肿瘤冷冻消融术的作用机理及应用.pdf

Chinese Journal of Biomedical Engineering2023年12 月December2023中医生国报程Vol.42物No.6学学42卷6 期肿瘤冷冻消融术的作用机理及应用陈目刘威刘宝林（上海理工大学健康科学与工程学院生物系统热科学研究所，上海200093)摘要：冷冻消融术是一种肿瘤微创治疗手段。该技术借助冷媒（例如氮气和氨气）进行反复冻融循环，通过冰晶损伤、微循环损伤、细胞调亡和免疫效应等机理，对肿瘤细胞和组织造成损害。近年来，冷冻消融技术以其侵人性小、靶向性高、能实现术中可视化监测等优点，被广泛应用于许多类型肿瘤的治疗中，然而冷冻消融技术还面临着会引起多种并发症、冷冻边界难以控制等诸多难题。综述冷冻消融的作用机理、技术特点、应用现状、主要优缺点及发展趋势，讨论如何通过优化冻融方案、联合免疫疗法等来改善冷冻消融并发症，并对实现大尺寸肿瘤的完全消融所面临的挑战进行展望和总结。关键词：冷冻消融；冻融循环；氩氮刀；肿瘤中图分类号：R318文献标志码：A文章编号：0 2 58-8 0 2 1（2 0 2 3）0 6-0 7 57-12The Mechanism and Applications of Cryoablation for TumorChen MuLiu WeiLiu Baolin*(Institute of Biothermal and Technology,School of Health Science and Engineering,University of Shanghai for Science and Technology,Shanghai200093,China)Abstract:Cryoablation is a non-invasive tumor therapy which carry out repeated freeze-thaw cycles with the aidof refrigerant(eg.nitrogen and helium),causing damage to the tumor tissues by ice crystals formation,microcirculation injury,apoptosis and cryo-immunologic response.In recent years,cryoablation has become animportant treatment method for many types of tumors due to its less invasiveness,high targeting property andgood visualization of the ice ball in cryotherapy.However,cryoablation still faces many difficulties,such ascausing several kinds of complications and the freezing boundary is difficult to control.This paper reviewed themechanism,technical features,application status,main advantages and disadvantages and development trend ofcryoablation.At the same time,how to improve the complications of cryoablation by optimizing