天麻素与薯蓣皂苷元配伍对大鼠缺氧损伤脑微血管内皮细胞的保护作用.pdf

药物研究天麻素与薯蓣皂苷元配伍对大鼠缺氧损伤脑微血管内皮细胞的保护作用王志昊祝娜唐茂红付饶阿热依巴哈提李彦文黄秀兰李志勇(.中国中医科学院中药研究所北京.中央民族大学药学院北京.山西中医药大学基础医学院晋中.中国中医科学院中医药信息研究所北京)摘 要 目的探讨天麻素()、薯蓣皂苷元()及其组合物()对大鼠缺氧损伤脑微血管内皮细胞()的保护作用和对脑微血管新生的影响及其作用机制 方法将 分为 组:正常对照组模型对照组 组(、)组(.、.、)组(和 浓度分别为 和.、和.、和、和、和、和 )分组给药 后对模型对照组、组、组和 组通过氧糖剥夺法建立 缺氧模型 检测乳酸脱氢酶()漏出率、白细胞介素()含量、超氧化物歧化酶()活力、丙二醛()浓度观察 、/染色采用 小室实验、细胞划痕实验和小管形成实验考察、及 对缺氧损伤 的保护作用及促进血管新生作用 进一步利用网络药理学和分子对接方法研究 抗脑缺血的作用机制 结果、以、.组合时可显著提高缺氧损伤 细胞活力(.)促进细胞增殖与模型对照组比较 组 漏出率降低(.)组、组与 组 含量均显著下降(均.)组、组 活力升高(.)组、组以及 组凋亡小体减少 可促进 缺氧模型的增殖、侵袭、迁移以及小管形成表明其在细胞水平上一定程度促进血管新生 网络药理学研究发现 与半胱天冬酶()、过氧化物酶体增生激活受体()、凝血因子()、基质金属蛋白酶()、丝氨酸苏氨酸蛋白激酶()蛋白具有良好的结合活性 与内皮一氧化氮合成酶()、蛋白具有良好的结合活性、可能主要通过血管内皮生长因子()信号通路、丝裂原活化蛋白激酶()信号通路、磷酯酰肌醇 激酶()信号通路以及缺氧诱导因子()信号通路调控脑缺血后血管新生 结论、及 具有抗缺氧损伤作用并可促进缺氧损伤后血管新生作用机制可能与其作用于、等蛋白调控/等信号通路促进血管新生有关关键词 天麻素薯蓣皂苷元脑缺血脑微血管内皮细胞血管新生中图分类号.文献标识码 文章编号()./.开放科学(资源服务)标识码()(.)()()()().:()(.)(.)./.(.)医药导报 年 月第 卷第 期 (.)(.)(的靶点进行后续分析将预测的、潜在靶点和搜集的脑缺血及血管新生相关靶点导入 .(网址:/./)在线平台获取交集靶点筛选出、中潜在的具有抗脑缺血及促血管新生作用的活性化合物和相应的疾病靶点将“”与“”加和值排名前 的靶点导入 数据库设置“”来自文本挖 掘 和 实 验 数 据“”为最高置信度(.)下载蛋白相互作用数据并导入 .形成蛋白相互作用()网络 网络中“边”的粗细表示互相作用的强弱靶点的(度)值表示节点的连接情况度值越大代表此节点在蛋白互作网络中越重要利用 数据库的“”功能对、对抗脑缺血的潜在靶点进行京都基因与基因组百科全书()通路富集分析和基因本体()功能注释分析.分子对接 从 数据库获取 网络中度值排名前 的靶点蛋白 格式文件蛋白的种属来源为“”从 数据库中搜索各靶点蛋白对应的已获批的小分子药物()并下载其 格式文件 分别导入 软件完成小分子化合物与 中前 靶点蛋白的分子对接利用.、.版软件将对接结果进行可视化处理建立分子对接结合模式图.数据处理与统计学方法 使用 .版软件进行数据处理与统计分析数据以均数标准差()表示 组间均数比较采用单因素方差分析()以.为差异有统计学意义 使用 .版软件进行绘图 结果.各组细胞活力比较、和 对缺氧损伤 细胞活力的影响见表 结果表明与模型对照组比较 均可提高缺氧损伤 细胞活力(.或.).