鼠伤寒沙门菌PipD蛋白结构及抗原表位的生物信息学分析.pdf

生物信息学第 37 卷第 4 期医学信息Vol.37 No.42024 年 2 月Journal of Medical InformationFeb.2024基金项目：1.国家自然科学基金资助项目（编号：31900116）；2.河南省科技攻关项目（编号：212102310897）；3.河南省医学科技攻关联合共建项目（编号：LHGJ20200602）；4.河南省自然科学基金项目（编号：232300421289）作者简介：宋晓蕊（1988.10-），女，河南孟州人，博士，主管技师，主要从事鼠伤寒沙门菌致病机理研究通讯作者：李利锋（1989.10-），女，山东莘县人，博士，助理研究员，主要从事感染性病原致病机理研究鼠伤寒沙门菌 PipD 蛋白结构及抗原表位的生物信息学分析宋晓蕊1袁2袁刘玉春1袁丁 聪1袁贾 蕊1袁李瑞静1袁马嘉悦1袁李利锋1渊郑州大学附属儿童医院河南省儿童感染性疾病国际联合实验室1袁耳鼻咽喉头颈外科2袁河南 郑州450000冤摘要院目的用生物信息学方法预测分析沙门菌PipD蛋白的结构和抗原表位袁为沙门菌相关疾病的诊疗和疫苗的研发提供理论依据遥方法通过NCBI数据库获得沙门菌典型致病血清型院鼠伤寒沙门菌渊Salmonella typhimurium冤ATCC 14028S标准菌株STM14_1240基因的核苷酸序列及其编码蛋白PipD的氨基酸序列袁运用ProtParam尧ProtScale尧SignalP 4.1 Server尧TMHMMServerv.2.0尧Netphos 3.1 Server尧NetNGlyc-1.0尧NCBI BLAST尧SOMPA尧SWISSMODEL尧ABCpred尧SYFPEITHI和UniProt等生物信息学工具分别对鼠伤寒沙门菌PipD蛋白的理化性质尧亲疏水特性尧信号肽尧跨膜区尧磷酸化位点尧糖基化位点尧结构域尧二级结构尧三级结构尧B细胞抗原表位尧T细胞抗原表位及蛋白同源性进行预测分析遥结果PipD是由520个氨基酸组成的亲水蛋白袁分子式为C2608H3963N721O780S16袁理论相对分子质量为58.4 kDa袁理论等电点为7.34袁脂溶指数为67.81袁平均亲水系数为-0.508遥PipD蛋白无信号肽序列袁在其3557氨基酸残基位置含1个长度为23个氨基酸的跨膜螺旋袁属于跨膜蛋白遥预测PipD蛋白含有57个磷酸化位点和1个糖基化位点遥 PipD蛋白二级结构以无规则卷曲居多袁占36.35%袁其次为琢螺旋尧茁折叠尧茁转角分别占15.77%尧3.27%尧44.62%遥预测PipD蛋白可形成22个B细胞优势抗原表位袁17个CTL细胞优势表位和30个Th细胞优势表位遥 PipD蛋白与人类基因BCLA3尧SCRN2和MRPL4的编码蛋白同源性分别为29%尧24.6%和31.8%袁同源性较低遥结论PipD蛋白为亲水蛋白袁热稳定性好曰存在多个B细胞和T细胞抗原表位袁与人类宿主蛋白同源性低袁不易发生交叉免疫反应袁可作为鼠伤寒沙门菌血清学诊断和疫苗候选蛋白遥关键词院鼠伤寒沙门菌曰PipD曰生物信息曰蛋白结构曰抗原表位中图分类号院S852.6文献标识码院ADOI院10.3969/j.issn.1006-1959.2024.04.001文章编号院1006-1959渊2024冤04-0001-07Bioinformatics Analysis of PipD Protein Structure and Epitope of Salmonella Typhimurium PipDSONG Xiao-rui1,2,LIU Yu-chun1,DING Cong1,JIA Rui1,LI Rui-jing1,MA Jia-yue1,LI Li-feng1(Henan International Joint Laboratory of Childrens Infectious Diseases1,Department of Otorhinolaryngology Head and Neck Surgery2,Childrens Hospital Affiliated to Zhengzhou University,Zhengzhou 450000,Henan,China)Abstract：Objective To predict and analyze the structure and antigenic epitopes of Salmonella PipD protein by bioinformatics methods,and to provide atheoretical