胶原蛋白交联方法及其研究进展.pdf

印染（2024 No.3）胶原蛋白交联方法及其研究进展王欣慧1，2，崔鹏飞2，凡孝菊1，翟源心1，乐浩1，李解1，储筠1()1.江苏创健医疗科技股份有限公司，江苏 常州 213000；2.常州大学药学院，江苏 常州 213164摘要：胶原蛋白具有优异的生物相容性、高效的生物降解性、低免疫原性以及胶原宿主和组织之间的协调性，但其机械性能和抗酶解速率都较低，通过对胶原蛋白进行交联，以提高其结构的稳定性，分析了物理交联、化学交联和生物交联制备的胶原蛋白材料的优缺点，并展望了其未来的发展方向。关键词：胶原蛋白；交联；生物材料；组织工程中图分类号：TS199；R318.08文献标志码：ADOI：10.3969/j.yinran.202403009Collagen crosslinking methods and their research progressWANG Xinhui1,2,CUI Pengfei2,FAN Xiaoju1,ZHAI Yuanxin1,LE Hao1,LI Jie1,CHU Yun1 1.Jiangsu Trautec Medical Technology Co.,Ltd.,Changzhou 213000,China;2.School of Pharmacy,Changzhou University,Changzhou 213164,ChinaAbstract:Collagen has excellent biocompatibility,efficient biodegradability,low immunogenicity,and coordination between collagen host and tissue.However,in many cases,its mechanical properties and resistance to enzymatic digestion are low.Collagen-modified crosslinking technologies are adopted.The advantages and disadvantages of collagen materials prepared by physical cross-linking,chemical cross-linking and biological cross-linking are analyzed,and the research fields in future are prospected.Key words:collagen;crosslinking;biomaterials;tissue engineering胶原蛋白是最重要的天然生物聚合物之一，是脊椎动物生物体中最丰富的蛋白质，它构建了皮肤、肌腱、软骨和骨组织、血管壁和基质。鱼皮、猪蹄、牛蹄筋和猪软骨中也富含胶原蛋白。作为原始细胞外组分，它构成了人类有机体近33%的蛋白质。根据其特殊的生物学和物理化学性质，可将其分为结构和功能研究两个学科。由于遗传学和分子生物学的发展，目前已知的胶原有29种，其结构是由氢键连接的链组合的三维三螺旋。胶原的共同特点是存在极性氨基酸，如精氨酸、赖氨酸、谷氨酸和天冬酰胺酸1。紧靠三螺旋结构域的胶原大分子也有端肽（非螺旋片段）存在于胶原颗粒的末端。胶原蛋白分子连接在一起形成纤维，具有柔性、稳定性和对组织的抗性等性能，被广泛应用于食品、化妆品和医疗保健行业等领域。胶原基生物材料的全球发展趋势围绕着智能、多功能、环保和高端医疗设备。“健康中国2030”规划纲要2旨在应对中国对高端诊疗设备和生物医学材料日益增长的需求依赖进口的挑战，为中国胶原基生物材料的发展提供了巨大的空间。2021年，美国、欧盟和日本胶原基生物材料分别占全球市场的38%、27%和10%，而中国仅占8%。因此，自主开发高精尖端胶原基生物材料迫在眉睫。由于胶原蛋白对外界的高温或酶的耐久性较低，因此需要稳定其结构。改善胶原结构的方法有物理方法、化学方法和生物方法。众所周知，这一过程需要物理诱导或化学试剂促使分子内或分子间化学键的形成。物理交联可避免毒性物质进入胶原蛋白分子内，但形成的分子结构稳定性差，交联度较低。