有提高 细胞活力趋势(.或.)以 和 浓度分别为、.比例组合时可显著提高缺氧损伤 细胞活力(.)故使用 、.和 以 和 浓度分别为、.剂量进行后续实验 表 对缺氧损伤 细胞活力的影响.组别 值细胞活力/正常对照组.模型对照组.组.与正常对照组比较.与模型对照组比较.与模型对照组比较.表 对缺氧损伤 细胞活力的影响.组别 值细胞活力/正常对照组.模型对照组.组.与正常对照组比较.与模型对照组比较.漏出率和 含量 检测 含量可间接反映受损和死亡细胞的数量见表 与模型对照组比较 组 漏出率显著降低(.)组与 组有降低趋势 组、组与 组细胞 含量均显著下降(.).活力、浓度比较 活力、浓度见表 与模型对照组比较 组、组 活力升高(.)组 浓度降低(.)表 对缺氧损伤 细胞活力的影响.组别 值细胞活力/正常对照组.模型对照组.组().与正常对照组比较.与模型对照组比较.与模型对照组比较.表 组细胞 漏出率、表达水平比较.组别 漏出率/()正常对照组.模型对照组.组.组.组.与正常对照组比较.与模型对照组比较.与模型对照组比较.细胞凋亡 细胞凋亡时 可使细胞核着色普通细胞细胞核呈现蓝色凋亡细胞细胞核会呈现出致密浓染或碎块状致密浓染颜色亮白见图红色箭头处可见在荧光显微镜下观察造模后的 细胞与正常对照组细胞比较细胞核明显缩小凋亡小体增多 与模型对照组比较 组、组以及 组凋亡小体明显减少见表、图 采用 和 双染法并基于流式细胞仪检测与正常组细胞比较模型对照组细胞凋亡率显著上升与模型对照组比较 组细胞凋亡率显著降低(.或.)组细胞晚期凋亡率显医药导报 年 月第 卷第 期著降低(.)表 组细胞 活力、浓度比较.组别 活力/()浓度/()正常对照组.模型对照组.组.组.组.与正常对照组比较.与正常对照组比较.与模型对照组比较.与模型对照组比较.细胞增殖、侵袭、迁移与管腔形成比较 结果见表 和图 与模型对照组比较、处理明显提高了 标记的新生 比例(.)与正常对照组比较经 处理后的 发生小室侵袭的细胞数量显著减少与模型对照组比较各药物处理组小室侵袭细胞数量明显增加(.或.)同时与模型对照组比较 处理组细胞迁移能力明显提高(.)组细胞迁移能力较模型对照组具有上升趋势 各药物处理组形成的小管的总长度较模型对照组明显增加(.的潜在靶点有 个潜在作用靶点 个其中 的潜在靶点有 个(图)、潜在靶点与脑缺血/血管新生关键靶点之间共有交集靶点 个(图)其中 单独作用靶点 个分别是、基质金属蛋白酶()、选 择 素 ()、转化生长因子 受体()、丝氨酸苏氨酸蛋白激酶()单独作用靶点 个分别是、清蛋白()、蛋白 受体()、血管紧张肽原酶()、膜蛋白()、血管内皮生长因子受体(图 组细胞凋亡形态(染色).()表 组细胞 /双染结果比较./组别细胞凋亡率细胞晚期凋亡率正常对照组.模型对照组.组.组.组.与正常对照组比较.与模型对照组比较.与模型对照组比较.)、丝裂原活化蛋白激酶()、共同作用靶点 个分别是 激酶()、半胱天冬酶()、甲状腺结合蛋白()、雌激素受体()、过氧化物酶体增生激活受体()对、潜在靶点与脑缺血/血管新生的 个交集靶点进行 通路富集分析 其结果涉及 信号通路、信号通路、信号通路、信号通路、肿瘤坏死因子信号通路、信号通路等 条信号途径(.)值倒序排名前.机械性损伤细胞.晚期凋亡细胞或者坏死细胞.阴性正常细胞.早期凋亡细胞图 组细胞 /双染检测结果./表 、及 对缺氧损伤 增殖、侵袭、迁移与管腔形成的影响.组别 标记的新生 比例/小室侵袭细胞数量/个细胞迁移能力/小管总长度/正常对照组.