basis for the diagnosis and treatment of Salmonella-related diseases and the development of vaccines.Methods The nucleotide sequence ofSalmonella typhimurium ATCC 14028S standard strain STM14_1240 gene and the amino acid sequence of its encoded protein PipD were obtained byNCBI database.Bioinformatics tools such as ProtParam,ProtScale,SignalP 4.1 Server,TMHMM Serverv.2.0,Netphos 3.1 Server,NetNGlyc-1.0,NCBIBLAST,SOMPA,SWISSMODEL,ABCpred,SYFPEITHI and UniProt were used to predict and analyze the physicochemical properties,hydrophilicityand hydrophobicity,signal peptide,transmembrane region,phosphorylation site,glycosylation site,domain,secondary structure,tertiary structure,Bcell epitope,T cell epitope and protein homology of Salmonella typhimurium PipD protein.Results PipD was a hydrophilic protein composed of 520amino acids,the molecular formula was C2608H3963N721O780S16,the theoretical relative molecular mass was 58.4 kDa,the theoretical isoelectric point was7.34,the fat solubility index was 67.81,and the average hydrophilic coefficient was-0.508.PipD protein had no signal peptide sequence,and containeda transmembrane helix with a length of 23 amino acids at its 35-57 amino acid residues,which belonged to transmembrane protein.It was predictedthat PipD protein contained 57 phosphorylation sites and 1 glycosylation site.The secondary structure of PipD protein was mostly random coil,accounting for 36.35%,followed by 琢-helix,茁-sheet and 茁-turn,accounting for 15.77%,3.27%and 44.62%,respectively.It was predicted that PipDprotein could form 22 B cell dominant epitopes,17 CTL cell dominant epitopes and 30 Th cell dominant epitopes.The homology of PipD protein withhuman genes BCLA3,SCRN2 and MRPL4 was 29%,24.6%and 31.8%,respectively.Conclusion PipD protein is a hydrophilic protein with goodthermal stability.There are multiple B cell and T cell epitopes,which have low homology with human host proteins and are not prone to cross-immune reactions.It