RTPCR实验步骤及注意项目.doc

RT-PCR试验
时间:-01-05 22:32 起源:.com 作者:生物界

RT-PCR试验有三步：抽提RNA，RT，PCR。  
要求：
1.做RT前必需测RNA浓度，逆转录体系对RNA量还是有部分要求，常见500ng或1ug。
2. RT按要求做，通常不会出太大问题。  
3. PCR，按常规。但如需扩长片段，则对前两步要求较高，需要有完整cDNA存在，不是单改变Mg2+浓度、退火温度能处理。
1）RT和PCR时引物设计是不是一定要先知道目标基因序列？必需  
在RT时，引物设计有3种方法即a：Random 9mers；b：Oligo dT-Adaptor Primer；和c：特异下游引物。假如用a和b方法，是扩增全部cDNA（理论上），还要用此产物做PCR 模板继续扩增。  
假如用c方法，那么要去那里查它序列呢？
问题：  
在做RT-PCR碰到一怪现象，即对同一动物不一样组织扩增同一段基因，结果从一个组织中能够扩出我目标基因，条带很好，而另一组织在一样条件下却得到很多非特异性条带，尝试其它条件一样无法得到满意结果，百思不得其解！（注：已肯定该基因在两种组织中全部表示，且内参考在两种组织全部可扩增出来）  
从这两种组织中提取RNA量是不一样，我测过吸光度，差异还很大，会不会和这相关呢？ 请高手指教！  
解答：  
1.RT-PCR有两种做法：  
条件含有话可用kit进行一步法进行；若条件不太好话可分两步进行逆转录再PCR。但以后发觉两步法结果愈加理想，条带特异性强且无拖尾现象，我推测是体系愈加单一比较利于PCR进行，当然也可能是我买kit不太好。（promega）。  
2.RT-PCR应含有条件  
高质量RNA（保留后可做5‘，3’RACE）；引物（最好产物短点）；若包含粗略定量话还应考虑RNA浓度或是cDNA浓度（假如由内标分子愈加好，但我发觉其实很不轻易将RNA浓度和内标分子表示量调整完全一样）；体系均一性等。  
3.RACE  
我做过RACE（3’RACE是宝生物Kit；5‘RACE是Gibico），但现在再进行另一个同源基因3‘RACE时却怎么也P不出来，这两个基因是由同一对引物扩增出来，其中一个已经取得了全序列（RACE方法），而另一个基因3’UTR却增么也扩不出来，我推测是不是该基因3‘UTR太长缘故，我全部快绿了，有没有
RT-PCR常见内标b－actin 和GAPDH使用有选择性吗？比如不一样细胞，不一样刺激。
相关内参：
RT-PCR内参考能够在一个管子里做（那样也是图好看部分），最好分开两管，把除了引物之外mixture统一配，拍照后，算目标基因和内参比值，这就是基因表示相对浓度。  
问：我曾经作过同一管PCR，内有actin 和目标基因引物。即使可见到两条均一条带但图片质量不理想（而且酶量、Mg2+加倍）。请教mxbdna ，你是怎样处理同一管PCR各成份浓度？
答： it should determined the amount of RNA. but it not for the quantitity of the PCR. it just was convienent to guess the amount ot the template<(for RT and PCR) and bettrer for publication and editor if he don not know the preocedure much. but the amount just using "accurate piptte" is wrong. it shoud be remembered to do the inner control of housekeeping gene everytime.