模型对照组.组.组.组.与正常对照组比较.与模型对照组比较.与模型对照组比较.医药导报 年 月第 卷第 期.正常对照组.模型对照组.组.组.组图 、及 对 缺氧损伤后原代 增殖、侵袭、迁移与管腔形成的影响().()的条目见图 对、潜在靶点与脑缺血/血管新生的 个交集靶点进行 功能注释分析获得生物过程()相关条目 个(.)主要涉及细胞迁移的正调控(:)、对含氧化合物的反应(:)、细胞增殖的调控(:)、伤口愈合(:)等方面细胞组成()相关条目 个(.)主要涉及膜筏(:)、质膜(:)、小窝(:)、细胞质(:)等方面分子功能()相关条目 个().()红色节点代表、共同作用靶点蓝紫色节点代表 单独作用靶点绿色节点代表 单独作用靶点 圆圈半径大小与靶点蛋白度值大小成正比网络扣除了度值为 的节点图 天麻素、薯蓣皂苷元预测靶点与脑缺血/血管新生关键靶点的 网络 ./医药导报 年 月第 卷第 期图 通路富集及 功能注释分析结果.图 分子对接结果.性(:)等方面 功能各分类下 值倒序排名前 的条目见图.分子对接结果在 个交集蛋白中蛋白()、()、()、()、()、()、()、()、()、()在 网络中度值排名前 根据与、的匹配关系使上述 个蛋白分别与、进行分子对接 对接结果见图、分 别 为 蛋 白、的阳性小分子药物 参考各蛋白与其阳性小分子药物的对接分数 与、蛋白具有良好的结合活性 与、蛋白具有良好的结合活性 各蛋白与药物小分子之间的对接模式图见图 讨论血管生成主要包括血管基底膜及细胞外基质的降解内皮细胞的迁移、增殖管状结构形成平滑肌细胞和周细胞的附着等过程 促进脑缺血后血管新生可以增加脑组织微血管密度并且改善病灶局部微循环从而促进神经功能恢复 本课题组前期研究发现 可显著促进微血管缺失斑马鱼血管新生 能够通过对大鼠神经运动功能及神经损伤的修复升高血管超氧化物歧化酶及一氧化氮水平对缺血性脑卒中具有治疗作用 中药组方优化设计是近年来出现的配伍研究新方法该设计从复方药效物质出发具有药理作用明确、作用靶位相对清楚、对病证的针对性更强、组分质量可控、有利于实现定量分析等众多优点 本研究从细胞水平上探究、对缺氧损伤 的保护作用以及对脑缺血发生后血管 图 靶点蛋白与药物小分子的对接模式.新生的影响 存在于细胞质中当细胞膜受损时 会释放到培养液中释放出的 稳定存在因此检测培养基中 含量可间接反映死细胞和受损细胞数量 本实验 组的 含量较模型对照组下降说明 对 处理的缺氧损伤 具有保护作用 炎症细胞因子 广泛参与脑缺血后组织破坏、水肿形成等多种病理损伤过程、及 组表达均显著降低说明其具有一定的抗炎作用 是重要的氧自由基清除剂能够清除由脑损伤引起的过量 组 活力显著高于模型对照组且 含量呈下降趋势说明 具有一定的抗氧化活性 染色、/双染表明该组分对缺氧损伤 细胞具有抗凋亡作用 通过 标记、小室侵袭、细胞划痕、小管形成实验可看出该组分可促进 增殖并可提高细胞侵袭、迁移和小管结构形成医药导报 年 月第 卷第 期能力这表明在细胞水平上、及 具有一定程度的促进血管新生作用 通路富集显示、可能通过作用于、等信号通路调控脑缺血后血管新生 是机体调控血管新生的关键通路 和 属于 信号通路的下游信号通路 缺氧诱导产生的 可激活下游靶基因释放到细胞外的 通过结合 细胞表面的()受体进而调控 信号通路 蛋白可能是 的潜在靶点、可能通过作用于()蛋白调节下游 信号通路促进细胞增殖同时使得血管通透性增加促进细胞迁移、分别是、的潜在作用靶点、可能通过调节 信号通路提高缺氧损伤 细胞存活率 