平台化靶向微泡在超声分子成像中的应用现状及展望 (1).pdf

基金项目:国家自然科学基金资助项目(22278449;81971627)作者单位:100029北京,中日友好临床医学研究所(王亮凯);100029北京,国家呼吸医学中心、呼吸和共病全国重点实验室、国家呼吸疾病临床研究中心、中国医学科学院呼吸病学研究院、中日友好医院呼吸中心(张波);100730 中国医学科学院/北京协和医学院(张波)通信作者:张波,电子信箱:thyroidus 平台化靶向微泡在超声分子成像中的应用现状及展望王亮凯张波摘要超声分子成像(ultrasound molecular imaging,UMI)是一种特异性的超声成像技术,可同时完成解剖和分子成像,在分子水平实现疾病的早期诊断、进展监测、治疗以及疗效评估。微泡(microbubbles,MBs)是最为常见的超声造影剂(ultrasoundcontrast agents,UCAs),在其表面连接特异性抗体或配体构建靶向微泡(targeted microbubbles,tMBs)可实现 UMI。平台化靶向微泡(multitargeted microbubbles,MT_MBs)是一种专用于临床前研究中的商业化 MBs,可在短时间内实现 tMBs 的构建,并规范化tMBs 的制备过程和成像步骤。但是,目前人们对于 MT_MBs 知之甚少。因此,本文将对 MT_MBs 的成分、结构、特点、优势、UMI相关临床前研究中的应用现状以及不足之处进行综述,并对其未来的应用方向进行展望。关键词超声分子成像靶向微泡平台化靶向微泡中图分类号R445文献标识码ADOI 10.11969/j.issn.1673-548X.2024.04.033超声是临床中广泛应用的影像学检查手段,具有便捷、安全、可重复性高等优势,可在解剖层面对疾病进行诊断。然而,疾病发展的早期通常以细胞水平的表型变化为特征,这超出了常规超声的成像范畴1。为解决以上限制,研究者开发了多种可靶向特异性生物学标志物的功能化超声造影剂(ultrasound contrastagents,UCAs)实现了超声分子成像(ultrasound molec-ular imaging,UMI),以期通过无创、安全、便捷的成像手段在 分 子 或 细 胞 水 平 实 现 疾 病 进 展 过 程 的 可视化1,2。MBs 由脂质或蛋白质外壳包裹高分子量或低溶解度气体构成,是临床中应用最广泛的 UCAs,其直径范围为 1 10m,主要用于评估器官或病灶的血流灌注2,3。在 MBs 表面连接抗体、多肽等特异性配体构建靶向微泡(targeted microbubbles,tMBs),可使其与目标生物学标志物相结合进而实现 UMI。但在目前的临床前研究中,tMBs 的制备及使用、动物准备及监测、超声设备参数设置以及数据采集均存在操作者依赖性,难以保证研究结果的可重复性。为解决这一问题,UCAs 制造公司研发出一种表面缀合链霉亲和素的商业化 MBs,专用于临床前研究中 tMBs 的构建,并对此类 MBs 标准化成像步骤进行了总结4。其中平台化靶向微泡(multitarget microbubbles,MT_MBs)就属于该类 MBs。因此,为加深人们对于 MT_MBs 的认识以进行更为规范的 tMBs 临床前研究,本文将对MT_MBs 的成分、结构、特点、优势、UMI 相关临床前研究中的应用现状以及不足进行综述,并对其未来的应用方向进行展望。一、靶向微泡的研究现状1998 年 Villanueva 等5构建了与人 ICAM-1 单克隆抗体偶联的 MBs,验证了其对于人冠状动脉内皮细胞的靶向性,证明了与特定生物学标志物配体偶联的 MBs 可选择性黏附于表达该标志物的生物表面。基于该研究成果,研究者通过在 MBs 表面连接特异性抗体或多肽构建了多种 tMBs,以对肿瘤、炎症以及血栓等疾病进行分子成像6。在肿瘤成像方面,常以血管生成标物中的血管内皮生长因子受体 2(vascular endothelial growth factorreceptor 2,VEGFR2)作为 tMBs 的靶点,以评估肿瘤血管 再 生 情 况 以 及 抗 血 管 生 成 治 疗 的 疗 效7,8。