立保护因素，说明血清miR-370-3p低表达参与结肠癌发生、发展，miR-370-3p高表达可降低术后复发风险，分析原因可能是miR-370-3p高表达能下调三结构域蛋白14，通过抑制新生血管形成为术后残留肿瘤病灶提供生长所需养分，抑制残留肿瘤病灶持续增殖和分化，进而降低结肠癌术后复发风险15。碘离子转运体的非碘转运功能对肿瘤发生、发展至关重要，其异常表达可调节核因子-B、丝裂原活化蛋白激酶、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白、Wnt/-连环蛋白等信号通路，进而调控肿瘤增殖、分化、迁移、浸润、复发、耐药等过程8。ANO1是一种分布于甲状腺、肠胃、肝脏、肾脏、肺脏等多种组织中的碘离子转运体，又称跨膜蛋白16A，其非碘转运功能参与多种肿瘤进程16。如ANO1能激活哺乳动物雷帕霉素靶蛋白信号通路，促进胆管癌细胞存活和增殖17；能激活转化生长因子-、核因子-B、Janus激酶/信号转导和转录激活因子3信号通路，促进头颈部鳞状细胞癌上皮-间充质转化18。张喆等19基于癌症基因组图谱数据库分析发现，ANO1高表达与结肠癌患者预后不良有关。同时有研究报道，ANO1高表达与非小细胞肺癌、乳腺癌复发有关9，20。本研究结果显示，ANO1表达在结肠癌患者血清中升高，与分化程度、TNM 分期、侵犯浆膜和淋巴结转移有关，miR-370-3p1.64 是术后复发的独立保护因素，说明血清ANO1高表达参与结肠癌发生、发展，并会增加术后复发风险。分析原因可能是ANO1高表达能表3结肠癌患者术后复发影响因素的单因素分析影响因素性别 例（%）男性 女性年龄 例（%）60岁 60岁肿瘤最大径 例（%）5 cm 0.050.050.050.050.050.050.050.050.05表4结肠癌患者术后复发影响因素的多因素Logistic回归分析影响因素分化程度TNM分期侵犯浆膜淋巴结转移miR-370-3pANO1 mRNA赋值低分化/中高分化=1/0期/期=1/0有/无=1/0有/无=1/00.74/0.74=1/01.64/1.64=1/00.5271.5970.7872.0340.761-1.298SE0.7350.7710.3600.9610.3570.569Wald 20.5154.2914.7814.4834.5385.206P0.4730.0380.0190.0340.0330.023OR（95 CI）1.694（0.4017.153）4.940（1.09022.393）2.196（1.0854.445）7.648（1.16350.278）2.140（1.0634.309）0.273（0.0900.833）表5血清miR-370-3p、ANO1 mRNA对结肠癌患者术后复发的预测价值指标SIRT6FBLN1二者联合曲线下面积（95%CI）0.781（0.7010.848）0.780（0.7000.848）0.866（0.7960.919）最佳截断值20.23 ng/mL48.12 mg/L-灵敏度（%）94.3460.3879.25特异度（%）48.1088.6179.75Youden指数0.4240.4900.59022山东医药2023 年第 63 卷第 31 期激活Wnt/-连环蛋白信号通路，调节下游转录因子激活，促进术后残留肿瘤细胞增殖、分化、迁移和侵袭，导致结肠癌术后复发风险增加21。本研究显示，结肠癌患者术后复发因素还包括TNM分期期、侵犯浆膜、淋巴结转移，分析原因是分期越晚、伴有侵犯浆膜和淋巴结转移反映肿瘤恶性程度更高，手术难以切除，可能残留更多肿瘤病灶，增加复发风险 2。通过网站预测发现，miR-370-3p与ANO1存在结合位点，相关性分析也发现结肠癌患者血清 miR-370-3p 与 ANO1 表达呈负相关，提示miR-370-3p与ANO1可能共同参与结肠癌术后复发。孙欣华等22研究也证实，上调miR-370-3p表达能靶向ANO1抑制结肠癌细胞增殖和迁移。本研究ROC曲线分析显示，血清miR-370-3p、ANO1 mRNA表达分别为0.75、1.68时，预测结肠癌患者术后复发的曲线下面积分别为0.786、0.783；血清miR-370-3p、ANO1 mRNA联合预测结肠癌患者术后复发的曲线下面积为 0.876，大于 miR-370-3p、ANO1 mRNA 单独预测。说明两者有助于结肠癌患者术后复发预测，且联合检测能提升预测价值。综上所述，血清miR-370-3p、ANO1 mRNA表达与结肠癌患者肿瘤分化程度、TNM分期、侵犯浆膜、淋巴结转移和术后复发有关，血清miR-370-3p联合ANO1 mRNA对结肠癌患者术后复发具有较高预测价值。但本研究结果还需多中心、大样本研究证实。参考文献：1SUNG H，FERLAY J，SIEGEL R L，et al.Global cancer statistics 2020：GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries J.CA Cancer J Clin，2021，71（3）：209-249.2中国抗癌协会，中国抗癌协会大肠癌专业委员会.中国恶性肿瘤整合诊治指南-结肠癌部分 J.中华结直肠疾病电子杂志，2022，11（1）：1-12.3中华医学会外科学分会腹腔镜与内镜外科学组，中华医学会外科学分会结直肠外科学组，中国医师协会外科医师分会结直肠外科医师委员会，等.腹腔镜结直肠癌根治术操作指南（2018版）J.中华消化外科杂志，2018，17（9）：877-885.4CAELLAS-SOCIAS A，CORTINA C，HERNANDO-MOMBLONA X，et al.Metastatic recurrence in colorectal cancer arises from residual EMP1+cellsJ.Nature，2022，611（7936）：603-613.5KUMAR R，MAHMOUD M M，TASHKANDI H M，et al.Combinatorial network of transcriptional and miRNA regulation in colorectal cancer J.Int J Mol Sci，2023，24（6）：5356.6LIU N，JIANG F，CHEN Z.A preliminary study on the pathogenesis of colorectal cancer by constructing a 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