can be used as a candidate protein for serological diagnosis and vaccine of Salmonella typhimurium.Key words：Salmonella typhimurium;PipD;Bioinformatics;Protein structure;Antigenic epitope窑生物信息学窑1生物信息学第 37 卷第 4 期医学信息Vol.37 No.42024 年 2 月Journal of Medical InformationFeb.2024沙门菌（Salmonella）是一种重要的人畜共患革兰氏阴性肠道病原菌，主要通过污染的水源和食物传播，可感染人和猪、牛等多种哺乳动物，在宿主中引起自限性肠胃炎和菌血症等多种疾病。有关沙门菌感染的报道逐年增多，加重了预防和控制的负担1，2。沙门菌引起系统性疾病的两个关键阶段包括侵袭肠上皮细胞和在巨噬细胞内生存复制。沙 门 菌 的 致 病 能 力 主 要 依 赖 于 沙 门 致 病 岛（Salmonella pathogenicity islands，SPI）编码的毒力基因，SPI-1 和 SPI-2 是沙门菌两个最重要的致病岛3，4。由 SPI-1 编码的三型分泌系统（type threesecretion system，T3SS）-1 是沙门菌入侵肠道上皮细胞所必需的5，6；由 SPI-2 编码的三型分泌系统T3SS-2 是沙门菌在巨噬细胞中复制和系统性感染所必需的7，8。基于沙门致病岛编码基因在沙门菌致病性中的重要作用，本研究以沙门菌典型致病血清型：鼠伤寒沙门菌 ATCC 14028S 菌株为材料，应用多种生物信息学工具对鼠伤寒沙门菌 SPI-59上一个与鼠伤寒沙门菌引起的肠道炎症相关的毒力基因STM14_1240 的编码蛋白 PipD10-12进行预测分析，进一步明确其结构、抗原表位以及在鼠伤寒沙门菌致病过程中的可能功能，为沙门菌相关疾病的诊疗和疫苗研发提供理论依。1资料与方法1.1 PipD 蛋白的基因组信息 通过 NCBI GeneBank数据库获取鼠伤寒沙门菌（Salmonella enterica sub原sp.enterica serovar typhimurium）ATCC14028S 标准菌株 STM14_1240 基因的核苷酸序列及其编码蛋白PipD 的氨基酸序列。PipD 蛋白在 GenBank 数据库中的基因序列登录号为 NC_016856.1，蛋白氨基酸序列登录号为 WP_000760228.1。PipD 蛋白编码基因 STM14_1240 全长 1563 bp，位于鼠伤寒沙门菌14028S 菌株基因组的 37297223731284 位置，编码520 个氨基酸，GenBank 数据库中 PipD 蛋白的FASTA 格式氨基酸序列如下：1.2 PipD 蛋白的基本理化性质分析 运用 Expasy-ProParam 工具分析 PipD 蛋白的基本理化学性质；使用 Expasy-ProScale 工具分析 PipD 蛋白的亲疏水特性。1.3 PipD 蛋白的信号肽、跨膜区、磷酸化位点、糖基化位点和保守域分析 使用 SignalP4.1 Server 工具预测分析 PipD 蛋白的信号肽序列；使用 TMHMMServerv.2.0 工具预测 PipD 蛋白的跨膜区；使用 Net原phos 3.1 Server 工具预测 PipD 蛋白的翻译后磷酸化修饰位点；使用 NetNGlyc-1.0 工具预测 PipD 蛋白的糖基化位点；应用 NCBI BLAST 软件预测 PipD 蛋白的保守域。1.4 PipD 蛋白的结构预测 使用 SOPMA 工具分析PipD 蛋白的二级结构及组成；使用 SWISS MODEL工具对 PipD 蛋白的三级结构进行分析和建模。1.5 PipD 蛋白的抗原表位预测使用 ABCpred 和SYFPEITHI 工具预测 PipD 蛋白的 B 细胞和 T 细胞抗原表位。1.6 PipD 蛋白的同源性分析 使用 UniProt 网站分析 PipD 蛋白的同源性。2结果2.1 PipD 蛋白的基本理化性质分析 使用 Expasy-ProParam 工具对 PipD 蛋白的基本理化性质进行预 测 分 析，结 果 显 示 PipD 蛋 白 的 分 子 式 为C2608H3963N721O780S16，由 8088 个原子组成，理论相对分子质量为 58.4 kDa，理论等电点为 7.34。