BR55 是靶向 VEGFR2 的 tMBs,目前已进入临床试验阶段,其在卵巢癌和乳腺癌中产生的超声信号与肿瘤组织中 VEGFR2 的表达具有相关性9。相较于此类单个靶点的 tMBs,研究表明双靶点或多靶点的 tMBs的更好的促进肿瘤血管再生的可视化10 12。然而,无论是单靶、双靶还是多靶的 tMBs 均无法在一次成像中同时实现多个靶点的评估。为解决该局限性,Li 等13将不同靶点(VEGFR2 和 v3 整合素)、不同外壳厚度(脂质膜和脂质-PLGA 膜)的两种 tMBs771医学研究杂志 2024 年 4 月第 53 卷第 4 期综述与进展同时注射至荷瘤小鼠体内,依次应用低强度超声波和高强度超声波对其进行击破,通过计算信号强度的差值在一次 UMI 过程中同时对 VEGFR2 和 v3 整合素的表达进行了评估。在炎症成像方面,常应用 tMBs 对炎症性肠病(inflammatory bowel disease,IBD)和动脉粥样硬化斑块进行检测与评估6。靶向 P 选择素和 E 选择素的双选择素 tMBs 可量化 IBD 炎症程度,监测治疗效果14 16。基于以上成果,Wang 等17,18将双选择素tMBs 用于慢性结肠炎动物模型的构建中,以长期动态监测肠道中 P、E 选择素表达变化。结果显示,超声信号的变化与组织学分析结果一致,提示 tMBs 成像具有较高的敏感度。通过靶向血管细胞黏附分子1(vascular cell adhesion molecule 1,VCAM-1)、GPVI、连接黏附分子 A(junctional adhesion molecule A,JAM-A)等靶点可对动脉粥样硬化斑块进行 UMI,以对斑块进行识别与监测6。然而,MBs 在血流中往往位于血流的轴心,加之血流中的剪切力使其不易与斑块结合19。中性粒细胞在较高剪切力的血流中仍可与炎症内皮相结合,基于此生物学特性 Liu 等20应用 CD11b 抗体将中性粒细胞连接在 MBs 表面构建了一种 Neu-balloon。结果显示,该 Neu-balloon 可牢固黏附于内皮细胞,同时可维持 MBs 的声学特性,可准确识别动脉粥样硬化易损斑块。在血栓成像方面,通常选择靶向活化的血小板实现血栓的特异性成像。GPb/a 是已发现血小板上最为丰富的整合素亚型,可作为靶向血小板的靶点21。Arg-Gly-Asp(RGD)是靶向 GPb/a 的配体-受体策略之一。Hu 等22应用与 GP b/a亲和力更高的 RGD 环肽对 MBs 进行修饰,通过体外及体内实验证明了其对于血栓的靶向性以及 UMI 的可行性。除 RGD 外,Wang 等23开发了构象特异性的抗 GPb/a 单链抗体(scFvs),并将此抗体与MB 相结合构建了靶向 GPb/a 的 tMBs 以对血栓进行 UMI,研究结果显示该 tMBs 不仅可识别血栓还可以对血栓大小进行实时监测。tMBs 除了可对疾病进行特异性成像,还可应用于疾病的治疗中。MBs 在超声波的作用下产生空化效应可促进药物或基因的递送,tMBs 可进一步提高递送的特异 性24。Zhou 等25开 发 了 载 有 质 粒 的CD105 靶向的阳离子 MBs 对乳腺癌荷瘤小鼠进行基因治疗,并验证了该 tMBs 相较于非靶向阳离子 MBs具有更好的治疗效果。此外,超声空化效应产生的微束和微射流可导致内皮细胞损伤和微血管破裂,可促进肿瘤血管正常化提高肿瘤组织血流灌注26。Li等27应用机械指数为 0.4 的超声波刺激 MBs 空化,改善了肿瘤的血流灌注,抑制了肿瘤生长。因此,MBs 不仅可辅助药物或基因治疗,其本身联合超声波也可作为一种治疗手段,以上两种治疗方式的结合或可成为未来的研究方向。二、平台化靶向微泡的结构及特点尽管目前研发的多种 tMBs 在临床前研究中取得了不错的研究结果,但 tMBs 进入临床往往需要大量的临床前研究证明靶点的临床相关性以及 tMBs 的安全性。目前 tMBs 制备方式繁多,且制备流程较为复杂通常需要数小时至数天完成制备,这大大降低了研究效率28。