miR-495通过抑制RNF113A的表达调控食管鳞癌细胞恶性表型.pdf

2 0 2CARCINOGENESIS，TERATOGENESIS&MUTAGENESIS论著癌变畸变突变Vol.35No.3May 2023miR-495通过抑制RNF113A的表达调控食管鳞癌细胞恶性表型付静，刘清，于海叶，王磊*(新疆医科大学第一附属医院消化内科，新疆乌鲁木齐830011)Regulation of malignant phenotypeof esophageal squamouscarcinoma cells by miR-495via suppressing the expressionof RNF113AFU Jing,LIU Qing,YU Haiye,WANG Lei*(Department of Gastroenterology,The First Affiliated Hospital of XinjiangMedical University,Urumqi 830011,Xinjiang,China)收稿日期：2022-10-28；修订日期：2022-12-22基金项目：新疆维吾尔自治区自然科学基金青年科学基金(2016D01C320)作者信息：付静，E-mail：。*通信作者，王磊，E-mail：【摘要】目的：探讨微小RNA-495(miR-495)对食管鳞癌细胞恶性表型的影响及分子机制。方法：在食管鳞癌细胞Eca109中转染miR-495模拟物、miR-495抑制剂及相应的随机对照序列，分别采用实时荧光定量PCR(qPCR)检测miR-495的表达，CCK-8试剂盒检测细胞增殖能力，流式细胞术检测细胞周期及凋亡率变化，Transwell 实验检测细胞的侵袭和迁移情况，并用 qPCR 和Western blot检测下游靶基因RNF113A mRNA和蛋白的表达。结果：与对照组比较，转染miR-495模拟物组Eca109细胞中miR-495 mRNA水平显著升高(P0.05)，转染miR-495抑制剂组Eca109细胞中miR-495 mRNA水平显著降低(P0.05)；与对照组比较，转染miR-495模拟物组细胞凋亡增多(P0.01)，迁移和侵袭能力下降(P0.01)，细胞被阻滞在G0/G1期(P0.01)；转染miR-495抑制剂组细胞凋亡减少(P0.01)，迁移和侵袭能力升高(P0.01)，进入细胞周期S期的细胞显著增多(P0.05)。与对照组比较，转染miR-495模拟物组Eca109细胞中RNF113A蛋白水平表达下调(P0.05)，转染miR-495抑制剂组RNF113A蛋白水平表达上调(P0.05)。结论：miR-495可促进Eca109细胞凋亡，抑制其迁移和侵袭能力，并调控细胞周期分布，miR-495可能通过调控RNF113A蛋白表达介导食管鳞癌细胞的恶性表型变化。【关键词】食管鳞癌；miR-495；RNF113A；恶性表型中图分类号：R735.1文献标志码：A文章编号：1004-616X(2023)03-0202-08doi：10.3969/j.issn.1004-616x.2023.03.008【ABSTRACT】OBJECTIVE：To explore effects of microRNA-495(miR-495)on malignant phenotype ofesophageal squamous carcinoma cells and its molecular mechanisms.METHODS：miR-495 mimics and miR-495 inhibitors，and the corresponding random sequence control were transfected into esophageal cancer cellsEca109.Real-timefluorescentquantitativepolymerasechainreactionPCR(qPCR)wasusedtodetectexpression of miR-495，CCK-8 to detect cell proliferation，flow cytometry to detect cell cycle and apoptosis，transwell to detect cell migration and invasion ability，qPCR and western blot to detect expression