在 PipD 蛋白的氨基酸组成中，丙氨酸（Ala）、苏氨酸（Thr）、丝氨酸（Ser）占比较高，分别占 9.8%、7.5%和 6.5%；其中带负电荷的氨基酸（天冬氨酸垣谷氨酸）和带正电荷的氨基酸（精氨酸垣赖氨酸）数量均为 47 个。PipD 蛋白在哺乳动物网织红细胞体外实验中的半衰期为30 h，脂肪族指数为 67.81，不稳定指数为 43.37，为不稳定蛋白。通过 Expasy-ProScale 工具对 PipD 蛋白的亲疏水特性进行分析显示，PipD 蛋白总平均亲水性为-0.508，氨基酸得分最大值为 2.6，最小值为-2.822，属于具有良好亲水性的蛋白，见图 1。MPAKNIAGSITFSVSNPGSIHPIMRYSVGTFMKKYLAFAVTLLGMGKVIACTTLLVGNQASADGSFIIARNEDGSANNAKHKVIHPIAFHQQGEYKAHRNNFSWPLPETAMRYTAIHDFDTNDNAMGEAGFNSAGVGMSATETIYNGRAALAADPYVTKTGITEDAIESVILPVAQSARQGAKLLGDIIEQKGAGEGFGVAFIDSKEIWYLETGSGHQWLAVRLPADSYFVSANQGRLRHYDPNDNANYMASPTLVSFAKKQGLYDPARGEFDFHQAYSQDNKNDTTYNYPRVWTLQHQFNPHLDTVVSEGETFPVFLTPITKISVAAVKNALRNHYQGTSHDPYASHNPQEPWRPISVFRTQESHILQVRPKLPQAIGNVEYIAYGMPSLSVYLPYYQGMRHYQPGDDKGTDRASNDSTYWTFRTLQTLVMQDYNAFAPDVQHAWKTFEQQTAKQQYKMEQSYLRLYASHPKEAQRLLQNFEDKTMQNAQTLARRLTNNIITTMTYRTDMKYHFSSTQP2生物信息学第 37 卷第 4 期医学信息Vol.37 No.42024 年 2 月Journal of Medical InformationFeb.2024图4 PipD蛋白的磷酸化位点预测2.2 PipD 蛋白的信号肽、跨膜区、磷酸化位点、糖基化位点和保守域分析 使用 SignalP 4.1 Server 对 PipD蛋白进行分析得到 D 值为 0.192，表明 PipD 蛋白不含信号肽序列（图 2）。使用 TMHMM Serverv.2.0 工具预测在 PipD 蛋白第 3557 位氨基酸处含有 1 个长度为 23 的跨膜螺旋（图 3）。Netphos 3.1 Server 预测PipD 蛋白有 22 个丝氨酸磷酸化位点、22 个苏氨酸磷酸化位点和 13 个酪氨酸磷酸化位点（图 4）。Net原NGlyc-1.0 预测 PipD 蛋白含有 1 个糖基化位点，位于第 101 位，概率为 63.49%（图 5）。应用 NCBIBLAST 预测 PipD 蛋白包含 PepD 超家族、Ntn-hy原drolase 超家族结构域，属于 PepD 家族蛋白（图 6）。图1 PipD蛋白的疏水性分析图2 PipD信号肽预测图3 PipD蛋白跨膜区预测蛋白跨膜区预测3生物信息学第 37 卷第 4 期医学信息Vol.37 No.42024 年 2 月Journal of Medical InformationFeb.20242.3 PipD 蛋白的结构预测 使用 SOPMA 工具分析显示 PipD 蛋白含 琢 螺旋（Hh）189 个，占 36.35%；茁折叠（Ee）82 个，占 15.77%；茁 转角（Tt）17 个，占3.27%；无规则卷曲（Cc）232 个，占 44.62%（图 7）。运用 Expasy-SWISS MODEL 工具预测 PipD 蛋白三级结构并进行同源建模，模型 GMQE 评分为0.65，QMEAN 值为 0.68，表明该模型预测效果较好（图 8）。图5 PipD蛋白的糖基化位点预测图6 PipD蛋白的保守结构域分析图7 PipD蛋白二级结构预测4生物信息学第 37 卷第 4 期医学信息Vol.37 No.42024 年 2 月Journal of Medical InformationFeb.20242.4 PipD 蛋白的抗原表位预测使用 ABCpred 软件预测 PipD 蛋白中存在 22 个潜在的 B 细胞抗原表位（分值跃0.8），见表 1。使用 SYFPEITHI 软件预测 PipD 蛋白含有 17 个限制性 CTL 表位（分值跃20）和 30 个限制性 Th 表位（分值跃20），见表2、表 3。