近年来,UCAs 公司开发了一种专用于临床前研究中的 MBs,可在短时间内实现 tMBs 的制备。此外,为规范化临床前研究针对小动物的超声造影成像以及 UMI,专家们还对于此类商业化 MBs 的成像流程进行了推荐,以帮助 研 究 者 更 好 的 进 行 相 关研究4。MT_MBs 是上述应用于临床前研究中的商业化MBs 之一。MT_MBs 由脂质外壳包裹全氟丁烷和氮气构成。其外壳中缀合的链霉亲和素成分可与生物素化 的 蛋 白 质、抗 体、寡 肽 和 小 分 子 等 配 体 相 结合4。MT_MBs 的平均直径为 1.3m,每毫升悬液中约有 2 109个 MBs,相较于同类型产品其直径更小、浓度更高。应用 MT_MBs 制备 tMBs 的流程如下:(1)使用 0.9%氯化钠溶液复溶 MBs 的磷脂膜冻干粉,轻摇 10s,室温静置 5min。(2)稀释生物素标记 抗 体 至 固 定 体 积,加 入 上 述(1)中 溶 液 轻 摇1min后室温静置 1min。因 此,应用 MT_MBs 合 成tMBs 的过程简单快速,合成方式规范,研究者仅需根据研究需要选择合适的配体,即可在 30min 内完成 tMBs 的制备,大大降低了 tMBs 合成的难度。此外,此种制备方式可保证 tMBs 的尺寸、浓度以及粒径分布的统一性。三、平台化靶向微泡在超声分子影像临床前研究中的应用目前 MT_MBs 在 UMI 临床前研究中主要集中在血管生成标志物、炎症相关标志物以及抗体介导排斥反应诊断标志物的检测中(表 1)。血管生成标志物包括 B7-H3、Netrin-1、CD105 和 v3 整合素,可作为肿瘤以及动脉粥样硬化斑块检测、诊断和疗效监测的靶点;炎症相关标志物包括 P 选择素和 JAM-871综述与进展J Med Res,April 2024,Vol.53 No.4A,主要用于炎性反应、免疫排斥反应以及易损斑块的检测与识别中;抗体介导排斥反应诊断标志物则为C4d,应用于诊断心脏、肾脏移植后抗体介导的排斥反应中。表 1平台化微泡在超声分子影像临床前研究中的应用现状生物分子标志物用途血管生成标志物B7-H329,30乳腺癌、前哨淋巴结检测Netrin-131乳腺癌 Netrin-1 表达的定量评估CD10532,33胆管癌和肝母细胞瘤诊断v3 整合素34早期动脉粥样硬化斑块检测和疗效监测炎症相关标志物P 选择素35,36监测放射治疗后健康组织的炎性反应JAM-A37易损斑块识别抗体介导排斥反应标志物C4d38,39诊断心脏、肾脏移植后抗体介导排斥反应 1.血管生成标志物的检测:血管生成是为癌细胞提供氧气和营养等基本物质的关键过程之一,在此过程中,多种血管内皮标志物存在过表达,可作为肿瘤进展监测、诊断成像、治疗以及疗效监测的靶点40。Bachawal 等29以及 Hu 等30将血管生成标志物B7-H3 作为靶点,应用 MT_MBs 构建了靶向 B7-H3 的MBB7-H3对乳腺癌和前哨淋巴结进行检测。结果显示,MBB7-H3可靶向乳腺癌和发生转移的前哨淋巴结,产生更强的超声信号。因此,B7-H3 具有作为检测乳腺癌及乳腺癌转移前哨淋巴结的靶点的潜力,靶向B7-H3 的 UMI 可成为非侵入性诊断乳腺癌的成像手段。此外,MT_MBs 还可应用于对目标靶点表达情况的定量评估中。Netrin-1 干扰疗法是治疗肿瘤的新手段,已进入期临床试验。该治疗方式需在治疗前评估 Netrin-1 表达情况以对患者进行分层,然而目前仍缺乏无创的检测手段。Wischhusen 等41应用MT_MBs 构建了靶向 Netrin-1 的 tMBs,以定量评估乳腺癌血管中 Netrin-1 的表达情况。结果显示,该tMB 产生的信号强度差异与Netrin-1 的蛋白质以及mRNA 表达的差异具有相关性。证明了 tMBs 的高敏感度,有望在分子水平反应疾病的进展。2.炎症相关标志物的检测:炎性反应在多种疾病的发生、发展过程中发挥着关键作用。选择素(如P-选择素、E-选择素)、JAM-A 和细胞间黏附分子-1 等是常见的炎性相关分子标志物,可作为 UMI检测炎性反应的特异性靶标。Boesen 等36构建了靶向 P-选择素的 MT_MBs,对小鼠缺血再灌注损伤肾脏的灌注情况进行评估。