of mRNAsand proteins of downstream target gene RNF113A.RESULTS：Compared with the control group，the miR-495mRNA levels in the miR-495 mimics transfected group were significantly increased(P0.05)，and in themiR-495 inhibitor transfected group was significantly decreased(P0.05).ThemigrationandinvasionnumbersinthemiR-495mimicstransfectedgroupweresignificantlydecreased(P0.01)，andtheapoptosisratewassignificantlyincreased(P0.01).The levels of cells blocked in the G0/G1 phase(P0.01)were significantly more than thatinthecontrols.ThemigrationandinvasionnumbersinthemiR-495inhibitortransfectedgroupweresignificantly increased(P0.01)，and the apoptosis rate was significantly decreased(P0.01).The proportion ofS phase cells in the miR-495 inhibitor transfected group was increased(P0.05)，and the difference wasstatistically significant.Compared with the control group，expression of the RNF113A protein in the miR-495mimics transfected group was down-regulated(P0.05)，and expression of the RNF113A in the miR-495论著癌变畸变突变2 0 3CARCINOGENESIS，TERATOGENESIS&MUTAGENESIS2023 年 5 月第 35 卷第 3 期inhibitor transfected group was up-regulated(P0.05).CONCLUSION：miR-495 promoted cell apoptosis，inhibited cell migration and invasionability，and regulated cell cycle distribution.Thus，miR-495 may mediate malignant phenotype of esophagealsquamous carcinoma cells by regulating expression of the RNF113A protein.【KEY WORDS】esophageal cancer；miR-495；RNF113A；malignant phenotype中国是食管癌发病率最高的国家，食管癌患者的5年总生存率通常低于20%，晚期食管癌患者的5年总生存率低于10%1-2，预后较差。环境和遗传因素均可导致食管癌的发生。有特殊饮食和生活方式的人，如经常食用腌制食品、热食品，长期饮酒和大量吸烟，更容易患食管癌3-4；携带某些突变基因的人对肿瘤的易感性更高5-6。外科手术是食管癌的常用治疗方法，但治疗效果欠佳7，因此，寻求早期食管癌特异性的诊断和治疗靶点具有重要意义8-9。微小RNA(miRNA，miR)是一种能与靶基因mRNA的 3-非翻译区(3-untranslated region，3-UTR)结合的内源性单链小分子RNA，长度约为22 nt且不编码蛋白质，其通过在转录后水平降解mRNA或抑制翻译来调节基因的表达10。miRNAs影响癌细胞的生物学行为，包括增殖、迁移、侵袭、细胞周期和凋亡，并在肿瘤的发生和发展中发挥作用11-13。miR-495作为较常见的miRNA，在多种肿瘤中异常表达，在食管癌中miR-495 表达下调，发挥抑癌基因的作用。