HTRA3基因对脉络膜新生血管和M2型巨噬细胞极化的影响.pdf

欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁氉氉氉氉引文格式：肇莉莉，王萍，孙连义，马为梅，张乐，喻磊 基因对脉络膜新生血管和 型巨噬细胞极化的影响 眼科新进展，（）：【实验研究】基因对脉络膜新生血管和 型巨噬细胞极化的影响肇莉莉王萍孙连义马为梅张乐喻磊欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁氉氉氉氉作者 简 介：肇 莉 莉（：），女，年 月出生，辽宁人，硕士研究生，副主任医师。研究方向：眼科学。：通信作者：喻磊（：），男，年 月出生，陕西人，硕士研究生，主任医师，儿童眼病中心主任。研究方向：眼科学。：收稿日期：修回日期：本文编辑：盛丽娜基金项目：陕西省自然科学基础研究计划项目（编号：）；陕西省卫生健康科研基金项目（编号：）作者单位：陕西省西安市，西安市人民医院（西安市第四医院），陕西省眼科医院，西北大学附属人民医院眼科（肇莉莉，王萍，孙连义，马为梅，喻磊）；陕西省西安市，西北妇女儿童医院眼科（张乐）【摘要】目的探讨 丝氨酸肽酶（）基因对脉络膜新生血管（）和 型巨噬细胞极化的影响。方法收集 例湿性年龄相关性黄斑变性（）患者（组）和 例同期健康体检者（健康组）的空腹静脉血，通过 检测血清 水平。将 细胞随机分为对照组、组和 组，使用 将 和 慢病毒载体分别转染到 组和 组 细胞中，通过 和 检测 的转染情况。将 细胞随机分为 组、组、组和 组，细胞转染后，组 细胞在完全 培养基中进行常氧培养，其他组细胞在添加 氯化钴（）的 培养基中进行低氧培养，使用 测定小管形成。将 小鼠随机分为对照组、组、组和 组，每组 只。对照组为未建模的小鼠，其他组为激光诱导的 模型小鼠。向 组和 组小鼠玻璃体内分别注射 滴度为 的 和 慢病毒载体。对照组和 组小鼠注射 。注射后，对小鼠进行荧光素眼底血管造影（）检测和眼球苏木精伊红（）染色。通过 检测 细胞或各组小鼠脉络膜组织中 、类几丁质酶 样蛋白（）、精氨酸酶 （）、诱导型一氧化氮合酶（）、环氧化酶 （）和血管内皮生长因子（）水平。通过 检测 细胞或脉络膜组织中 、和细胞核核因子 （）的蛋白表达水平。结果与健康组比较，组患者的血清 水平升高（，）。与对照组和 组比较，组 细胞的 和蛋白表达水平降低（）。与 组比较，组 细胞的闭合管腔数量、和 的 和蛋白表达水平均增加（均为 ）。与 组比较，组 细胞的闭合管腔数量、和 的 和蛋白表达水平均减少（均为 ）。与对照组比较，组小鼠的 的 和蛋白表达水平增加，相对荧光强度升高，和 水平升高，和 水平降低，细胞核 蛋白表达水平升高（均为 ）。与 组比较，组小鼠的 的 和蛋白表达水平减少，相对荧光强度降低，和 水平降低，和 水平升高，细胞核 蛋白表达水平降低（均为 ）。结论下调 可抑制 形成和 型巨噬细胞极化，可能是防治 的重要潜在靶点。【关键词】湿性年龄相关性黄斑变性；脉络膜新生血管；丝氨酸肽酶 ；型巨噬细胞极化【中图分类号】湿性年龄相关性黄斑变性（）是一种累及视网膜黄斑区的眼病之一，在老年人群中具有较高的发病率 。脉络膜新生血管（）是 的典型病变，也是导致患者视力丧失的主要原因 。