化学试剂则可以通过官能团（氨基和羧基）与胶原相互作用形成交联，提高交联度。然而，化学试剂通常存在有毒或生物不相容等问题。生物交联胶原具有较低的细胞毒性、优异的细胞相容性，且不易产生胶原变性，但其价格昂贵，交联强度低。目前，胶原交联正在向安全、环保、可控的方向发展。越来越多的新方法正在逐步取代传统交联方法，使胶原材料更好地应用于组织修复、创面止血、组织工程、烧烫伤的治疗、美容等领域。1物理交联法物理交联技术是通过物理诱导改善胶原蛋白性能，其不添加任何化学试剂，从而有效避免有毒化学物质进入胶原蛋白分子内。但是物理交联获得的产品存在均匀性差、交联度低的问题3，研究人员希望通过与其他方式联合运用，比如紫外线照射、重度脱水法等来提高胶原基材料的性能4-51.1紫外线照射法紫外线照射下的胶原蛋白溶液会产生分子间交联，交联反应主要作用于胶原中的苯丙氨酸、酪氨酸等芳香残基核上的未配对基团，使其黏度增加而形成凝胶。目前应用的紫外光照射工艺，是将胶原蛋白材料置于铝箔上，在距离20 cm的高度，用波长254 nm的紫外灯照射15 h6。由于光交联技术使胶原蛋白中产生了不同的化学键和带电基团，改变了胶原蛋白的性能。SUH等7-8利用紫外光诱导交联反应制备了多孔胶原膜，通常用于修复皮肤损伤，因为这种多孔材料能够增加成纤维细胞从伤口边缘的迁移，使细胞形成新的收稿日期：2023-11-25；修回日期：2024-02-20基金项目：常州市科技项目（CE2022504、CQ20230004、CE20235002）。作者简介：王欣慧（1999），女，硕士研究生，研究方向为重组胶原蛋白与生物医学检测。E-mail：。通信作者：储筠，男，博士，研究方向为生物材料研发、重组胶原蛋白系列原材料开发。E-mail：。92胶原蛋白交联方法及其研究进展印染（2024 No.3）ECM（细胞外基质）。+&1&+1+&+&RO+&1&1+&+&RO+&RO+1&+&RO2+&RO+1&+&RO2KY&RO+1&+&RO2+1+1&ROKY11&RO2&RO 1+1+1&RO2&RO+2目前，一种新的组合方式吸引了许多研究人员的注意，这种方法涉及紫外光与光活化剂之间的反应，从而在胶原纤维内产生分子内或分子间的交联9，如紫外线与核黄素交联胶原可用于治疗眼组织10-11。1.2重度脱水法（DHT）重度脱水法是指将胶原分子暴露在真空的高温（90）条件下，使水分子被移除，胶原蛋白之间形成分子内连接（酰胺键）11。&+&RO2&RO1+&RO&+12&RO +2此外，赖氨酸和丙氨酸之间的相互作用还可以形成一些额外的交联。由于DHT不需要任何化学试剂，所以该过程没有细胞毒性，还能提供杀菌作用12。需要强调的是，温度升高可能会引起胶原变性，这涉及到三级结构重新排列。这些结构变化可导致蛋白质生物活性的丧失，然而，从另一方面来说，变性可以减少炎症的发生和增加细胞在体内的附着13。DHT交联胶原还被应用于制备胶原-糖胺聚糖（Coll-Glyc）材料。OBRIEN等14在一定温度下采用DHT交联反应得到特定变性水平的支架。由于温度诱导形成的胶原交联既不会在体内产生任何可能具有细胞毒性的副产物，又可提高胶原纤维的收缩温度，降低胶原纤维在酶溶液中的溶解度，因此这一过程仍然是目前许多科学家研究的主题。2化学交联法化学交联是使交联剂中的某些基团与胶原蛋白分子中的羧基或羰基发生反应。化学交联相比较于物理交联具有更好的均一性和更高的交联度，对于胶原的性能调节也更为有效。但是，某些化学试剂可能存在毒性或生物不相容性，因此，进一步探索更多无毒无害、生物相容性好的化学交联剂是未来发展的主力。2.1戊二醛（GA）GA-蛋白质交联是通过赖氨酸或羟赖氨酸残基的-胺基团与GA的醛基反应形成的15。有研究表明，与GA醛基相互作用的胶原官能团还包括组氨酸的咪唑和精氨酸的胍基16。但胶原中组氨酸和精氨酸的含量通常远低于赖氨酸和羟赖氨酸的含量，因此主要反应是GA的醛基与赖氨酸或羟赖氨酸的-胺基团之间的相互作用。+22&RO 1+11&RO&RO以戊二醛作为交联剂的优点是力学性能很好，抗生物降解能力强。缺点是毒性、炎症、外源体响应问题。