目前，miR-495与其靶基因RNF113A在食管癌中的作用及调控机制尚不清楚。因此，本文将miR-495转染入人食管鳞癌细胞Eca109，探讨miR-495对食管鳞癌细胞恶性表型的影响及其分子机制。1材料与方法1.1细胞系及试剂人食管鳞癌细胞系Eca109购自武汉大学细胞典藏中心，DMEM(高糖)培养基、胰酶、青霉素-链霉素双抗购于 Gibco 公司，胎牛血清(FBS)购于 Excell Bio公司，CCK-8细胞增殖/毒性检测试剂盒和BCA蛋白定量试剂盒购于全式金生物公司，miRNA荧光定量PCR 试剂盒和蛋白预染 Marker 购于上海生工公司，LipofectaminRNAiMAX 购 于 ThermoFisher 公 司，TRIzolTMReagent 购于 Ambion 公司，Transwell 小室购于Corning公司，RIPA裂解液和蛋白酶抑制剂购于博士德公司，-actin Loading Control Antibody购于义翘神州，Anti-RNF113A购于Abcam公司。miR-495模拟物(miR-495mimics)和 miR-49 抑 制 剂(miR-495inhibitor)购于通用生物公司。1.2细胞分组处理Eca109 采用 DMEM 培养基添加 10%胎牛血清和1%青-链霉素双抗溶液置于37、饱和湿度、CO2体积分数为5%的培养箱中培养，待细胞汇合率达70%时使用Lipofectamin RNAiMAX试剂进行转染。细胞分为模拟物对照组(mimics NC)、miR-495模拟物组、抑制剂对照组、miR-495抑制剂组，具体操作按照试剂说明书进行。1.3实时荧光定量PCR检测细胞中miR-495的表达水平提 取 各 组 细 胞 中 总 RNA，将 RNA 逆 转 录 为cDNA，根据实时荧光定量 PCR(quantitative real-timePCR，qPCR)试剂盒说明书的操作步骤进行扩增检测miRNA的表达，miR-495以U6为内参，采用2-CT法计算miR-495的相对表达量。1.4CCK-8试剂盒检测细胞增殖将各组Eca109细胞按照5104个/mL的浓度分别接种至96孔板，每孔100 L，于37、CO2体积分数为5%的培养箱中培养48 h，每孔加入100 L浓度为10%的CCK-8溶液，在培养箱中孵育1 h后，采用酶标仪测定各孔450 nm处吸光度值。1.5流式细胞术检测细胞周期和细胞凋亡将 Eca109 细胞调整为 1105个/mL 的单细胞悬液，接种至6孔板中，每孔2 mL，然后胰酶消化细胞，PBS冲洗，用预冷PBS重悬细胞，将一部分细胞悬液加入到3.5 mL预冷的80%乙醇中，4 固定过夜，离心、沉淀细胞。用预冷的PBS洗涤，加入500L PI/RNase染色缓冲液(staining buffer)重悬细胞并获得单细胞悬液。4 避光孵育30 min后流式细胞术(flow cytometry，FCM)检测细胞周期变化。另一部分细胞悬液，每管加入10 L的7-氨基放线菌素D(7-aminoactinomycin D，7-AAD)和 5 L 膜联蛋白 V-PE(Annexin V-PE)，4 避光孵育5 min，在30 min内检测细胞凋亡率。1.6Transwell实验检测细胞迁移与侵袭将基质胶稀释后加入 Transwell 小室的上层，37 温育5 h，用无血清培养基悬浮细胞，调整浓度为3105个/mL，取100 L细胞悬液加入到Transwell论著癌变畸变突变2 0 4CARCINOGENESIS，TERATOGENESIS&MUTAGENESISVol.35No.3May 2023小室的上层，将 600 L DMEM 完全培养基加入到Transwell下层，培养72 h，PBS冲洗，用4%甲醛固定20 min，结晶紫染色后于显微镜(100)下随机取5个视野统计细胞侵袭的数量。细胞迁移实验无需预铺基质胶，将无血清细胞悬液接种到Transwell小室，其余步骤同上。1.7下游靶基因 RNF113A mRNA 和蛋白表达的检测RNF113A 以-actin 为 内 参，采 用 qPCR 检 测RNF113A mRNA 的表达，方法同 1.3。采用 Westernblot检测RNF113A蛋白的表达。蛋白提取步骤：待培养皿中细胞汇合度达到80%90%时，向细胞样本加入200 L RIPA裂解液(已按1100比例加入蛋白酶抑制剂和广谱磷酸酶抑制剂)，充分混匀，4 环境下设5 min涡旋振荡1次，连续5次后，以12 000 r/min、4 离心15 min收集上清。