在同一管中做RT，其实没有什么问题，不需要taq魅加量，taq酶原来就是过量^-^，（平时做pcr时候，完全能够再省部分taq酶，半斤八两就能够了，我想这肯定再很多贴子里应该全部谈到了。Mg就跟不能变了，一变整个体系就变了。能看到均一条带就很好了。  
关键是摸，十八摸（太少，只争朝夕，开个玩笑）即使用不着，不过摸上3、5摸总是必需，首先遥分开摸，然后再一起摸，直到摸好了，还要考虑比较不一样模板中量，所以我们不提议再同一管中进行，因为还有相互竞争抑制问题，即使不一样基因之间。  
相关内参提议：
一定要做内参，每一次，我想。不作内参结果是不可信  
电泳能够不一起跑，没相关系，计算是相对表示程度，着我在好几封帖子里全部谈了，再说一边我得见解，1、半定量和定量RT-PCR做全部是基因相对表示量，不是绝对表示量，除非你能正确知道来自多少细胞，不过细胞还有死呢。2、以电泳为基础半定量RT-PCR本身是不可信，作为试验粗筛是能够，但不能作为最终止果，3、半定量RT-PCR应该再两管中进行，除非内参基因和目标基因表示相同，长度差不多，GC含量相同，或实在穷要省PCR管和taq。  
相关平台期和线性期问题，实际上线性期是指数期，只不过恰巧2冥和2倍数是相同。看上去任何一个时期全部能够，实际上是不正确，因为牵涉到酶促动力学问题，这个我也不懂，有部分专门文章，仿佛，包含到很多化学东西。我们学医，也没必需知道那些，不过其中关键是因为模板引物酶原料和buffer之间关系，这种反应单靠改变其中一个成份没有用，酶一直是过量，再加酶也没用，引物ntp全部是这么。烟鬼正传，最好选线性期开始阶段，不过要在你凝胶成像分辨范围内，所以选一个这两种契合点。给你一张图你就明白了，再开始时候酸是切线，这图我在 *** 帖过。  
相关引物设计，再可能情况下，除了常规要求之外，最好兼顾跨内含子（不过，依据要求，还能够专门设计隔内含子，这么还能够用于基因组PCR）、长度小于500bp－600bp等等。  
引物当然要设计成一样退火温度，即使不再一管中，也要一样，要在一台机器里啊。我引物占了冰箱一格，大部分是一个温度，这么任何多个全部能够拿来披，也不用查。  
我反复说过了，别用软件，就用眼睛看，软件包含在好，有些基因在它出软件时候，还没发觉呢，跟不要说在基因组位置和序列了，怎么考虑内含子问题呢？
18s引物也和著名βactin一样是设计，只要拿到序列就能够了，不过限制是只能用总RNA为模板，不过比actin和bubulin等可准多了，更不要说GAPDH这个破烂了。18s除了在细胞中更相同（量）外，关键是它占百分比远远高于看家基因，所以定量愈加正确，我想，不知对不对，请几位主任和eeflying指教。我认为，就像你用某一个东西数量去概括，因该选那种多东西，说一座房子是由块砖造成，比说又29根梁更正确吧。更不要说没有看家基因不看家缺点，因为她是服务于整个基因组表示谱什么。  
PE有专门用于实时PCR内参试剂盒，就是用18s，不过我们看懂使用那条序列，不知有没有些人用过，通知其序列和genbank号。  
恰好问一下，我查了部分序列，一直没有去合成，关键是因为手上actin荧光探针还没有完，当初和成了一堆。  
有那位高手用过18s内参，请问您序列（我指是模板序列）？  
原位杂交最好用RNA做探针，效果好部分，反正你有钱卖roche盒子，而且量也能确保，因为转录过程嘛，沿着一条线突突地跑就是了。正义反义也轻易理清。
我认为做RT-PCR方法和条件及应注意事项就是那么几条,很多专业书全部有具体描述,不过很多人还是历经数次磨难，有时就是得不出结果。所以，我认为因为每个人所要克隆片断不一样，引物不相同，所以对不一样人来说还是有她自己特殊性,我以下经历说明：做试验时各人情况不一样,做不出时还是要好好动一下脑子。  
    记得我开始我ＲＴ－PCR时，按常规方法，提取总ＲＮＡ后，首先用自己设计下游引物进行逆转录，不停改变反应条件，进行了Ｎ次均没有结果。以后考虑到本人克隆PCR片断在我们试验另一位同学克隆片断当中，而该同学已经用RT-PCR克隆出她片断（尽管她用这些ＲＴ－ＰＣＲ产物做模版再进行ＰＣＲ时也没措施反复出她产物），所以，我先用她引物和条件扩增出她片断，然后用她ＲＴ－ＰＣＲ产物作模板（有点改善，逆转录反应换用了９mers随机引物），用我引进物进行通常PCR，最终得到我产物，测序结果完全正确。尽管我这个经历她人很人碰到，但足能够说明试验能够有自己模式，书本知识和她人经验很关键，但有时也不定要受到书本框框和她人经验限制
请问：
1 引物特异退火温度怎样设定？能够依据gc 和at含量算出吗？能够用引物汇报单上Tm值吗？
2 PCR时20微升体系中cDNA应加多少比较适宜？MgCl2应加多少？各个成份量有没有确定标准？
3 PCR结果跑电泳，actin有，但跑不出目标条带，有多个原因？和cDNA量少相关吗？Mg离子太多是否会抑制Taqase活性？  
通常来说引物汇报单伤得是正确,也能够自己算,实际上关键各条引物一致,剩下能够摸.