HUANG等17-18制备了人工瓣膜，瓣叶是由在戊二醛缓冲液中交联的牛心包组织激光切割而成，用于替换有病变的、受损的、功能失调的自体或人工主动脉瓣膜。PARK等19制备了弹性软骨，戊二醛处理的异种软骨材料具有来源广、制作简单、可软化塑性、可受压、不变形、易储存运输、植入人体内组织反应轻微等优点，在临床上可用作耳廓再造。2.2京尼平京尼平是从栀子的重要成分环烯醚萜苷（京尼平苷）中提取的化合物20具有抗菌、抗肿瘤和抗炎的特性。京尼平比戊二醛和其他常用的交联剂毒性小很多，作为交联剂的优点是力学性能很好、抗生物降解能力强。缺点是炎症和外源体响应问题。京尼平对含氨基蛋白质的交联活性可能是由于：胺基对京尼平C3原子上赖氨酸和精氨酸的快速亲核攻击，导致京尼平杂环化合物与蛋白质的碱性残基相连；京尼平中酯基团的缓慢亲核取代，产生二级酰胺连接。22+2+22+&RO1+1+&+22&+&RO+&1+22+&RO脊髓损伤通常导致空洞病变，而注射胶原-京尼平复合物可以在损伤部位重建细胞迁移途径，同时最大限度地减少开放性手术带来的附带损伤21。LIU等22-24将其用于治疗进行性近视，发现交联胶原可以增强巩膜，进而抑制近视的进展。成田等25-26确定胶原凝胶能渗透到黏膜下层，可用于治疗胃肠道溃疡。2.3EDC-NHS1-乙基-3-（3-二甲氨基丙基）碳二亚胺（EDC）和N-羟基丁二酰亚胺（NHS）是一种“零长度”的绿色环保交联剂，利用其对生物材料进行化学交联，使得两个分子通过直接共价键（没有任何连接体或间隔物）共轭。11+&+&1+&RO2+211+&+&+1+&2&RO21222+1222&RO21+1+&+&+1+&2&RO 1+&RO&+12&RO122+2利用EDC-NHS交联胶原蛋白，天冬氨酸和谷氨酸的羧酸基93印染（2024 No.3）团之间形成共价键，可赋予胶原蛋白良好的生物相容性和非细胞毒性28，显著提高其理化性质。事实上，EDC激活天冬氨酸或谷氨酸残基的羧酸部分，可形成邻酰基异脲基团。为了防止该基团的水解，利用NHS将邻酰基异脲基团转化为NHS活化的羧酸基团，与胺基发生反应。值得注意的是，EDC不释放到基体中，而是转化为O-1-乙基-3-（3-二甲氨基丙基）-尿素。EDC-NHS作为交联剂的优点是水溶性体系以及低毒性；缺点是会影响细胞在材料上的黏附。靳少锋等28以碳化二酰亚胺为交联剂，制备了止血性能优良的复合胶原海绵材料。该材料呈多孔海绵状，生物相容性良好，有利于血液的吸收与凝固。SUN等29制备了新型抗菌双层复合伤口敷料，结果表明，EDC/NHS交联胶原蛋白基双层复合敷料优于非交联和商业化产品，可刺激伤口愈合，其在28 d的时间内完成深二度烫伤皮肤愈合。2.4双醛淀粉双醛淀粉（DAS）是天然淀粉与高碘酸反应生成的一种大分子醛30。该反应导致C2-C3键断裂，形成两端均带醛基的分子。2222Q&RO 1+222+2+Q1+&RO1+&RODAS毒性极低，可生物降解，并具有抗病毒活性。在交联反应过程中，DAS醛基与胶原蛋白的游离氨基相互作用。胶原蛋白的酶解物与DAS交联产生水凝胶，可用在包装、化妆品和药品方面31。这种材料还显示出良好的血液相容性，因此可以用作伤口敷料或组织工程支架32。SIONKOWSKA等31利用胶原蛋白等与DAS交联，制备了一种3D亲水性材料，可以保留大量的水，并且相互连接。2.5聚阳离子化合物壳聚糖是一种聚阳离子，可以与带负电荷的天然或合成分子如脂类、蛋白质、核酸等相互作用。它们由于形成氢键而互溶，并利用加热、紫外线辐射或戊二醛、聚环氧化合物、单宁酸等试剂进行处理33。胶原和壳聚糖的结合改善了支架的力学和生物学性能，如抗酶降解、抗压强度和吸水程度。而且壳聚糖的加入增强了胶原蛋白的结构，增加了孔径。值得注意的是，胶原-壳聚糖复合材料的溶胀性能取决于交联剂的用量和各组分的质量比34。HIRANO等35制造血液相容性胶原-壳聚糖纤维，他们对复合材料进行了N-酰基衍生化。所得纤维具有抗血栓活性，证实该纤维可用作血管支架39。由于软骨不能再生，设计一种新的方法来解决这个问题至关重要。YAN等37-38设计了 胶原-壳聚糖复合材料被用作支持软骨细胞附着、增殖和分化的多孔支架软骨组织工程支架39-40。