加入1/3体积的4上样缓冲液(loading buffer)，100 金属浴加热处理10 min，使蛋白充分变性，-20 冻存备用。用聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离提取的总蛋白，后进行电泳、转膜和封闭，在4 的环境中一抗孵育过夜。抗体-actin(13 000)和 RNF113A(11 000)稀释。TBST漂洗，加入稀释后的二抗，山羊抗鼠IgG H&L(HRP)(115 000稀释)和山羊抗兔IgG H&L(HRP)(15 000稀释)室温孵育1 h，TBST漂洗，采用化学发光仪进行检测、拍照。1.8统计学方法应用SPSS 19.0软件进行统计学分析，数据采用x s表示，组间比较采用单因素方差分析，P0.05表示差异具有统计学意义。2结果2.1各组细胞中miR-495的表达水平空白对照组、模拟物对照组、miR-495 模拟物组、抑制剂对照组和miR-495抑制剂组细胞miR-495的相对表达水平分别为 1.0130.186、1.0300.212、1.4230.231、1.0550.158和0.6020.157。与模拟物对照组相比，转染miR-495模拟物组miR-495 mRNA水平显著升高；与抑制剂对照组相比，转染miR-495抑制剂组miR-495 mRNA水平显著降低，差异均有统计学意义(P0.05)，见图1。2.2miR-495对Eca109细胞增殖的影响模拟物对照组、miR-495模拟物组、抑制剂对照组和 miR-495 抑制剂组培养 48 h 后的 D(450)值分别为 0.8710.046、0.8310.050、0.8660.060 和 0.8840.026，miR-495过表达或抑制剂干扰对食管癌Eca109细胞增殖均无显著影响。各组细胞间增殖能力均无显著变化(F=1.962，P=0.139)，见图2。AD：分别为模拟物对照组、miR-495模拟物组、抑制剂对照组、miR-495抑制剂组细胞增殖情况(100)；E：各组吸光度D(450)的统计分析.图2miR-495对Eca109细胞增殖的影响与相应对照组比较，*P0.05.图1各组细胞中miR-495的表达水平论著癌变畸变突变2 0 5CARCINOGENESIS，TERATOGENESIS&MUTAGENESIS2023 年 5 月第 35 卷第 3 期2.3miR-495对Eca109细胞周期和细胞凋亡的影响模拟物对照组、miR-495模拟物组、抑制剂对照组、miR-495 抑制剂组 G0/G1 期细胞比例分别为(48.0730.665)%、(56.2800.563)%、(48.9501.470)%和(50.4130.437)%；S 期细胞比例分别为(25.8501.296)%、(15.223 0.754)%、(26.123 2.456)%和(31.1501.532)%；细胞凋亡率分别为(3.3000.854)%、(5.8001.136)%、(3.4330.577)%和(2.7330.513)%，与模拟物对照组相比，转染miR-495模拟物后G0/G1期细胞显著增多、S期减少、G2/M期增多、细胞凋亡显著增多(P0.01)，说明miR-495阻滞细胞分裂停留在G0/G1期；与抑制剂对照组相比，转染抑制剂后S期显著增多、G2/M期显著减少。凋亡细胞显著减少，差异均具有统计学意义(P0.01)，说明抑制miR-495后细胞DNA合成活跃，大量细胞进入S期，见图3和图4。2.4miR-495对Eca109细胞迁移和侵袭能力的影响模拟物对照组、miR-495模拟物组、抑制剂对照组和 miR-495 抑制剂组细胞迁移数量分别为(95.36.3)、(63.85.2)、(96.94.9)和(104.95.3)个；侵袭数量分别为(93.66.4)、(63.76.1)、(94.35.8)和(105.87.1)个。与模拟物对照组比较，转染模拟物后迁移和侵袭A：模拟物对照组；B：miR-495模拟物组；C：miRNA抑制剂对照组；D：miR-495抑制剂组；E：各组细胞的凋亡率统计分析.与相应对照组比较，*P0.01.图4miR-495对Eca109细胞凋亡的影响A：模拟物对照组；B：miR-495模拟物组；C：miRNA抑制剂对照组；D：miR-495抑制剂组；E：各组细胞的细胞周期统计分析.与相应对照组比较，*P0.01.