20中是指体积还是量?只要不显著改变体系离子强度,加1,2ul全部能够.mg要调,但我总认为没有书里讲那么玄乎,我全部是常年不变.
假如内参考有,目标没有,最少证实不是"漂亮惹"祸.原因书里应该全部说了.
在全部RNA试验中，最关键原因是分离得到全长RNA。而试验失败关键原因是核糖核酸酶（RNA酶）污染。因为RNA酶广泛存在而稳定，通常反应不需要辅助因子。所以RNA制剂中只要存在少许RNA酶就会引发RNA在制备和分析过程中降解，而所制备RNA纯度和完整性又可直接影响RNA分析结果，所以RNA制备和分析操作难度极大。
在试验中，首先要严格控制外源性RNA酶污染；其次要最大程度地抑制内源性RNA酶。RNA酶可耐受多个处理而不被灭活，如煮沸、高压灭菌等。
外源性RNA酶存在于操作人员手汗、唾液等，也可存在于灰尘中。在其它分子生物学试验中使用RNA酶也会造成污染。这些外源性RNA酶可污染器械、玻璃制品、塑料制品、电泳槽、研究人员手及多种试剂。而多种组织和细胞中则含有大量内源性RNA酶。
一、 预防RNA酶污染方法
1. 全部玻璃器皿均应在使用前于180℃高温下干烤6hr或更长时间。
2. 塑料器皿可用0.1% DEPC水浸泡或用氯仿冲洗（注意：有机玻璃器具因可被氯仿腐蚀，故不能使用）。
3. 有机玻璃电泳槽等，可先用去污剂洗涤，双蒸水冲洗，乙醇干燥，再浸泡在3% H2O2 室温10min，然后用0.1% DEPC水冲洗，晾干。
4. 配制溶液应尽可能用0.1% DEPC，在37℃处理12hr以上。然后用高压灭菌除去残留DEPC。不能高压灭菌试剂，应该用DEPC处理过无菌双蒸水配制，然后经0.22μm滤膜过滤除菌。
5. 操作人员戴一次性口罩、帽子、手套，试验过程中手套要勤换。
6. 设置RNA操作专用试验室，全部器械等应为专用。
二、常见RNA酶抑制剂
1. 焦磷酸二乙酯（DEPC）：是一个强烈但不根本RNA酶抑制剂。它经过和RNA酶活性基团组氨酸咪唑环结合使蛋白质变性，从而抑制酶活性。
2. 异硫氰酸胍：现在被认为是最有效RNA酶抑制剂，它在裂解组织同时也使RNA酶失活。它既可破坏细胞结构使核酸从核蛋白中解离出来，又对RNA酶有强烈变性作用。
3. 氧钒核糖核苷复合物：由氧化钒离子和核苷形成复合物，它和RNA酶结合形成过渡态类物质，几乎能完全抑制RNA酶活性。
4. RNA酶蛋白抑制剂（RNasin）：从大鼠肝或人胎盘中提取得来酸性糖蛋白。RNasin是RNA酶一个非竞争性抑制剂，能够和多个RNA酶结合，使其失活。
5. 其它：SDS、尿素、硅藻土等对RNA酶也有一定抑制作用。
mRNA分离和纯化  
真核细胞mRNA分子最显著结构特征是含有5’端帽子结构（m7G）和3’端Poly(A)尾巴。绝大多数哺乳类动物细胞mRNA3’端存在20-30个腺苷酸组成Poly（A）尾，通常见Poly（A+）表示。这种结构为真核mRNA提取，提供了极为方便选择性标志，寡聚（dT）纤维素或寡聚（U）琼脂糖亲合层析分离纯化mRNA理论基础就在于此。
mRNA分离方法较多，其中以寡聚（dT）-纤维素柱层析法最为有效，已成为常规方法。此法利用mRNA 3’末端含有Poly（A+）特点，在RNA流经寡聚（dT）纤维素柱时，在高盐缓冲液作用下，mRNA被特异地结合在柱上，当逐步降低盐浓度时或在低盐溶液和蒸馏水情况下，mRNA被洗脱，经过两次寡聚（dT）纤维柱后，即可得到较高纯度mRNA。
寡聚(dT)纤维素柱纯化mRNA
一、试剂准备