赵东锷等41-42使用胶原蛋白-壳聚糖膜为支架体外构建心脏瓣膜，经多次接种犬主动脉壁间质细胞和内皮细胞后，材料表面完全被细胞覆盖，内皮细胞在支架表面不仅可以粘附生长，还能分泌血管活性物质，是一种具有生理功能的心脏瓣膜雏形。2.6己二异氰酸酯（HMDIC）己二异氰酸酯含有两个异氰酸基，它首先作为亲核试剂与胶原蛋白结构中赖氨酸上的-氨基反应生成脲键，随后伯胺残基与游离的异氰酸基团反应进行交联。当pH7时与氨基反应生成取代脲，在pH7时与羟基反应形成氨基甲酸酯衍生物。己二异氰酸酯交联能控制胶原的酶解速率，显著增强其力学性能。&11&22&RO1+&+11+&22+1&RO1+&RONAIMARK等43通过多种科学方法表征HMDIC交联的胶原的热学、力学及生物化学性能，发现其与用戊二醛处理后的结果很类似，并且前者还能降低钙化度。VAN等44-45研究表明其同戊二醛一样，都会使交联后的胶原产生细胞毒性。2.7环氧化合物环氧化合物通常含有一个或多个环氧基，主要有环氧乙烷、环氧氯丙烷、脂肪族环氧化合物等。环氧基中因为有电荷的极化及环氧环张力的存在而具有较高的活性，可与胶原中的氨基、羧基等发生结合，从而实现交联与化学修饰。环氧化合物对胶原交联的作用与戊二醛相当，但使用中发现其存在交联后的变性温度不如戊二醛交联胶原的高，反应时间长以及会使胶原变黄等。但年华等46利用环氧化合物交联胶原，发现形成的键较GA交联的胶原更柔韧，交联胶原含水量更高，与自然活性组织更相近，升高浓度和pH可增加硬度，且胶原变性温度显著提升。XIN等47设计了高度稳定的胶原支架与环氧化天然多糖交联，用于伤口愈合。XING等48以环氧氯丙烷为交联剂制备了几丁质-羟基磷灰石（HAP）-胶原复合支架（CHCS），用于促进骨再生。卢加洪等49用水解胶原蛋白和环氧树脂交联制备皮革复鞣剂，其复鞣填充吸收率可达90%以上，有效保证了皮革质量。2.8含硫化合物在蛋白质中，因为二硫键非常稳定，所以蛋白分子能够保持生化特性和稳定的结构。含硫化合物中的硫醇官能团（SH）和胶原中赖氨酸的-氨基能够进行交联反应。WONBAE等50合成了一种新型交联剂-硫代丁内酯对天然胶原进行硫代交联。试验结果表明，交联后的胶原最高分子质量与平均分子质量分别提高了1.7倍和2.3倍，提高了其力学性能。同时，随着胶原线性化排布与侧向交联，胶原纤维形貌与粒径发生改变，胶原膜的断裂伸长率得到提高，且胶原膜材料的亲水性保持良好。2.91,4-二（3,4-羟基苯）-2,3-二甲基丁烷（NDGA）NDGA的交联原理是将邻苯二酚官能团氧化成醌后再与胶原反应，NDGA交联可显著提高胶原的弹性系数和张力，给纤维母细胞提供一个良好的增殖、移动和附着的环境。但其处理后的胶原纤维会变成棕色51。NDGA交联纤维的材料特性超过了用戊二醛和碳二亚胺等其他交联剂处理的胶原纤维的性能。522&RO 1+52+2+1&ROJU等52发现用NDGA交联的支架传感器的敏感性比戊二醛94胶原蛋白交联方法及其研究进展印染（2024 No.3）交联的更好，组织学检测表明NDGA交联的支架保持了它们的物理结构，减少了支架炎症反应。NDGA交联的胶原材料可用于修复断裂、撕裂或手术横断的肌腱，以及用于修复肌肉骨骼损伤和其他疾病。2.10-环糊精衍生物-环糊精二醛由于具有特殊结构，分子在胶原中的扩散速度较慢，交联度比戊二醛的低，但高于EDC，提高其浓度可以提高交联度。这是由于-环糊精二醛中的醛基与胶原中的氨基反应产生共价键，且两者之间的羟基、羧基等可以形成强烈的氢键，这使胶原耐酶解能力和热稳定性提高。-环糊精二醛是一种交联效率较好的交联剂53。3生物交联法在化学交联方法中，最常见的是使用戊二醛或碳二亚胺。然而，它们存在细胞毒性的风险并产生炎症反应或组织钙化，在食品、化妆品或医疗保健中的应用存在一定的局限性。为此，不同来源的酶被广泛研究用于交联胶原蛋白。生物交联胶原具有较低的细胞毒性、优异的细胞相容性且不易导致胶原变性等优点，但成本高、交联强度低。3.1赖氨酰氧化酶（LOX）赖氨酰氧化酶（LOX）是一种催化胶原蛋白和弹性蛋白的共价键的蛋白酶，LOX可以氧化胶原蛋白和弹性蛋白中的侧链赖氨酸残基形成醛。醛可自发反应形成共价交联54-55。