图3miR-495对Eca109细胞周期的影响论著癌变畸变突变2 0 6CARCINOGENESIS，TERATOGENESIS&MUTAGENESISVol.35No.3May 20232.5miR-495对细胞中RNF113A mRNA 和蛋白表达的影响模拟物对照组、miR-495模拟物组、抑制剂对照组和miR-495抑制剂组RNF113A mRNA相对表达水平分别为1.1260.219、0.9670.142、1.0840.222和1.2020.291；RNF113A 蛋白相对表达水平分别为 0.6000.010、0.3800.050、0.7000.010和0.8100.040。转染miR-495模拟物和抑制剂后，RNF113A mRNA表达水平无明显变化(F=0.833，P=0.520)；而转染模拟物后，RNF113A 蛋白表达水平较对照组下降(P0.05)；转染抑制剂后RNF113A蛋白表达水平较对照组升高，差异具有统计学意义(P0.05)，见图7和图8。3讨论miR-495位于14号染色体14q32.31上14，参与实细胞数均显著减少(P0.01)；与抑制剂对照组相比，转染抑制剂后迁移和侵袭细胞数均显著增多，差异均具有统计学意义(P0.01)，见图5和图6。图7miR-495对细胞中RNF113A mRNA相对表达水平的影响A：模拟物对照组；B：miR-495模拟物组；C：抑制剂对照组；D：miR-495抑制剂组；E：各组细胞的侵袭细胞数统计分析.与相应对照组比较，*P0.01.图6miR-495对细胞侵袭能力的影响A：模拟物对照组；B：miR-495模拟物组；C：抑制剂对照组；D：miR-495抑制剂组；E：各组细胞的迁移细胞数统计分析.与相应对照组比较，*P0.01.图5miR-495对细胞迁移能力的影响论著癌变畸变突变2 0 7CARCINOGENESIS，TERATOGENESIS&MUTAGENESIS2023 年 5 月第 35 卷第 3 期体肿瘤和血液肿瘤细胞的增殖、侵袭、转移和化学敏感性的变化15。已有研究证实miR-495在多种恶性肿瘤中表达失调，包括非小细胞肺癌16、胰腺癌17、卵巢癌18、肾癌19、胃癌20、肝细胞癌21、胆囊癌22。miR-495作为抑癌基因或癌基因在不同类型的肿瘤中发挥不同的作用23-24。例如miR-495在乳腺癌干细胞中高表达，可直接抑制E-cadherin的表达从而促进肿瘤发展25。而在大多数实体肿瘤中，miR-495发挥抑癌基因的作用，例如miR-495可抑制神经胶质瘤细胞的增殖、凋亡和侵袭26；在胃癌组织中，miR-495的表 达 与 磷 酸 酶-3(PRL-3)的 上 调 有 关，PRL-3 是miR-495的下游靶点，转染miR-495模拟物可抑制胃癌细胞的侵袭和转移27。本研究显示miR-495在食管鳞癌细胞中表达下调，转染miR-495模拟物可抑制食管鳞癌细胞的侵袭和迁移，促进食管鳞癌细胞凋亡，发挥抑癌基因的作用。miR-495在食管癌中的研究较少，在食管鳞癌进展中的具体功能及分子机制仍不清楚。Mao等28在食管 鳞 癌 的 研 究 中 发 现，与 正 常 食 管 组 织 相 比，miR-495在食管鳞癌组织中表达水平降低，miR-495可 通 过 调 控 上 皮 间 质 转 化(epithelial-mesenchymaltransition，EMT)及 RAC 丝 氨 酸/苏 氨 酸 蛋 白 激 酶(RAC-alpha serine/threonine-protein kinase)信号通路影响细胞周期来抑制食管癌细胞增殖、侵袭和迁移，同时miR-495的异常表达与食管癌患者的预后、淋巴结转移和TNM分期有关。miR-495通过靶向ATP酶铜转运(ATPase copper transporting alpha，ATP7A)基因抑制食管癌细胞的顺铂耐药和血管生成29-30。在本研究中，miR-495过表达或抑制干扰对食管鳞癌Eca109细胞增殖无显著影响，Mao等28的研究结果与此不同，他们通过集落形成实验发现miR-495过表达可抑制Eca109和TE-1细胞系的增殖，因此miR-495对食管癌细胞增殖的影响尚需进一步验证。本研究发现过表达miR-495抑制了Eca109细胞迁移和侵袭能力，并促进了细胞凋亡，相反抑制miR-495后促进了细胞的侵袭和迁移能力，并抑制了细胞凋亡，改变了食管鳞癌细胞周期的分布。环指蛋白 113A(ringfinger protein 113A，RNF113A)作为 RING 家族的一员，具有泛素连接酶功能，其主要位于Xq24-q25号染色体上，可编码一种蛋白质，其中包含两个与DNA烷基化修复和精子RNA拼接有关锌指域31。