在对该 tMBs 进行破坏后,相较于对侧的健康肾脏,缺血后肾脏的肾皮质中超声信号强度发生了更为显著的变化,表明缺血和再灌注促进了肾皮质血管中 P-选择素的表达,使更多的P-选择素靶向的 MT_MBs 黏附于血管内皮。JAM-A 是一种连接膜蛋白,在早期动脉粥样硬化血管内皮中表达增加,这与炎性单核细胞的募集相关。而炎性单核细胞的募集与动脉粥样硬化病变形成的起始和进展具有相关性。Zhang 等37提出 JAM-A 可作为易损斑块的生物学标志物,并 应用 MT _MBs 构建MBJAM-A对斑块中 JAM-A 的表达进行可视化检测。结果显示,易损斑块中 MBJAM-A的信号强度显著增强且延长与病理结果一致。3.抗体介导排斥反应诊断标志物的检测:C4d 是诊断抗体介导排斥反应(antibody-mediated rejec-tion,AMR)的特异性生物学标志物,目前主要通过组织活检和组织病理学分析进行检测38,39。但是,以上两种方式均为有创的检查手段,且局部标本通常无法反映器官的整体状况。因此,需要一种无创、安全且高精度的检查手段。Liao 等38,39应用 MT_MBs 构建可靶向 C4d 的 MBC4d,对心脏移植或肾脏移植后发生 AMR 大鼠的 C4d 沉积情况进行检测。结果显示,MBC4d产生的信号强度与病理学评估 C4d 沉积结果几乎呈线性相关。四、展望目前 MT_MBs 仍存在以下不足:(1)应用 MT_MBs 构建 tMBs 多通过抗原抗体的特异性结合实现靶向性,但此种靶向策略在高流速、高剪切力的血流中难以确保 tMBs 的靶向黏附效率。(2)MT_MBs 仅能够与可进行生物素化的分子相结合,导致配体的选择受限41。针对上述不足,应用高表面密度的小分子配体实现多点协同作用,或可确保 tMBs 在高剪切力的血流中维持良好的黏附性和保留性24。或者可于MT_MBs 表面连接多种抗体构建多重靶向性的 tMBs以提高 tMBs 的靶向黏附作用。此外,需要进一步对MT_MBs 的膜成分进行优化,以实现多种功能化 MBs的构建。目前应用 MT_MBs 的研究大多围绕应用单一生物素化抗体构建 tMBs,使其靶向特定的血管内皮标志物进行诊断成像。未来 MT_MBs 也许可以作为递送工具提高药物或基因治疗的疗效或与超声波联合通过促进肿瘤血管正常化对肿瘤进行治疗。总之,MT_MBs 可大大降低 tMBs 合成的难度为靶点的探索971医学研究杂志 2024 年 4 月第 53 卷第 4 期综述与进展提供便利,同时可规范化、标准化 tMBs 合成过程,把控靶向配体的连接剂量,有望成为 UMI 研究中的可靠工具,为研发临床用 tMBs 提供研究基础。利益冲突声明:所有作者均声明不存在利益冲突。参考文献1 Kosareva A,Abou-elkacem L,Chowdhury S,et al.Seeing the in-visible-ultrasound molecular imaging J.Ultrasound Med Biol,2020,46(3):479-4972 Zhang G,Ye HR,Sun Y,et al.Ultrasound molecular imaging andits applications in cancer diagnosis and therapy J.ACS Sensors,2022,7(10):2857-28643 Stride E,Segers T,Lajoinie EG,et al.Microbubble agents:new di-rectionsJ.Ultrasound Med Biol,2020,46(6):1326-13434 Hyvelin JM,Tardy I,Arbogast C,et al.Use of ultrasound contrast a-gent microbubbles in preclinical research:recommendations for 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