2.5 PipD 蛋白的同源性分析 在 UniProt 网站中输入 PipD 蛋白的 FASTA 格式氨基酸序列，物种选择Homo sapiens 对 PipD 蛋白的同源性进行分析发现PipD 蛋白与人类基因 BCLA3、SCRN2 和 MRPL4编码的蛋白同源性分别为 29%、24.6%和 31.8%（图 9），同源性较低，不易发生交叉免疫反应，表明其免疫原性较好，可作为设计疫苗的潜在蛋白。注：A：飘带模型；B：表面模型图8 PipD蛋白三级结构同源建模AB顺序1234567891011抗原表位序列GSFIIARNEDGSANNADTVVSEGETFPVFLTPYQPGDDKGTDRASNDSNHYQGTSHDPYASHNPAMRYTAIHDFDTNDNAAGFNSAGVGMSATETITMTYRTDMKYHFSSTQYQGMRHYQPGDDKGTDHQQGEYKAHRNNFSWPASNDSTYWTFRTLQTLHILQVRPKLPQAIGNV氨基酸位置647930532040441933535011012512914450451939841390105415430366381分值0.950.940.930.920.920.910.870.860.850.850.84表1 PipD蛋白的B细胞抗原表位顺序1213141516171819202122抗原表位序列PRVWTLQHQFNPHLDTDSKEIWYLETGSGHQWSVYLPYYQGMRHYQPGSNPGSIHPIMRYSVGTTNNIITTMTYRTDMKYTFEQQTAKQQYKMEQSQGRLRHYDPNDNANYMPIMRYSVGTFMKKYLAIYNGRAALAADPYVTKDYNAFAPDVQHAWKTFHDPYASHNPQEPWRPI氨基酸位置29130620421939240715304985134484632352502237144159434449342357分值0.840.840.830.830.820.820.820.820.810.80.8顺序123456789抗原表位序列YLAFAVTLLYIAYGMPSLKLPQAIGNVVIACTTLLVTIYNGRAALAIESVILPVHILQVRPKLLLVGNQASAITEDAIESV氨基酸位置354338339137338148561431511661743663745462162170分值272625242424232222表2 PipD蛋白限制性CTL细胞表位顺序1011121314151617抗原表位序列ITKISVAAVGMPSLSVYLVTLLGMGKVTLLGMGKVIKLLGDIIEQRLPADSYFVYNYPRVWTLWTFRTLQTL氨基酸位置32132938739540484149183191223231288296422430分值22222121212121215生物信息学第 37 卷第 4 期医学信息Vol.37 No.42024 年 2 月Journal of Medical InformationFeb.20243讨论沙门菌是威胁人类健康的一个重要公共卫生问题，每年引起约 9300 万例感染13，导致约 15 万人死亡14，其中，鼠伤寒沙门菌是引发感染的最常见血清型1。毒力因子是近年来沙门菌研究的热点问题，探究沙门菌毒力蛋白的功能，提高沙门菌感染相关疾病的防治水平具有重要的公共卫生意义。沙门菌的致病性与沙门致病岛编码的毒力基因有关15，STM14_1240（pipD）是鼠伤寒沙门菌 SPI-5上一个重要的毒力基因，编码 T3SS-1 的效应蛋白PipD，与鼠伤寒沙门菌引起肠道炎症相关10。通过检测 pipD 等毒力基因在鼠伤寒沙门菌分离株中的存在情况可评估沙门菌的潜在毒力及其导致持续感染的风险16，17。生物信息学分析通常基于生物信息数据库，通过生物信息学工具对目标基因和蛋白的结构和功能进行预测和分析，为致病机制研究和疫苗研发提供理论依据18。本研究通过 NCBI GeneBank 数据库获取 PipD蛋白的氨基酸序列及其编码基因的核苷酸序列，应用生物信息学工具预测和分析 PipD 蛋白的结构特性和功能，结果显示该蛋白理论相对分子质量为58.4 kDa，理论等电点为 7.34。在 PipD 蛋白的氨基酸组成中，脂肪族氨基酸如丙氨酸、苏氨酸和丝氨酸等所占比例较高，分别为 9.8%、7.5%和 6.5%，提示该蛋白蛋白热稳定性较好。PipD 蛋白的半衰期为30 h，提示该蛋白作为免疫抗原可在体内发挥稳定持久作用。亲疏水性分析显示 PipD 蛋白有多个较强的亲水区，有利于抗原表位的形成19。生物信息学分析显示，PipD 蛋白不含信号肽，在该蛋白第 3557 氨基酸位置含 1 个长度为 23 个氨基酸的跨膜螺旋，其跨膜转运机制还不清楚。