目前，虽然玻璃体内注射血管内皮生长因子（）抑制剂在治疗 方面取得了一定疗效 ，然而，抗 药物存在耐药性问题 ，并且会引起眼压升高 、眼部感染 等并发症，因此，仍需要开发 的新型治疗手段。免疫微环境失衡是导致 的始发因素，病变部位出现大量巨噬细胞浸润，这些巨噬细胞通过分泌 和炎性因子促进血管内皮细胞增殖并引起新生血管渗漏，导致 形成 。巨噬细胞具有可塑性，可极化为 和 型，其中 型极化可导致脉络膜血管形成 。因此，调控巨噬细胞表型是治疗 的有效途径。丝氨酸肽酶 （）是 年首次报道的一个蛋白质编码基因，位于染色体 上 。与 类似，都能抑制转化生长因子 家族蛋白介导的信号通路 。据报道，基因启动子里的一个单核苷酸多态性与 有关联，含有 多态性的人群发生 的危险度比正常人高 倍 。在 小鼠视网膜中表达升高，提示 很可能参与 病变的进展 。另外，可能调节免疫细胞功能 。本研究旨在揭示 基因对 和 型巨噬细胞极化的影响，从而开发 的新型治疗靶标。材料与方法 材料 实验试剂慢病毒载体由吉玛基因合成。培养眼 科新进展 年 月第 卷第 期 ：基（货号：）购自美国 公司。氯化钴（）（货号：）购自美国 公司。（货号：）购自美国 公司。（货号：）购自美国 公司。苏木精伊红（）染色试剂盒（货号：）、（货号：）、裂解液（货号：）、试剂盒（货号：）购自碧云天生物技术研究所。荧光素钠（货号：）购自美国 公司。试剂盒（货号：）购自日本 公司。（货号：）购自美国 公司。（货号：）、（货号：）、核因子 （）（货号：）、（货号：）和 （货号：）一抗以及 标记的 二抗（货号：）购自英国 公司。实验细胞和动物恒河猴脉络膜血管内皮细胞系（）购自美国 。只 级雄性老龄 小鼠（个月龄，体重 ）由西北大学提供 （陕）。小鼠在 、相对湿度、循环照明环境中使用标准小鼠饲料和纯净水饲养。方法 血清样本收集 年 月至 年 月期间，收集西安市人民医院（西安市第四医院）就诊的 例 患者为 组，其中男 例，女 例，年龄 （）岁，参考 国际诊断标准 对患者进行诊断。剔除伴有其他视网膜疾病、恶性肿瘤、心脑血管系统疾病、器官病变及接受治疗的 患者。收集同期来院体检的健康者 例为健康组，其中男 例，女 例，年龄 （）岁。健康组与 组受试者的年龄、性别比例相比，差异均无统计学意义（均为 ）。收集两组受试者的空腹静脉血，检测血清 水平。本研究通过西安市人民医院（西安 市 第 四 医 院）伦 理 委 员 会 审 批（审 批 号：），受试者均知情同意。细胞培养与转染处理将 细胞培养在添加体积分数 胎牛血清和 双抗的 培养基中，置于 和含体积分数 的细胞培养箱中培养。细胞生长至对数期后用于实验。将 细胞随机分为对照组、组和 组，孔板中接种 细胞并培养至 融合，按照试剂盒说明，使用 将 和 慢病毒载体分别转染到 组和 组 细胞。对照组细胞不进行转染。转染 后，通过 和 检测 的转染效率。每组设置 个复孔。细胞分组及处理验证 转染效率后，将 细胞随机分为 组、组、组和 组。其中，组和 组细胞分别转染 和 ；组 细胞在完全 培养基中进行常氧培养，其他组细胞在添加 的 培养基中进行低氧培养。每组设置个复孔。小管形成测定使用 （每孔 ）包被 孔板，室温静置 ，加入 分组处理后的细胞 （每孔 个 细胞），培养 后在显微镜下观察小管形成情况，软件计算闭合管腔数量。