表观转录元件溴结构域蛋白4抑制剂减轻心肌梗死后心脏损伤.pdf

306心肺血管病杂志 2024 年 3 月第 43 卷第 3 期 Journal of Cardiovascular&Pulmonary Diseases,March 2024,Vol.43,No.3DOI:10.3969/j.issn.1007-5062.2024.03.017表观转录元件溴结构域蛋白 4 抑制剂减轻心肌梗死后心脏损伤郭昱瑄乔博康王媛舒绍坤杜杰基金项目：国家自然科学基金（82200459，81930014）；科技部国家重点研发计划（2021YFA0805102）作者单位：100029 首都医科大学附属北京安贞医院-北京市心肺血管疾病研究所（郭昱瑄 乔博康 王媛 杜杰），北京大学肿瘤医院（舒绍坤）通信作者：杜杰，研究员、博士研究生导师，研究方向:心血管重构疾病病理生理。Email:摘要 目的：探究溴结构域蛋白 4（bromodomain-containing protein 4，BRD4）在心肌梗死后心脏损伤中的作用。方法：通过分析公共数据，明确心肌梗死小鼠心脏组织中 BRD4 在整体和以及各细胞群中的表达变化。构建心肌梗死小鼠模型，设立空白对照组（WT 组），心肌梗死组（MI 组），药物组（JQ1 组，ABBV-744 组），术后第 6 天腹腔注射 BRD4 抑制剂 JQ1 或灌胃二代抑制剂 ABBV-744，持续 22 天。MI 术后 4 周，小动物超声影像系统检测小鼠心功能，检测小鼠质量、心脏质量与胫骨长度，天狼星红染色评估梗死区纤维化程度，WGA 染色检测心肌细胞横截面积。结果：与心肌梗死组相比，BRD4 抑制剂组能够显著改善术后心功能障碍（P0.01）。转录组学数据表明，BRD4 在心肌梗死损伤区域持续高表达。单细胞数据显示，心肌梗死后，成纤维细胞中 BRD4 阳性细胞比例显著增加，并且在心肌梗死后 7、14、30d 的成纤维细胞中，BRD4 表达持续上调。与心肌梗死组相比，BRD4 抑制剂组显著减轻心脏纤维化（P0.01）。与一代药物组相比，二代药物组心脏纤维化程度显著降低（P0.01）。结论：抑制表观转录因子 BRD4 可减轻心肌梗死后心脏损伤，抑制心脏纤维化，并改善心功能。关键词 溴结构域蛋白 4；表观调控；心脏成纤维细胞；心肌梗死中图分类号 R54 文献标志码 A 文章编号 1007-5062（2024）03-306-06Epigenetic transcription factor bromodomain-containing protein4 inhibitors reduce heart damage after myocardial infarction GUO Yuxuan,QIAO Bokang,WANG Yuan,SHU Shaokun,DU Jie Department of Vascular Biology,Beijing Anzhen Hospital,Capital Medical University,Beijing Institute of Heart,Lung and Blood Vessel Diseases,Beijing 100029,ChinaAbstractObjective:To investigate the role of the bromodomain-containing protein 4(BRD4)in cardiac injury following myocardial infarction.Methods:By analyzing publicly available data,we aim to elucidate the changes of BRD4 in both the overall and individual cell populations within the heart tissue of mice after myocardial infarction.A myocardial infarction mouse model was established,including WT group,MI group,and drug treatment groups(JQ1 group,ABBV-744 group).On the 6th day post-myocardial infarction,mice in each group were subjected to intraperitoneal injection of the first-generation BRD4 inhibitor JQ1 or oral administration of the second-generation inhibitor ABBV-744,with the treatment sustained for 22 days.Four weeks post-myocardial infarction(MI)surgery,mouse cardiac function was assessed using a small animal ultrasound imaging system.Measurements included mouse body weight,heart mass,and tibia 基础研究307心肺血管病杂志 2024 年 3 月第 43 卷第 3 期 Journal of Cardiovascular&Pulmonary Diseases,March 2024,Vol.43,No.3length.Sirius red