1．3M醋酸钠（pH 5.2）
2．0.1M NaOH
3．1×上样缓冲液：20mM Tris-HCl(pH 7.6)；0.5M NaCl；1M EDTA（pH 8.0）；0.1%SLS(十二烷基氨酸钠。配制时可先配制Tris-HCl(pH 7.6)、NaCl、EDTA（pH 8.0）母液，经高压消毒后按各成份确切含量，经混合后再高压消毒，冷却至65℃时，加入经65℃温育（30min）10%SLS至终浓度为0.1%。
4．洗脱缓冲液：10mM Tris-HCl(pH 7.6)；1mM EDTA(pH 8.0)；0.05% SDS
5．无水乙醇、70%乙醇
6．DEPC
二、操作步骤
1．将0.5-1.0g寡聚（dT）-纤维悬浮于0.1MNaOH溶液中。
2．用DEPC处理1ml注射器或合适吸管，将寡聚（dT）-纤维素装柱0.5-1ml，用3倍柱床体积DEPC H2O洗柱。
3．使用1×上样缓冲液洗柱，直至洗出液pH值小于8.0。
4．将RNA溶解于DEPC H2O中，在65℃中温育10min左右，冷却至室温后加入等体2×上样缓冲液，混匀后上柱，立即搜集流出液。当RNA上样液全部进入柱床后，再用1×上样缓冲液洗柱，继续搜集流出液。
5．将全部流出液于65℃加热5min，冷却至室温后再次上柱，搜集流出液。
6．用5-10倍柱床体积1×上样缓冲液洗柱，每管1ml分部搜集，OD260测定RNA含量。前部分搜集管中流出液OD260值很高，其内含物为无Poly(A)尾RNA。后部分搜集管中流出液OD260值很低或无吸收。
7．用2-3倍柱容积洗脱缓冲液洗脱Poly(A+)RNA，分部搜集，每部分为1/3-1/2柱体积。
8．OD260测定Poly(A+)RNA分布，合并含Poly(A+)RNA搜集管，加入1/10体积3M NaAc（pH5.2）、2.5倍体积预冷无水乙醇，混匀，-20℃放置30min。
9．4℃离心，10000g×15min，小心吸弃上清。用70%乙醇洗涤沉淀。[注意：此时Poly(A+)RNA沉淀往往看不到]。4℃离心，10000g×5min，弃上清，室温晾干。
10. 用适量DEPC H2O溶解RNA。
三、注意事项
1．整个试验过程必需预防Rnase污染。
2．步骤（4）中将RNA溶液置65℃中温育然后冷却至室温再上样目标有两个，一个是破坏RNA二级结构，尤其是mRNA Poly(A+)尾处二级结构，使Poly(A+)尾充足暴露，从而提升Poly(A+)RNA回收率；另一个目标是能解离mRNA和rRNA结合，不然会造成rRNA污染。所以此步骤不能省略。
3．十二烷基肌氨酸钠盐在18℃以下溶解度下降，会阻碍柱内液体流动，若室温低于18℃最好用LiCl替换NaCl。
4．寡聚（dT）-纤维素柱可在4℃贮存，反复使用。每次使用前应该依次用NaOH、灭菌 ddH2O、上样缓冲液洗柱。
5．通常而言，107哺乳动物培养细胞能提取1-5μg Poly(A+)RNA，约相当于上柱总RNA量1%-2%。  
RNA酶保护试验((RNase Protection Assay,RPA)是经过液相杂交方法,用反义RNA探针和样品杂交，以检测RNA表示技术。和Northern杂交和RT-PCR比较，RPA有以下多个优点：
1． 检测灵敏度比Northern杂交高。因为Northern杂交步骤中转膜和洗膜全部将造成样品和探针损失，使灵敏度下降，而RPA将全部杂交体系进行电泳，故损失小，提升了灵敏度。