每组设置 个复孔。激光诱导 小鼠模型使用复方托吡酰胺滴眼液对小鼠进行散瞳，苯巴比妥钠经腹腔注射麻醉小鼠（）。围绕视盘用氩激光（激光波长 ，输出功率 ，曝光时间 ，光斑直径 ）对小鼠双眼发射四个激光点。光凝后有白色气泡产生证实 膜破裂，表明建模成功。动物分组及处理将小鼠随机分为对照组、组、组和 组，每组 只。对照组为未建模的小鼠，其他组为 建模成功的小鼠。使用盐酸奥布卡因进行表面麻醉，然后使用 穿刺针头向 组和 组小鼠玻璃体内分别注射 滴度为 的 和 慢病毒载体，对照组和 组小鼠玻璃体内注射 ，均为双眼注射。注射后给予左氧氟沙星滴眼液抗感染。荧光素眼底血管造影注射后 ，所有小鼠均行荧光素眼底血管造影（）检查。使用复方托吡酰胺滴眼液对各组小鼠进行散瞳，苯巴比妥钠经腹腔注射麻醉小鼠（）。然后经腹腔注射 荧光素钠，后拍摄眼底照片，在 激发光和 发射光下使用滤光片获取图像。使用 软件计算 的平均荧光强度。样本收集所有小鼠 检查结束后处死，摘取双眼眼球，取双眼中任意一只眼球行 多聚甲醛固定，用于 染色；另一只眼球在显微镜下冰上小心去除结缔组织和肌肉，去除眼前节，分离出脉络膜组织，与生理盐水混合并研磨匀浆，用于 和 检测。眼球 染色 多聚甲醛固定眼球 。常规制成 厚的石蜡切片，根据试剂盒说明进行 染色。：眼 科新进展 年 月第 卷第 期 检测通过 检测 患者和健康体检者的血清中 水平，并检测 细胞或各组小鼠脉络膜组织中 、类几丁质酶 样蛋白（）、精氨酸酶（）、诱导型一氧化氮合酶（）、环氧化酶 （）和 水平。试剂提取总 。使用逆转录试剂盒将 逆 转 录 为 ，然 后 在 型荧光定量 仪上使用 进行扩增。扩增程序：，、，循 环 次。引 物 序 列 见 表 。为内参基因。通过 法计算基因相对表达量。表 引物序列基因引物序列 ：检测通过 裂解液提取 细胞或小鼠脉络膜组织总蛋白，然后在 上分离蛋白并转移到 膜上，脱脂牛奶室温封闭 。然后与 稀释的 、和 一抗在 下孵育过夜。然后将膜与 稀释的 标记的 二抗在室温下孵育 。显影，软件测定条带灰度值。作为核蛋白内参，作为总蛋白内参。统计学分析使用 软件行统计分析，定量数据采用均数 标准差表示。组间差异比较采用 检验或单向方差分析。检验水准：。结果 患者和健康体检者的血清 水平与健康组（）比较，组患者的血清中 水平（）升高，差异有统计学意义（，）。下调 抑制缺氧诱导的 细胞小管形成 细胞转染后，与对照组和 组比较，组 细胞的 和蛋白表达水平均降低（均为 ）（表 和图 ）。缺氧处理后，与 组比较，组 细胞的闭合管腔数量、和 的 和蛋白表达水平均增加（均为 ）；与 组比较，组 细胞的闭合管腔数量、和 的 和蛋白表达水平均减少（均为 ）；组与 组 细胞的闭合管腔数量、和 的 和蛋白表达水平相比，差异均无统计学意义（均为 ）（表 、图 、表 和图 ）。表 各组 细胞的 和蛋白相对表达量组别 蛋白对照组 组 组 注：与对照组比较，；与 组比较，。图 检测各组 细胞 蛋白表达表 各组 细胞 和蛋白相对表达量组别 蛋白组 组 组 组 注：与 组比较，；与 组比较，；与 组比较，。