the freeze-thawprogram and combining immunotherapy were also discussed.The challenges facing the complete ablation oflarge tumors were prospected and summarized.Key words:cryoablation;freeze-thaw cycles;argon-helium cryosurgery;tumor引言近年来，冷冻消融已经成为一种应用广泛的肿瘤治疗手段，用于从头部到足部的许多器官区域，大量研究集中于肝、肾、肺、前列腺和乳腺等部位。冷冻消融技术的应用可以追溯到19 世纪中期,JamesArnott证明了将盐水溶液冷冻到-2 0 后用于治疗，可以减小乳腺癌、子宫癌和皮肤癌的肿doi:10.3969/j.issn.0258-8021.2023.06.013收稿日期：2 0 2 2-0 5-0 7，录用日期：2 0 2 2-12-0 8基金项目：国家自然科学基金（517 7 6 130）*通信作者（Corresponding author），E-ma i l：b l l i u k 16 3.c o m瘤尺寸，并减轻患者疼痛2 。到2 0 世纪中期，封闭探针式液氮制冷设备被研发出来并投入使用，但液氮易挥发、运输储存不便，所以该设备应用范围较小。19 9 8 年美国成功研制出第一台氩氨冷冻消融设备美国氩氨刀（EndocareCryocareTMSurgicalSystem），并获美国食品及药物管理局（Food andDrugAdministration,FDA）批准，这是冷冻技术的一次重大创新，自此冷冻消融技术开始被用于多种恶758中42卷生报程医学学国物性肿瘤的治疗3O在冷冻消融过程中，为了确保对肿瘤的最大致死率,产生一个超过肿瘤边界的冰球是必要的，但这样又会对正常组织造成一定的损害。理论上，肿瘤的致死等温线在冰球边缘5 10 mm内，因此理想情况下,冰球应该延伸到肿瘤边缘10 mm以外4。为了改进治疗计划，将对肿瘤周边的正常组织的损害减至最少，在过去的几十年里，针对肿瘤边界的数值模拟逐渐开始被研究5在临床实践中，操作人员一般都是根据冷冻消融设备制造商提供的预计冰球尺寸来确定冷刀的位置，这些冰球尺寸是基于动物研究或凝胶模型中的消融实验获得的。而在手术过程中，需要准确、详细地了解肿瘤在冷冻过程中等温线的变化，因此在治疗前通过建模来模拟等温线，预测冰球尺寸对指导外科医生进行手术是非常重要的。研究人员对多探针冷冻消融肿瘤组织进行建模，并将模拟结果与使用热电偶测量在凝胶模型中产生的冰球尺寸进行比较，发现模拟的温度分布与实测数据一致，差异仅为几个开尔文，且数值模拟可以预测冰球的最小消融裕度，这种足够准确和快速的冰球预测是使冷冻消融走向临床应用的重要一步6-9 冷冻消融引起的细胞死亡机制表现为级联反应，包括冰晶形成对细胞的直接损伤、解冻后微循环的破坏、细胞凋亡和坏死诱导的免疫效应3。对冷冻消融损伤肿瘤细胞的机制进行研究可以保证对肿瘤的有效治疗，同时也能通过促调亡或免疫应答等辅助疗法，提高冷冻手术疗效。对于不同类型的肿瘤，由于存在个体间差异和手术不确定性，冷冻消融技术的疗效和对患者死亡率的改善有很大差异。例如与其他器官相比，肝脏由于含有较大直径的血管，会从消融区带走冷量而导致无法达到较低的温度，消融效果较差10 。除组织本身类型不同外，冷冻和解冻过程的速率、冷冻持续时间、冻融循环次数以及组织最终所达到的温度是影响消融效果的主要原因，在实际应用过程中对这些因素进行优化,能有效改善冷冻消融技术的疗效。