2． 因为PCR扩增过程中效率不均一和反应“平台”问题，基于PCR产物量进行分析所得数据可靠性将下降，而RPA没有扩增过程，所以，分析数据真实性较高。
3． 因为和反义RNA探针杂交样品RNA仅为该RNA分子部分片段，所以，部分降解RNA样品仍可进行分析。
4． 步骤较少，耗时短。和Northern杂交相比，省去了转膜和洗膜过程。
5． RNA-RNA杂交体稳定性高，无探针本身复性问题，无须封闭。
6． 一个杂交体系中可同时进行多个探针杂交，无竞争性问题。
7． 检测分子长度能够任意设置，灵活性大。
RPA缺点是需要同位素标识探针。
一、试剂准备
1． GACU POOL：取100mM ATP、CTP、GTP各2.78μl、100mM UTP 0.06μl，加DEPC H2O至100μl。
2. 杂交缓冲液 IPES 0.134g、0.5M EDTA（pH8.0）20μl、5M NaCl 0.8ml、甲酰胺8ml，加DEPC H2O至10ml。
3. RNase消化液：5M NaCl 120μl、1M Tris-HCl(pH7.4) 20μl、0.5M EDTA（pH8.0）20μl、RNase A(10mg/ml) 8μl、RNase T1(250U/μl) 1μl，加DEPC H2O至2ml
二、操作步骤
1．反义RNA可由含T7或SP6开启子重组质粒为模板制备，也能够用含开启子PCR产物为模板制备，本文介绍后者。
（1）设计含T7开启子PCR引物
因为PCR产物将作为合成反义RNA模板，所以一对引物中下游引物5’-端要含T7开启子序列:  
T7开启子序列为：5’-TAATACGACTCACTATAGGG
引物设计其它要求和通常PCR引物设计相同。PCR产物长度决定了反义RNA探针长度，具体设计时可考虑100-400bp长。最好采取巢式PCR，即先扩增出一较长片段，再以该片段为模板扩增出较短片段，以确保探针特异性，以下图所表示：

上游引物
下游引物Ⅱ T7 开启子序列
下游引物Ⅰ
（2）PCR
先用上游引物和下游引物Ⅰ进行PCR，再以PCR 产物为模板,用上游引物和下游引物Ⅱ-T7进行二次PCR(具体操作参见PCR章节)。
（3）探针合成标识和纯化
在0.5ml 离心管中加入下列试剂：
RNasin （40U/μl） 0.5μl  
GACU POOL GAC  
（含GTP、CTP、ATP各2.75 mM,UTP 61μM） 2μl  
[α-32P]UTP(10μCi/μl) 2.5μl  
DTT (二硫苏糖醇，0.1M) 1μl  
5×转录 buffer 2μl  
模板（50ng/μl） 1μl  
T7 RNA 聚合酶 (15U) 1μl  
混合后，短暂离心，37OC保温1hr。  
加入DNaseⅠ（10U/μl）1μl, 37OC 15min, 然后75 OC 10min以灭活DNAseⅠ和T7 RNA 聚合酶。  
加入：饱和酚 50μl  
氯仿 50μl  
酵母tRNA（2μg/μl） 4μl  
DEPC H2O 100μl  
室温下充足混匀，离心10000g×2min。取上层液置另一0.5 ml离心管中，加入100μl氯仿，混匀，离心10000g×2min。将上层液转移至另一0.5ml 离心管中，再加入3M NaAc 10μl、预冷无水乙醇250μl，混匀后，-20OC静置30min。4OC离心13500g×10min。弃上清液，沉淀用75%乙醇100μl洗涤，4OC离心13500g×2min, 弃上清液。室温下挥发残留乙醇。加入50μl杂交缓冲液溶解沉淀，4OC下保留待用。可用尿素-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测探针质量。（参见本节电泳步骤）。  