图 检测各组 细胞 蛋白表达眼 科新进展 年 月第 卷第 期 ：表 各组 细胞的闭合管腔数量、和蛋白相对表达量组别闭合管腔数量 个 蛋白组 组 组 组 注：与 组比较，；与 组比较，；与 组比较，。：各组 细胞的小管形成图；：各组 细胞的 蛋白条带。图 下调 对缺氧诱导的 细胞小管形成和 蛋白表达的影响 下调 抑制 小鼠脉络膜血管生成与对照组比较，组小鼠的 和蛋白表达水平均增加（均为 ）；与 组比较，组小鼠的 和蛋白表达水平均减少（均为 ）；组与 组小鼠的 和蛋白表达水平相比，差异均无统计学意义（均为 ）（表 和图 ）。对照组小鼠脉络膜形态正常；组和 组小鼠脉络膜结构紊乱，脉络膜增生，膜破裂，血管生成增加；组小鼠脉络膜病变减轻，脉络膜增生和血管生成减少（图 ）。与对照组比较，组小鼠的 相对荧光强度升高（）；与 组比较，组小鼠的 相对荧光强度降低（）；组与 组小鼠的 相对荧光强度相比，差异无统计学意义（）（表 和图 ）。下调 对 小鼠脉络膜组织中巨噬细胞极化的影响与对照组比较，组小鼠脉络膜组织中 型巨噬细胞标志物 和 水平升高，型巨噬细胞标志物 和 水平降低（均为 ）；与 组比较，组小鼠脉络膜组织中 和 水平降低，和 水平升高（均为 ）；组与 组小鼠脉络膜组织中 、和 水平相比，差异均无统计学意义（均为 ）（表 ）。表 各组小鼠脉络膜组织中的 和蛋白相对表达量以及 相对荧光强度组别 蛋白 相对荧光强度对照组 组 组 组 注：与对照组比较，；与 组比较，；与 组比较，。图 检测各组小鼠脉络膜组织中 蛋白表达：图；：染色图。图 下调 对 小鼠脉络膜血管生成的影响表 各组小鼠脉络膜组织中 、和 的 相对表达量组别 对照组 组 组 组 注：与对照组比较，；与 组比较，；与 组比较，。：眼 科新进展 年 月第 卷第 期 下调 对 小鼠脉络膜组织 信号通路的影响对照组、组、组和 组小鼠脉络膜组织中的细胞核 蛋白相对表达量依次为 、（，）。与对照组比较，组小鼠的脉络膜组织中细胞核 蛋白表达水平升高（）；与 组比较，组小鼠的脉络膜组织中细胞核 蛋白表达水平降低（）；组与 组小鼠脉络膜组织中细胞核 蛋白表达水平相比，差异无统计学意义（）（图 ）。图 检测各组小鼠脉络膜组织中的细胞核 蛋白表达 讨论 是 患者视力丧失的主要原因，虽然抗 治疗可以抑制 形成，但也可能引起多种并发症 ，因此，仍需要开发新型 治疗手段和治疗靶点。家族是一种热休克诱导的蛋白酶家族，在进化过程中非常保守，该家族成员不仅参与调节细胞存活、线粒体稳态、胎盘发育等多种生理功能，而且参与癌症、神经退行性疾病、关节炎等多种病理过程的发生和发展 。目前，家族成员中 的研究较多。据报道，多态性与 的发生相关 。患者房水中的 水平高于白内障患者，并且经雷珠单抗玻璃体内注射治疗后 水平降低 。调节血管生成功能，的升高与早产儿视网膜病变的发生风险相关 。然而，在 中的研究较少。本研究观察到 患者的血清 水平较健康人明显升高，提示 可能参与了 的发病过程。由于 与 具有高度同源性和结构相似性，这两种酶在人体组织中的表达模式相似，提示它们可能具有相似的生物学活性和互补的生理功能 。据报道，在 小鼠视网膜中表达升高 。视网膜缺氧是 的主要病因之一 ，缺氧可诱导 形成 。本研究通过转染 慢病毒下调了 细胞中的 ，然后对 细 胞 进 行 缺 氧 处 理，结 果 表 明，下 调 抑制了缺氧诱导的 细胞小管形成，并下调了 的表达。