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泛素化蛋白检测方法

l 蛋白质泛素化介绍
蛋白质泛素化修饰过程在人体免疫系统调整过程中起到了关键性作用。和磷酸化修饰过程一样，泛素化修饰过程也是一个可逆共价修饰过程，它能够调整被修饰蛋白稳定性、功效活性状态和细胞内定位等情况。
泛素蛋白是一个由76个氨基酸残基组成很保守多肽，它能在E1、E2、E3酶等一系列酶促反应催化下和细胞内靶蛋白上一个或多个赖氨酸残基发生共价连接。泛素蛋白本身也含有7个赖氨酸残基，所以它们之间也能够经过这些位点相互连接，形成多泛素蛋白链（polyubiquitin chain）。现在研究显示，假如多泛素蛋白链和被修饰蛋白上第48位赖氨酸残基相连，会介导靶蛋白进入蛋白酶体而被降解；假如和被修饰蛋白上其它位点，比如第63位赖氨酸残基相连，则靶蛋白能够发挥信号通路功效而不会被降解。
和磷酸化修饰路径一样，泛素化修饰路径也是可逆，即能够经过去泛素化酶（DUB）将泛素蛋白修饰物去除掉。靶蛋白经泛素化路径修饰以后，连接在靶蛋白上泛素蛋白单体或多聚体能够被多种泛素蛋白结合结构域（UBD）所识别和结合。人类蛋白质组中含有两种E1酶、50种E2酶、600种E3酶、90种DUB酶和20种UBD，这说明泛素修饰路径在细胞调控中起到了多么关键作用。E3酶是泛素修饰路径中决定底物特异性关键酶，它能够分为两大类，即含有HECT结构域E3酶和其它含有RING结构域或RING样结构域（比如U-box或PHD结构域）E3酶。这两种E3酶全部在免疫调控过程中起到了关键性作用。

l 蛋白质泛素化检测方法
研究蛋白质泛素化首先需要明确三个基础点：哪些蛋白发生了泛素化；发生了泛素化蛋白质，具体是哪个位点赖氨酸残基发生了泛素化；进行定量。
明确了上述几点后，深入需要搞清楚是，我们感爱好泛素化蛋白，是怎样发生泛素化，影响这一泛素化过程关键分子是什么？或说这一过程中E3酶是什么？
然后需要研究是，这一蛋白质发生泛素化以后能够产生那些分子效应？对下游信号通路有什么影响？
研究上述内容试验方法和试验步骤：
方法一：western blot and strip
经过WB检测全部发生泛素化蛋白条带，拍照后，将膜strip。然后和特定蛋白抗体和特定泛素化位点抗体反应，显色拍照。经过阳性条带对比来初步判定某一特定蛋白特定位点发生了泛素化。【具体试验步骤附后】

方法二：western blot and immunoprecipitations
经过免疫共沉淀方法将某一特定蛋白和和其结合蛋白分离出来。分离出来蛋白再进行SDS电泳和western blot分析。【具体试验步骤附后】。这一方法能够明确具体哪个蛋白哪个赖氨酸残基发生了泛素化修饰。

方法三：in vitro ubiquitination assay
将要研究目标基因转染293细胞，使其大量表示。24h后提取并分离目标蛋白。在体外反应buffer中将我们要研究蛋白A（被泛素化那个蛋白）和UBE1，UbeH13-Uev 1 a heterodimer complex ，HA-ubiquitin和我们要研究蛋白B（引发蛋白A泛素化蛋白），共同进行孵育。将孵育后产物进行IP和WB分析。【具体试验步骤附后】。这一方法能够明确引发哪个蛋白是引发某蛋白发生泛素化修饰E3连接酶。

方法四：in vitro ubiquitin-binding assay
将我们要研究蛋白（被泛素化蛋白）基因转染293细胞，大量表示后提纯。或直接提取内源性蛋白。在体外和K63- or K48-linked ubiquitin chain petides孵育，然后经过SDS电泳并用泛素化抗体进行检测。这一方法能够明确要研究蛋白哪个赖氨酸残基轻易发生泛素化。

方法一：WB strip试验步骤

提取组织/细胞总蛋白
使用总泛素化抗体检测全部发生了泛素化蛋白
（此时能够观察到发生了泛素化蛋白关键分布在哪些分子量区间）
Stripping the blot
用特定蛋白抗体和膜反应显色
用Ub K63抗体和膜反应显色
Merge
假如总泛素化蛋白条带，和特定蛋白条带，和K63位点泛素化条带发生了重合，此时能够初步推测，特定蛋白第63位赖氨酸残基发生了泛素化

方法二：Western blot and immunoprecipitations
提取组织/细胞总蛋白
用琼脂糖珠或磁珠包被特异蛋白抗体，将和该蛋白结合全部蛋白分离出来
SDS电泳
用泛素化抗体进行反应
Stripping the blot
用特异抗体进行反应

方法三：in vitro ubiquitination assay
将要研究蛋白基因转染293细胞使其大量表示
提取蛋白，经过免疫共沉淀方法分离目标蛋白
将可能发生相互作用两种蛋白和UBE1，UbeH13-Uev 1 a heterodimer complex ，HA-ubiquitin共同进行孵育。使泛素化过程发生。
经过IP和WB方法检测发生了泛素化蛋白，并明确这一反应中促进泛素化发生蛋白