2．杂交  
（1） RNA提取后溶解在杂交缓冲液中，浓度为1μg/μl。  
（2）取8μl RNA加入1-3μl探针（依据探针检测结果调整）于0.5ml 离心管中。  
（2） 80OC保温2min，然后40-45OC下杂交12-18hr。  
3. 消化  
(1) 杂交管于37 OC保温15min，加入RNase消化液，37 OC保温30min。  
(2) 加入10%SDS 10μl、10μg/μl蛋白酶K 20μl，混匀，37 OC保温10min。  
(3) 加入65μl饱和酚和65μl氯仿，混匀，室温离心，10000g×2min。  
(4) 转移上层液到另一0.5离心管中，加入10μl酵母tRNA和3M NaAc 15μl，再加入200μl异丙醇，混匀后，置-20OC 30min，4 OC离心,135000g×10min。  
(5) 弃上清液，室温下挥发乙醇，加入5-8μl上样缓冲液溶解沉淀。  
4、电泳和放射自显影  
（1）配制凝胶：(50ml)  
40%丙烯酰胺-亚甲双丙烯酰胺（19：1） 6.25ml
5×TBE 10ml
尿素 24g
加H2O至50ml
溶解后加入25%过硫酸胺50μl，TEMED 50μl，混匀，注入电泳槽中，插入梳，待胶凝固。
（2）预电泳
以1×TBE为上下槽电泳缓冲液，加上电压后进行预电泳，假如用测序电泳装置，电压应达v以上，功率设定为100w，温度设为50 OC。待胶板温度达50 OC时，暂停电泳，准备加样。  
（3）加样  
将已溶解在加样缓冲液中样品80 OC加热2min，立即加样到胶孔中，电泳1-2hr。（电泳条件同预电泳）。  
（3） 电泳结束后，打开胶板，用滤纸取下胶，覆上一层保鲜膜，放置于暗盒中，暗室红光下，压上一张X片，盖上暗盒，-70OC曝光1-3天。暴光结束后，将X光片显影、定影、水洗、晾干。  

三、注意事项  
1．本试验大部分为RNA操作，注意RNA酶污染。  
2．RNase消化液消化未杂交单链RNA和探针RNA，当探针和样品之间有碱基错配时，错配位点也将被消化，所以会产生片段较小杂交片段。所以进行PCR时，采取尽可能降低错配方法。
3、 同位素对RNA合成有一定影响，有时会产生非全长探针。所以，标识时间不宜过长。
4、 RNase消化液有时会产生过分消化而无检测信号，能够将消化液稀释10-100倍后使用。

可能问题出在标本保留：通常四小时之内就应处理，分离出细胞  
说是套式PCR,能够在你第一次PCR两个引物内,再设计一对引物进行第二次PCR就行了  
假如你第一次PCR刚好包含目标片段,那只好设计个更长了
第二次引物设计要求能够低一点
以50μl体系为例
引物各1μl
第一次PCR产物5μl
二次PCR和巢式PCR，即设计两对引物进行扩增，不是一个概念，它是拿第一次PCR产物，稀释100-1000倍做模板，加入底物，从新进行扩增反应，以期增加产物量
我做RT-PCR时,提总RNA时,全部是用灭菌DEPC水,按1:100稀释后测OD260和OD280,后依据公式:RNA浓度=OD260*稀释度/25(ug/ul),后用1mg total RNA分离mRNA.做逆转录及PCR,效果很好.