相对手术切除，冷冻消融技术临床应用较为有限，对不同癌症的冷冻消融治疗进行比较，针对不同癌症的治疗条件、治疗后并发症发生情况进行优化，可以改善临床结果，使冷冻消融得到更广泛的使用。文中结合国内外冷冻消融技术治疗肿瘤的最新进展，综述该技术的研究现状和临床应用。1冷冻消融技术的作用机理1.1冷冻消融设备类型从原理上来说，冷冻消融设备分为焦耳-汤姆逊效应（J-T效应）原理制冷设备和相变制冷设备两种。相变制冷设备中以液氮冷冻系统应用最为广泛，该类设备一般包括液氮储存罐、传输管道、冷刀、真空泵等结构部件，如图1所示。真空泵在刀柄、刀杆内形成真空以有效绝热，避免伤及正常组织。系统启动后，液氮在压力作用下经过传输管道到达刀头，在刀头发生相变后产生制冷效果，氮气和未气化的液氮通过管道返回到储存器中。之后再用射频加热、运输高温流体至刀头加热、将回收的氮气加热后送回刀头等方法进行复温。由于复温模块结构复杂、还需添加回收气体管道，导致冷刀直径太大，在手术时会造成较大的创伤，且冷刀本身的换热性能和绝热性能不佳，存在冷冻消融治疗的过程控制难度较大的缺点，因此相变制冷设备逐渐被J-T效应设备所取代J-T效应即大多数高压气体经绝热膨胀能达到较低的温度，可对肿瘤组织进行冷冻破坏。该类设备中氩氨刀的应用最为广泛，其冷冻系统的低温探针本质上是一个高压闭环的气体膨胀系统，如图2所示。室温下高压氩气从进气道经翅片管内部进气，到达低温探针的远端，通过节流阀节流后再膨胀到大气压力。氩气快速膨胀使温度下降，然后通过对流和热传导迅速使低温探头的金属壁降温，低温气体从翅片管外排出，同时预冷管内的高温氩气。由于氨气独特的物理特性，其在室温下节流膨2图1液氮低温设备原理（1-压力稳定阀；2-液氮杜瓦瓶；3-冷刀刀头；4-真空泵；5-回收器）Fig.1Schematic diagram of liquid nitrogen cryogenicequipment（1-Pr e s s u r e s t a b iliz e r;2-Liq u id n it r o g e ndewar;3-Cutter bit;4-Vacuum pump;5-Recoverer)759陈目，等：肿瘤冷冻消融术的作用机理及应用6期3图2 氩氢刀内部结构（1-进气道；2-出气道；3-翅片管换热器；4-节流阀；5-热电偶）Fig.2Internal structure drawing of argon-helium knife(1-Inlet;2-Gas off-take;3-Finned tube heat exchanger;4-Throttle valve;5-Thermoelectric)胀则会升温，在同样的系统中，高压氨气膨胀到大气压时升温，使得探针温度升高，从而对癌变组织完成一个冻融循环。冷冻消融技术通过将冷冻探针与图像引导技术结合，快速降温，精准定位，具有微创、对周围组织保存更好以及可视化的术中监测等优点，为不适合常规治疗的患者提供了一种新的选择。1.2冷冻消融损伤机理冷冻手术部位的特征是损伤分为界限明显的两个区域，一个是细胞产生胞内冰，完全凝固性坏死的中心区域，另一个是以不同程度的细胞损伤和调亡为特征的边缘区域，如图3所示。其中包含的作用机理主要有冰晶损伤、微循环损伤、细胞调亡和免疫效应。1.2.1冰晶引起的损伤冰晶引起的细胞损伤可以用双因素假说来解释，即快速冷冻时的细胞内冰形成和慢速冷冻时的溶液效应。靠近低温探针处组织的降温速率较快，快速冷却会产生胞内冰损伤，在-1 5 左右细胞会发生异相成核，胞内冰晶的产生对质膜和细胞器造Q免疫调控冷冻探针调亡O胞外冰损伤胞内冰摄伤血管微播环损伤-160mC图3冷冻消融中不同区域的细胞死亡机制Fig.3Mechanisms of cell death in different regionsduring cryoablation成直接损伤，并且是致命的，是快速冷冻时对肿瘤损伤的主要机制 1 2 O离探针较远的区域降温速率较低，此时细胞产生胞外冰，使胞外处于高渗环境，细胞脱水皱缩，压迫细胞膜和细胞器，增加细胞内电解质浓度，产生溶液损伤。