RNF113A在结构上具有特异性，主要依靠其结构特征来发挥作用，其结构主要由两个锌离子整合形成特征性的环形结构，形似一把钳子，可以钳住相应的靶蛋白，从而参与调解许多靶蛋白的周转和活性27。miR-495和很多环指蛋白密切相关，环指蛋白的结构组具有高度的保守性，而RNF113A作为其中的一员，因此我们推测miR-495与RNF113A之间可能存在某种关系。为进一步确认 miR-495 对 RNF113A 的调控，我们进行了qPCR及Western blot实验，结果显示与对照组比较，转染miR-495模拟物组RNF113A蛋白表达水平下调，转染miR-495抑制剂组RNF113A蛋白表达水平上调，但RNA水平未见显著变化，说明miR-495可能通过转录后修饰以负向调控RNF113A蛋白的表达。既往研究显示miR-495可与多种靶基因结合，通过调控靶基因的表达进而调控肿瘤细胞的生物学行为。例如miR-495作为肿瘤抑制因子，在非小细胞肺癌中被下调，肿瘤转移基因3(MTA3)是公认的非小细胞肺癌淋巴结转移的危险因素。miR-495可以通过靶向MTA3mRNA降解影响非小细胞肺癌的转移32。miR-495在结肠癌中表达下调，miR-495通过调控膜联蛋白A3基因抑制结肠癌细胞的增殖和侵袭33。有研究发现，miR-495通过靶向Akt1抑制细胞周期转换和EMT信号通路，从而抑制食管癌细胞增殖、迁移和侵袭26。本研究结果显示，Eca109细胞过表达miR-495后，细胞凋亡增加，侵袭和迁移能力下降，与上述研究结果一致，但该研究未进行 miR-495 与 RNF113A 关系的探讨，本研究首次发现miR-495可以负向调控RNF113A的蛋白表达，从而调控食管鳞癌细胞恶性表型。综上，miR-495对Eca109细胞增殖能力无显著影响，但可促进细胞凋亡，抑制其迁移和侵袭能力，并调 控 细 胞 周 期 分 布，同 时 miR-495 可 通 过 抑 制RNF113A的蛋白表达调控Eca109细胞恶性表型。本研究表明miR-495在食管鳞癌发生发展中起着关键作用，有望成为食管鳞癌诊断及治疗的新靶点。然而，由于靶基因调控具有多样性，miRNA-495调控食管癌A：Western blot检测结果条带图；B：各组细胞的RNF113A蛋白相对表达水平.与相应对照比较，*P0.01.图8miR-495对细胞中RNF113A蛋白相对表达水平的影响论著癌变畸变突变2 0 8CARCINOGENESIS，TERATOGENESIS&MUTAGENESISVol.35No.3May 2023细胞恶性表型是否通过与其他靶基因的相互作用，还需要进一步探索。参考文献1SIEGEL R L,MILLER K D,JEMAL A.Cancer statistics,2015J.CA A Cancer J Clin,2015,65(1):5-29.2ZHANG C J,ZHANG J X,WU Q,et al.Sulforaphene inducesapoptosis and inhibits the invasion of esophageal cancer cellsthrough MSK2/CREB/Bcl-2 and cadherin pathway in vivo andin vitroJ.Cancer Cell Int,2019,19:342.3LI S,CHUNG D C,MULLEN J T.Screening high-riskpopulations for esophageal and gastric cancerJ.J Surg Oncol,2019,120(5):831-846.4CASPA GOKULAN R,GARCIA-BUITRAGO M T,ZAIKA AI.From genetics to signaling pathways:molecular pathogenesisof esophageal adenocarcinomaJ.Biochim Biophys Acta RevCancer,2019,1872(1):37-48.5XIAO Y H,SU M,OU W,et al.Involvement of noncodingRNAs in epigenetic modifications of 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