luoyu10 wrote:
各位大哥：
我有一个问题请教，RT-PCR要求模板RNA260nm/280nm比值最低为多少，假如太低是不是会影响结果？
最低到1.8，最好2.0，我感觉稍微低一点影响不算太大。
问：我是ＲＴ－ＰＣＲ新手，想请教引物怎样设计？
好引物所含有令人满意特点：
*  经典引物18到24个核苷长。引物需要足够长，确保序列独特征，并降低序列存在于非目标序列位点可能性。不过长度大于24核苷引物并不意味着更高特异性。较长序列可能会和错误配对序列杂交，降低了特异性，而且比短序列杂交慢，从而降低了产量。
*  选择GC含量为40％到60％或GC含量反应模板GC含量引物。
*  设计5’端和中间区为G或C引物。这会增加引物稳定性和引物同目标序列杂交稳定性。
*  避免引物对3’末端存在互补序列，这会形成引物二聚体，抑制扩增。
*  避免3’末端富含GC。设计引物时确保在最终5个核苷中含有3个A或T。
*  避免3’末端错误配对。3’端核苷需要同模板退火以供聚合酶催化延伸。
*  避免存在可能会产生内部二级结构序列，这会破坏引物退火稳定性。
目标序列上并不存在附加序列，如限制位点和开启子序列，能够加入到引物5’端而不影响特异性。当计算引物Tm值时并不包含这些序列，不过应该对其进行互补性和内部二级结构检测。
有时候，仅有有限序列信箱可供用于引物设计。比如，假如仅知道氨基酸序列，能够设计简并引物。简并引物是指代表编码单个氨基酸全部不一样碱基可能性不一样序列混合物。为了增加特异性，能够参考密码子使用表，依据不一样生物碱基使用偏好，降低简并性。次黄嘌呤能够同全部碱基配对，降低引物退火温度。不要在引物3’端使用简并碱基，因为3’端最终3个碱基退火足以在错误位点起始PCR。使用较高引物浓度（1μM到3μM），因为很多简并混合物中引物不是特异性针对目标模板。
【经验】怎样确定RNA质量
各位全部知道，提取到质量良好RNA（包含总RNA和mRNA，以下同）是很困难，相关RNA提取技术，我就不说了，为何呢？或许各位很关心呢，我是这么想，我能够看到资料或是厂家说明书，各位也一样能够看到，内容当然全部是一样了，所以试验做好不好，关键是心投入多少问题，所以期望大家自己多多思索啊！
以下两种方法，相信大家全部知道：
1）检测RNA溶液吸光度
280、320、230、260nm下吸光度分别代表了核酸、背景（溶液浑浊度）、盐浓度和蛋白等有机物值。通常，我们只看OD260/OD280（Ratio，R）。
1.82.0时，我们认为RNA中蛋白或时其它有机物污染是能够容忍，不过要注意，当你用Tris作为缓冲液检测吸光度时，R值可能会大于2（通常应该是<2.2）。当R<1.8时，溶液中蛋白或时其它有机物污染比较显著，你能够依据自己需要决定这份RNA命运。当R>2.2时，说明RNA已经水解成单核酸了。
假如RNA量够，可在260nm（A260）用分光光度法测定RNA得率，1个单位等于40ug/mlssRNA。纯RNAA260/A280比值为2.0。A260/A230比值还表明RNA纯度，其值小于2.0表明裂解液中有亚硫氰胍和belta-巰基乙醇残留，其值大于2.4，需用乙酸盐，乙醇沉淀RNA。
2）RNA电泳图谱
通常，RNA电泳全部是用变性胶进行，不过依据我经验，假如你仅仅是为了检测RNA质量是没有必需进行如此麻烦试验，用一般琼脂糖胶就能够了。
电泳目标是在于检测28S和18S条带完整性和她们比值，或是mRNA smear完整性。通常，假如28S和18S条带明亮、清楚、条带锐利（指条带边缘清楚），而且28S亮度在18S条带两倍以上，我们认为RNA质量是好（见下图）。
以上是我们常见两种方法，不过这两种方法全部无法明确告诉我们RNA溶液中有没有残留RNA酶。假如溶液中有很微量RNA酶，用以上方法我们极难觉察，不过大部分后续酶学反应全部是在37度以上而且是长时间进行。这么，假如RNA溶液中有很微量RNA酶，那么在后续试验中就会有很适合环境和时间发挥它们作用了，当然这时你试验也就完了。
下面，我们介绍一个能够确定RNA溶液中有没有残留RNA酶方法。
3）保温试验
方法很简单，根据样品浓度，从RNA溶液中吸收两份1000 ngRNA加入至0.5 ml离心管中,而且用pH7.0Tris缓冲液补充到10 ul总体积，然后密闭管盖。把其中一份放入70℃恒温水浴中,保温1 h。另一份放置在-20℃冰箱中保留1 h。
时间到了以后，取出两份样本进行电泳。电泳完成后，比较二者电泳条带。假如二者条带一致或无显著差异（当然，它们条带也要符合方法2中条件），则说明RNA溶液中没有残留RNA酶污染，RNA质量很好。相反，假如70℃保温样本有显著降解，则说明RNA溶液中有RNA酶污染。
假如你RNA样本经过了保温试验检测而且你在后续试验中还是很小心防范RNA酶骚扰，那么你试验应该是极难失败了！