溶液损伤通常被认为是冷冻过程中胞内空间电解质浓度升高的结果，而对于冷冻期间发生的相变（即水/冰相变和共晶相变）引起的损伤则没有过多的文献报道。与共晶结晶相关的直接细胞损伤有两种可能的损伤机制：细胞膜与共晶直接或间接接触所造成的机械损伤和通过细胞内共晶结晶产生的损伤。在冷冻消融过程中，诱导共晶形成可能会增强细胞的破坏，对冻融过程中冰晶和共晶两相结合的研究可以为加强冷冻消融技术的治疗效果奠定理论基础 1 3在复温过程中，细胞内的小冰晶融合形成大冰晶，这一过程被称为再结晶，通常发生在0-40的范围内，特别是在-2 0 -2 5 左右的温度下。相对于冷却时产生的胞内冰而言，复温过程中再结晶产生的大冰晶对细胞的损害更大 1 1.2.2微循环损伤微动脉和微静脉之间的血液循环被破坏是冷冻消融诱导组织损伤的重要机制。冷冻过程中，随着温度的降低，血管收缩血流减少，循环停止。胞内冰的形成对血管内皮细胞造成损害，在解冻后，循环恢复，血小板活化与受损的内皮细胞接触，导致血栓形成，引起缺血 4 。此外，血管损伤导致的毛细血管通透性增加和组织连续肿胀也会引起局部缺血和细胞缺氧,诱导进一步的细胞死亡 1 5 O1.2.3细胞调亡未直接被冷冻消融立即杀死的细胞成为亚致死细胞，它们随后可能会因细胞调亡而死亡，这是冷冻消融区边缘细胞死亡的一个重要原因。细胞调亡一般发生在解冻后数小时至数天内，主要途径是由线粒体介导，激活半胱氨酸-天冬氨酸蛋白酶家族（caspases），这些蛋白酶切割各种蛋白质，导致细胞调亡。其特征是细胞收缩，膜起泡，膜磷脂倒置，染色质浓缩和基因组断裂。在冷冻消融区边缘，暴露于不能立即致死的温度下，细胞在解冻数小时后进入调亡高峰，会导致无法恢复的损伤，细胞不会立即死亡，但促进这些区域的细胞调亡可以增加细胞死亡率和组织损伤。使冰球边缘超过肿瘤远端边界可以确保对目标肿瘤区域造成最大致死率，但这样会对正常组织造成一些损害，因此在冰球边缘760中生42.卷医国报学程学物1cm范围内,用调亡诱导佐剂去促进冷冻区周围的细胞坏死或凋亡也是当下的研究热点之二1 2 1.2.4免疫效应被破坏的组织引发的免疫反应是冷冻消融损伤组织的另一种机制，消融区中心因渗透休克或冰晶机械损伤而死亡的细胞将胞内的内容物释放到胞外空间，许多内容物有免疫刺激性，包括促炎细胞因子、HMGB1和核蛋白等，吸引粒细胞、巨噬细胞和NK细胞，刺激树突状细胞充当体液免疫抗原作用于B细胞，引起B细胞产生肿瘤特异性膜表面抗体。产生的这些抗体可与肿瘤组织细胞表面的膜蛋白相互结合，激活肿瘤机体的免疫系统，对肿瘤组织细胞表现为杀伤作用 1 6 O2影响治疗效果的主要因素低温生物学研究中认为胞内冰更具破坏性，因此在冷冻手术中，需要尽可能达到快速冷冻速率，以产生致命的胞内冰。但快速冷冻速率只能在接近冷冻探针处达到，离探针越远，冷冻速率越低，在离探头约1 cm处，冷冻速率可能仅为1 0 2 0/min左右，具体数值取决于冷冻探针的温度。这种量级的冷冻速率不太可能形成大量的胞内冰，因此胞内冰造成的机械损伤多发生在冷冻探针附近，而胞外冰和细胞调亡则出现在冷冻速率较低的消融区边缘 4 。因此冷冻速率也在确定冷冻消融术的免疫刺激和免疫抑制效果中发挥作用，快速冷冻引起坏死并激活免疫反应，而慢速冷冻使得坏死与调亡比率的降低，从而导致免疫抑制。冷冻消融治疗需要使所有肿瘤组织达到一定温度，才会被完全杀死，这一温度被称为冷冻致死温度。