1&+&+&+&+&+1+&2&+&+&+&+&+&2+1&+&+&+&+&+1+&2&+&+&+&+&2+1&+2+1+&+&+&+&+&2+1 2+2/VO2LGDVH2+&+&+&+&+&2+1 1+2+1+&+&+&+&+&2+12&+&+&+&+&2+12&+&+&+&+&2+1LOX作为蛋白酶常应用于：（i）交联胶原，开发胶原基敷料产品，如范代娣等56以人源化胶原蛋白为原料，螯合金属离子，使用LOX作为交联剂，制备结构稳定、无毒且具有抗菌性能的医用敷料产品；（ii）开发功能性肌肉骨骼组织，如MADISON等57以牛胶原纤维细胞作为原料，在组织培养过程中使用LOX进行处理，经过6周培养后，增加了胶原的交联度，提高了胶原力学性能。LOX作为哺乳动物的内源酶，能够合成细胞外基质，影响细胞增殖和细胞趋化，促进创伤面的组织再生，具有良好的生物相容性，在使用时无需去除残留，是一种优良的胶原交联剂。3.2微生物谷氨酰胺转胺酶（MTG）MTG是一种具有良好生物相容性的食品级酶，被广泛应用于食品工业中。MTG可以改善蛋白质基材料的物理性能，因此在蛋白质基材料中得到了广泛的应用。MTG的主要作用机理是催化肽结合谷氨酰胺残基的-羧酰胺基团（酰基供体）与主要赖氨酸残基的-氨基（酰基受体）之间的酰基转移反应，产生分子间或分子内的-（-谷氨酰）赖氨酸键。然后增加机械和蛋白水解抗性而不产生细胞毒性58。试验结果表明，无论酶的来源是哺乳动物或是微生物，以及胶原蛋白的种类是I型或是II型，谷氨酰胺转氨酶（MTG）的交联仅可以小幅提高胶原蛋白的变性温度、机械强度以及生物学稳定性。&RO1+2&RO1+1+&D7*DVH&RO1+&RO2MTG 目前常用在食品工业中，如 DONG 等59发现明胶使用 MTG交联60 min后，其凝胶强度与储能模量显著提高，且不产生细胞毒性。LIU T等60则使用MTG介导牛血清白蛋白与电纺胶原纳米纤维交联，并在其中加入神经营养因子-3（NT-3）制备具有修复脊髓损伤功效的胶原纳米纤维支架，试验结果显示这种支架具有良好的材料性能，延长了NT-3的释放，促进了神经的生长。MTG由于其安全性与生物相容性，在生物医药材料的开发中被越来越多地研究。4结语胶原基生物材料由于具有良好的生物相容性、适当的机械强度、柔韧性和输送营养物质或药物的能力，在实验室和临床实践中得到了广泛的应用。近几十年来，胶原基生物材料领域的创新层出不穷，为食品、化妆品、再生医学、组织工程提供了巨大的发展空间。为增强胶原的稳定性，通常采用物理交联、化学交联和酶交联等改进技术。使用两种不同的化学交联剂或化学交联剂与物理交联剂相结合的双重交联是未来胶原材料交联的发展方向。新的交联过程可促使新的胶原基材料在食品、化妆品及生物医学领域实现更多更广阔的应用。参考文献：1KAMML J,KE C Y,ACEVEDO C,et al.The influence of AGEs and enzymatic cross-links on the mechanical properties of collagen fibrilsJ.J Mech Behav Biomed Mater,2023,143：105870.2YANG J,SIRI J G,REMAIS J V,et al.The Tsinghua-lancet commission on healthy cities in China：unlocking the power of cities for ahealthy ChinaJ.Lancet,2018,391（10135）：2140-2184.3MEYER M.Processing of collagen based biomaterials and the resultingmaterials propertiesJ.Biomed Eng Online,2019,18（1）：22-24.4ADAMIAK K,SIONKOWSKA A.Current methods of collagen cross-linking：ReviewJ.International Journal of Biological 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