PipD蛋白存在多个潜在磷酸化位点，提示 PipD 蛋白可能受到磷酸化调控，参与细胞信号转导过程。预测PipD 蛋白含有 1 个糖基化位点，提示该蛋白可作潜顺序123456789101112131415抗原表位序列DSYFVSANQGRLRHYEFDFHQAYSQDNKNDGETFPVFLTPITKISDSTYWTFRTLQTLVMYWTFRTLQTLVMQDYQHAWKTFEQQTAKQQPGSIHPIMRYSVGTFYTAIHDFDTNDNAMGSVILPVAQSARQGAKGFGVAFIDSKEIWYLYPRVWTLQHQFNPHLWRPISVFRTQESHILQTLVMQDYNAFAPDVMKKYLAFAVTLLGMGDGSFIIARNEDGSAN氨基酸位置227241271285311325418432421435443457173111312716918319721129030435436842844232466377分值282828282828262626262626262222表3 PipD蛋白限制性Th细胞抗原表位顺序161718192021222324252627282930抗原表位序列QGEYKAHRNNFSWPLAMRYTAIHDFDTNDNEAGFNSAGVGMSATEGEGFGVAFIDSKEIWEIWYLETGSGHQWLANANYMASPTLVSFAKHQAYSQDNKNDTTYNTYNYPRVWTLQHQFNFPVFLTPITKISVAAQEPWRPISVFRTQESISVFRTQESHILQVRYLPYYQGMRHYQPGDMQDYNAFAPDVQHAWYNAFAPDVQHAWKTFKQQYKMEQSYLRLYA氨基酸位置92106110124128142195209207221246260275289287301314328351365357371394408432446435449455469分值222222222222222222222222222222图9 PipD蛋白的同源性预测6生物信息学第 37 卷第 4 期医学信息Vol.37 No.42024 年 2 月Journal of Medical InformationFeb.2024在标志物用于鼠伤寒沙门菌感染的诊断。二级结构分析显示，PipD 蛋白中无规则卷曲所占比例较大，其次为 琢-螺旋、茁-折叠和 茁-转角，表明该蛋白具有良好的抗体嵌合性，易形成抗原表位。三级结构分析显示 PipD 蛋白的无规则卷曲大多位于蛋白质外层区域，提示 PipD 蛋白易在空间构象上形成抗原表位，有利于抗原和抗体相结合。抗原表位是抗原分子上能与相应抗体或淋巴细胞的表面受体结合从而激活机体免疫应答反应的特殊化学集团20。ABCpred 软件和 SYFPEITHI 软件预测显示 PipD 蛋白共有 22 个 B 细胞优势表位，17 个 CTL细胞优势表位和 30 个 Th 细胞优势表位，且与人类宿主蛋白同源性较低，不易发生交叉免疫反应，表明该蛋白免疫原性好，可作为潜在的鼠伤寒沙门菌疫苗候选蛋白，也可用于血清学诊断以提高沙门菌感染检查的灵敏度和特异性。综上所述，PipD 蛋白为亲水性蛋白，含有 B、T细胞抗原表位，即具有抗原性。本研究通过多种生物信息学工具对 PipD 蛋白的理化性质和结构功能进行预测和分析，可为 pipD 在鼠伤寒沙门菌致病过程中的可能功能提供更为深入的信息，为研发有效的鼠伤寒沙门菌疫苗提供新的靶点，也为研究鼠伤寒沙门菌的致病机理提供理论参考。参考文献院1Fierer J.Invasive Non-typhoidal Salmonella(iNTS)InfectionsJ.Clin Infect Dis,2022,75(4):732-738.2Sun H,Wan Y,Du P,et al.The Epidemiology of MonophasicSalmonella Typhimurium J.Foodborne Pathog Dis,2020,17(2):87-97.3Dos SA,Ferrari RG,Conte-Junior CA.Virulence Factors inSalmonella Typhimurium:The Sagacity of a BacteriumJ.CurrMicrobiol,2019,76(6):762-773.4Hume PJ,Singh V,Davidson AC,et al.Swiss Army Pathogen:The Salmonella Entry Toolkit 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