近年来，基于各种体外实验和动物研究，以及小体积（细胞大小）液态水在-4 0 以下不能保持液态的观点，-4 0 已成为冷冻消融大部分肿瘤组织需达到的目标温度1 7 。为了达到低温探针在消融区中心的冷产生和消融区边缘的冷消散之间的平衡，冻结过程应至少持续1 0 min，并且只有在1 0 1 5 min后冰球才达到最大尺寸。由于冷冻速率从中心向外周递减，冷冻过程在外周组织中持续的时间不够长，就无法达到致命的损伤 1。在冷冻过程中，可以将-4 0 等温线延伸到肿瘤边缘以外1 cm,以确保该温度对靶组织中的所有肿瘤细胞都是致命的,达到对肿瘤附近潜在的恶性组织也进行消融的目的。肿瘤体积越大需要的冰球尺寸就越大，同时如此大体积冰球限制了适合冷冻消融的肿瘤的大小。多次冻融循环可以使肿瘤致死等温线靠近冰球的边缘，根据目标的位置和大小，有时需要同时插人几个冷冻探针才能达到完全消融目标组织的目的。随着每个循环的连续进行，第一个冻融循环中细胞膜的破坏使得第二个循环中组织导热性明显增加，组织冷却速度加快，冰球体积增大，冻融循环的重复在很大程度上导致了细胞死亡率的显著增加。有研究表明,在第二个冻融循环周期里，细胞内产生的冰晶更大，能造成更大的机械损伤 1 8 。此外，冻融循环周期之间的间隔时间也是影响肿瘤杀伤效果的一个重要因素，随着冷冻消融期间微循环失效，间隔时间越长，给该区域带来的热量就会减少，下一次冻融循环的效率就会更高。在形成胞内冰的情况下，解冻过程水会从低渗间质流入细胞,在下一次冻融循环中，更多的胞内水会形成致命的胞内冰，间隔时间越长，胞内水越多，胞内冰也越多。缓慢解冻被认为是杀死肿瘤过程中的一个主要因素，解冻速率越低，解冻的时间越长，而较长的解冻期为冰晶生长和渗透破坏提供了时间，由于溶质效应的增加和小冰晶重结晶成大冰晶，对细胞产生更大的机械破坏。有研究表明,缓慢解冻是比快速冷冻更重要的细胞死亡机制 1 2 除了直接影响杀死肿瘤的效果之外，以上因素还通过影响免疫效果和调亡效果来间接影响治疗效果。动物实验发现冷冻消融不仅引起抗肿瘤免疫反应，还会引发免疫抑制 1 9 。例如快速冷冻结合缓慢解冻的消融方案，会造成更多的肿瘤细胞坏死，引起细胞崩解、细胞内容物释放，导致肿瘤周围炎性反应,进而刺激肿瘤特异性T淋巴细胞产生，激活免疫系统；慢速冷冻结合快速解冻则会造成更多的肿瘤细胞调亡,巨噬细胞或树突状细胞吞噬凋亡细胞后，诱导调节性T细胞（regulatoryTcells，Treg cells）数量增加,抑制型细胞因子合成与分泌增多，刺激型细胞因子分泌减少，导致抑制性免疫反应。如图4 所示，消融区边缘的细胞通过调亡的方式死亡，而巨噬细胞对调亡细胞的识别和吞噬阻止了细胞内容物释放，导致免疫抑制，坏死与调亡的比率可能在决定冷冻消融对免疫效应是刺激或抑制中发挥关键作用，因此各因素对消融效果的影响还作用在免疫和凋亡上 2 0 在冻融循环过程中,冷却速率、目标温度、在目标温度下的时间、解冻速率和循环次数等影响冷冻761陈目，等：肿瘤冷冻消融术的作用机理及应用6期释放具有免疫刺激性的消融区中心胞内内容物激活免疫系统细胞坏死细胞冷冻消融肿瘤细胞消融区边缘被巨噬细胞吞噬阻止促炎细胞因子释放细胞凋亡发生免疫抑制图4亡和坏死对免疫反应的影响Fig.4Effects of apoptosis and necrosis on immune response消融治疗效果的因素都是重要的，考虑到不同组织的差异，在冷冻消融技术的实际应用过程中，应在术前对冷冻消融方案进行仔细设计和优化，以最大限度地增加其对靶区的杀伤效果，获得较好的疗效。3在治疗肿瘤上的应用进展关于冷冻消融的应用，几乎在所有器官上都有许多报道，但不同肿瘤应用冷冻消融治疗的效果并不完全相同，这与肿瘤的异质性有很大的关系。