另外，激光诱导 是一种模拟了人类 的动物建模方法 。本研究建立了激光诱导的 小鼠模型，然后对小鼠玻璃体内注射 慢病毒，结果表明，下调 减轻了 小鼠脉络膜病变，抑制了血管生成和 生成。等 报道，是一种含有胰岛素样生长因子（）结合结构域的新型丝氨酸蛋白酶，在小鼠胎盘形成过程中在母胎界面选择性表达，在介导血管和胎盘形成中起着关键作用。本研究证实，水平影响 细胞小管形成及血管生成因子 的表达水平。据报道，是一种调节脑内皮细胞特异性应答的基因，与前脑血管发育有关 。敲除 抑制了滋养层细胞 的 侵 袭 和 血 管 生 成 。这 些 结 果 说 明 可促进血管生成和 形成。发病过程中免疫微环境失衡，大量巨噬细胞浸润是免疫微环境失衡的重要因素，因为巨噬细胞可促进血管内皮细胞增殖并引起新生血管渗漏 。发病过程中巨噬细胞主要通过 型极化诱导 形成 。巨噬细胞发生 型极化后可分泌包括 在内的多种促血管生成因子。本研究结果表明，下调 降低了 小鼠脉络膜组织中 型巨噬细胞标志物（和 ）的表达，上调了 型巨噬细胞标志物（和 ）的表达，抑制了 型巨噬细胞极化。有学者研究表明，家族的基因突变影响巨噬细胞的存活率 。另外，与胃癌的免疫细胞浸润程度相关 。的高表达与获得性免疫细胞（细胞、辅助细胞、中央记忆细胞等）呈负相关，与天然免疫细胞（细胞、肿瘤相关巨噬细胞、未成熟树突状细胞等）呈正相关 。因此我们推测，可能通过促进 型巨噬细胞极化参与了 发病过程。信号通路参与激活 患者脉络膜和视网膜中的炎症反应 ，信号通路的激活与 形成有关 ，信号通路的激活在包括 在内的多种疾病中起到促进血管生成作用 。因此，抑制 信号通路是治疗 的有效策略 。其他学者报道，高表达可能激活 通路 。本研究结果表明，下调 抑制 小鼠脉络膜组织 的核转位。据报道，可直接与 启动子（氨基酸 ）结合，阻断 可显著抑制 信号通路 。考虑到 与 具有高度同源性和结构相似性，并且表达模式相似 ，我们推测，可能与 具有结合位点，下调 对 形成的抑制作用也可能与抑制 信号通路有关。结论 可促进血管生成和 形成，可能通过眼 科新进展 年 月第 卷第 期 ：促进 型巨噬细胞极化参与了 的发病过程，通过下调 可抑制 形成和 型巨噬细胞极化，该作用可能与 信号通路有关。本研究结果提示，可能是防治 的重要潜在靶点。参考文献 ，（）：，（）：，（）：，：，（）：，：，：，：，（）：，（）：，：，（）：，（）：，（），（）：，（）：，（）：，（）：刘培源 两种视网膜下新生血管小鼠模型基因表达谱的 研究 汕头：汕头大学，：，：，（）：，（）：，（）：，：，（）：张敬法，赵珍珍 湿性年龄相关性黄斑变性发病机制及治疗 眼科新进展，（）：，（）：陶方方，亢泽峰，陈水龄，褚文丽，刘健，周志豪 加减驻景方对脉络膜新生血管动物模型缺氧信号因子表达的影响 中国中医眼科杂志，（）：，（）：，：，（）：，?，（）：，（），（）：，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：眼 科新进展 年 月第 卷第 期 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