分子对接结果显示、分别与、及、蛋白具有良好的结合活性 蛋白参与负责执行细胞凋亡的半胱天冬酶()的激活级联响应氧化应激并抑制 促进凋亡细胞表面的磷脂酰丝氨酸暴露 可抑制介导的炎症反应 即凝血因子在血液稳态、炎症和伤口愈合中发挥作用 在细胞外基质的局部蛋白水解和内皮细胞迁移中起重要作用对神经血管重塑具有重要意义 具有舒张血管作用 作为、和 的细胞表面受体介导 和 信号通路的激活在血管生成、血管发育和血管通透性的调节中起重要作用综上所述本研究通过体外细胞实验、网络药理学和分子对接技术表明 和低浓度 均可提高正常及缺氧损伤 细胞活力具有抗炎、抗氧化和抗凋亡活性可降低 缺氧损伤、及 可促进 增殖、侵袭、迁移以及小管样结构形成具有一定的促进血管新生作用 其作用机制可能与其作用于、等蛋白调控/等信号通路促进血管新生有关 本实验药效学研究结果未能体现 对缺氧损伤 具有明显的保护作用、组合使用的药效也并没有优于单用 因此 给药剂量与组分配比还需要进一步研究与优化参考文献 .:.():.张然田浩林王丽婷等.静脉溶栓及血管内治疗急性脑梗死的国内研究进展.中华全科医学():.:.():.李燕田铸徐梦林等.缺氧对大鼠脑微血管内皮细胞增殖和凋亡的影响及其机制研究.现代生物医学进展():.():.罗斌王文瑄王江等.探讨概率神经网络在中药有效组分丹红配伍规律研究中的应用.中医药学报():.张明烁叶田园祝娜等.天麻素与薯蓣皂苷元最佳配伍比例筛选及对 缺氧/复氧损伤的保护机制.医药导报():.:.():.:.程阳阳.天麻素干预急性脑缺血再灌注损伤及促血管新生的调控机制研究.北京:中央民族大学:.黎艳王世栋黄文川.薯蓣皂苷元对缺血性脑卒中大鼠神经运动功能及 /信号通路调节作用研究.广西医科大学学报():.王琳周荣荣王楠等.源于组方优化设计的民族药研究思路与方法探讨.中华中医药杂志():.张伯礼王永炎.组分配伍研制现代中药的理论与实践:方剂关键科学问题的基础研究.沈阳:辽宁科学技术出版社:.():./.():.():.():./.():.():.():.():.拔脓生肌软膏的药效学及皮肤安全性评价范华娜邹国发陶曙红郭丽冰尹永芹陈景胜陈艳芬(广东药科大学中药学院广州)摘 要 目的 考察拔脓生肌软膏()治疗皮肤感染性创面的药理学作用并初步评价其皮肤安全性为进一步研发和安全应用提供参考 方法 采用无特定病原体()级小鼠和大鼠建立金黄色葡萄球菌诱导的细菌性感染皮肤创面模型随机分为基质组 小、中、大剂量组龙珠组百多邦组给予相应药物涂抹后考察 对大、小鼠细菌性皮肤感染创面的治疗作用主要观察创面愈合率、创面病理形态、皮肤细菌逆培养细菌含量、皮肤创面组织中羟脯氨酸以及大鼠皮肤创面组织中白细胞介素()及肿瘤坏死因子()的含量采用小鼠扭体及耳肿胀实验考察 的抗炎镇痛作用采用皮肤刺激性实验和过敏性实验考察 对新西兰兔、豚鼠皮肤给药的安全性 结果与基质组比较 治疗后能显著促进皮肤创面愈合改善创面组织病理形态显著增加皮肤组织中羟脯氨酸含量抑制创面感染部位的细菌生长抑制炎症降低、的含量(.或.)大剂量能显著抑制小鼠耳肿胀(.)中、大剂量均能显著减少扭体次数(.或.)对新西兰兔、豚鼠皮肤实验结果显示没有明显的刺激性和过敏性安全性良好 结论 具有一定的抗炎镇痛及促进皮肤创面愈合作用该制剂符合中药外用软膏的安全性要求关键词 拔脓生肌软膏抗菌作用抗炎作用镇痛作用创面愈合安全性中图分类号.文献标识码 文章编号()./.开放科学(资源服务)标识码()()().()()().(.).(.)(.).医药导报 年 月第 卷第 期