下面是对最常用的器官区域的回顾性队列研究和随机对照实验数据的比较，以对冷冻消融应用现状进行概述。3.1前列腺癌前列腺癌是男性最常见且多发的恶性肿瘤，也是美国和欧洲男性癌症死亡的三大原因之一，病症前期,患者无明显临床症状，导致多数患者诊断时已处于晚期，而对于晚期前列腺癌患者，无法进行手术切除，只能选择微创治疗 2 1 。Guo等 2 2 总结了冷冻消融、高强度聚焦超声、不可逆电穿孔和血管靶向光动力疗法这些微创疗法在临床上的应用现状，分析表明，它们的临床结果相似，对前列腺癌患者而言，都是安全的治疗方法，其中冷冻消融技术具有微创、并发症少等优势 2 3。作为全腺体冷冻消融术的安全替代方法，局部冷冻消融术早期并发症较少，肿瘤学结果较好，更适用于希望有更高的机会保存前列腺功能和控制排尿的患者 2 4 。低温在线数据库（CryoOn-LineDatabase，C O L D）可作为关于前列腺冷冻消融的最大的研究参考，这里记录了1 1 6 0 例患者的局部冷冻治疗和4 0 9 9 例患者的整个前列腺消融的结果。结果显示局部消融后3年无复发生存率为7 5.7%，全前列腺消融后3年无复发生存率为7 5.1%；局部消融后的并发症发生率低于整个前列腺冷冻消融 2 5 。Chen 等 2 6 也认为,接受全前列腺冷冻消融后复发的风险高于局部消融，尤其是前列腺前顶，相对于前列腺其他位置来说，增加了局部复发的可能性。与根治性全腺体治疗相比，局部前列腺癌冷冻消融术在保持排尿节制和排尿能力方面可为患者提供更好的泌尿生殖功能结果。Arcot等 2 7 综述了7 1 名接受局部冷冻消融患者的治疗情况，中位随访时间为2 8 个月（1 0.4 5 9.3月），5 年期生存率为75%，在最后的随访中没有发现尿失禁等并发症以及癌细胞转移。前列腺冷冻消融术也可以作为一种挽救性治疗，因为在体外放射治疗或间质放射治疗后再局部复发的情况下，手术特别复杂，并发症发生率会显著增加。Exterkate等 2 8 综述了1 6 9 名复发患者使用冷冻消融补救治疗后，随访5 年的生存率，证明了冷冻消融术对放疗后复发的前列腺癌患者进行挽救治疗的可能性。但并非所有对前列腺癌的冷冻消融都得到了阳性的结果，一项关于对4 7 名放疗后复发的前列腺癌患者进行磁共振引导冷冻消融术的研究显示，1 2个月后仅有2 4 名患者（5 1%）的疾病得到控制，而其余2 3名患者检测到残留或复发的肿瘤，治疗的结果与冰球边缘相关。初步数据表明，磁共振可见的复发肿瘤需要更宽的边缘，其周围至少要有5 mm才能成功消融 2 9 。因此后续研究中应继续就有效冷冻消融复发前列腺癌所需的裕度进行探索，并继续改善最终放疗后的顽固性癌症患者的疾病控制3.2肾细胞癌在冷冻消融最常见的应用领域中，肾肿瘤的治疗仅次于前列腺癌 1 。在过去的几年里，经皮冷冻消融作为小肾癌的一种治疗选择，已经超过热消融技术,其并发症发生率较低，最常见的并发症是出血,其次是气胸,在疗效方面与肾细胞癌治疗金标准一一部分肾切除术相当，安全性比手术切除更好 30-32 大量研究证明了冷冻消融在治疗T1a/b肾细胞癌（其中Tla指肿瘤最大径小于4 cm,T1b指肿瘤最大径 4 cm,但 7 cm)renal masses:technicalconsiderations,complications,and short-term outcomes J.JVasc Interv Radiol,2015,26(6):800-806.39Palumbo C,Cyr SJ,Mazzone E,et al.Impact of tumor size oncancer-specific 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