staining was employed to evaluate the extent of fibrosis in the infarcted area,while WGA was utilized to assess the cross-sectional area of myocardial cells.Results:Compared to the myocardial infarction group,the BRD4 inhibitor groups both exhibit a significant improvement in postoperative cardiac dysfunction(P0.01).Transcriptomic data indicates sustained high expression of BRD4 in the infarcted area.Single-cell data reveals a significant increase in the proportion of BRD4-positive cells within fibroblasts after myocardial infarction,and the expression of BRD4 continued to increase in fibroblasts at 7,14,and 30 days post-infarction.Compared to the MI group,both the BRD4 inhibitors reduce cardiac fibrosis(P0.01).Additionally,the second-generation inhibitor group exhibit a significant decrease in cardiac fibrosis compared to the first-generation inhibitor group(P0.01).Conclusions:Inhibiting the epigenetic transcription factor BRD4 can alleviate cardiac injury following myocardial infarction,suppress cardiac fibrosis,and improve cardiac function.Keywords Bromodomain protein 4;Epigenetic transcription factor;Fibroblasts;Myocardial infarction心肌梗死后心力衰竭是常见且致命的不良事件1。心脏重构是心力衰竭发生发展的主要病理基础，也是影响患者预后的重要因素，而心脏纤维化是导致心衰患者心脏重构的关键病理生理基础2。目前尚无特效疗法可以治愈甚至逆转心脏纤维化，寻找有效的治疗靶点是研究的重点和难点。心脏纤维化的调节机制众多，近年来发现与基因动态变化3和表观遗传因子的调控4有关。溴结构域蛋白 4（bromodomain-containing protein 4，BRD4）是一种重要的表观调控元件，通过识别并结合组蛋白乙酰化赖氨酸残基的蛋白结构域发挥作用5。既往研究发现，腹腔注射 BRD4 一代抑制剂 JQ1 能够减轻心肌梗死模型小鼠的心脏纤维化和炎症反应6。随着研究的深入，目前已筛选出新型二代抑制剂，在结肠癌相关研究中显示BRD4二代抑制剂具有良好的抗肿瘤效果，显著提高患者生存率且副作用更小7。然而，新型 BRD4 抑制剂在心肌梗死引起慢性心力衰竭中的治疗作用尚不明确。本研究利用单细胞测序数据明确心肌梗死小鼠心脏中 BRD4 阳性细胞的组成，并通过小分子抑制剂对心肌梗死诱导心力衰竭小鼠模型进行干预，评估心脏纤维化和心功能。为进一步了解 BRD4 在心肌梗死后心脏损伤中的潜在作用和新药物的开发提供了理论依据。材料与方法1.单细胞数据来源及分析 心肌梗死小鼠心脏转录组测序数据来源于 GEO 的 GSE151834 数据集，心脏单细胞数据来源于 GSE152122，流式细胞分选的 GFP+成纤维细胞单细胞测序数据来自GEO 的 GSE132146 数据集。使用 R 包 Seurat（4.3版）对单细胞测序结果进行分析，根据每个细胞检测到的基因数目、UMI 数目和 UMI 与线粒体基因的比例进行质量控制筛选，最终获得了7 079（对照小鼠）、1 0448（心肌梗死 7d）、8337（心肌梗死 14d）、6 805（心肌梗死 30d）细胞。整合每个分析的时间点，使用典型相关分析（CCA）8。对融合后的单细胞数据集进行非监督聚类，分辨率参数为 0.8。使用 t 分布随机邻近嵌入（t-SNE）进行非线性降维。2.主要试剂及实验动物 JQ1 和 ABBV-744 试剂均购自美国艾伯维公司。嗜酸性粒细胞染色液（天狼星红法）购自 Solarbio 公司，WGA 试剂购自 Sigma 公司。8 周龄 C57BL/6J 小鼠购自华阜康生物科技股份公司，实验动物合格证号为SCXK（京）2019-0008。3.急性缺血性心脏损伤的小鼠模型的建立及给药处理 心肌梗死是开胸手术后通过结扎左前降支（LAD）构建9。小鼠用氯胺酮（80 mg/kg）/赛拉津（20 mg/kg）腹腔注射麻醉。呼吸采用 95%O2308心肺血管病杂志 2024 年 3 月第 43 卷第 3 期 Journal of Cardiovascular&Pulmonary Diseases,March 2024,Vol.43,No.3机械通气法（潮气量 0.5mL，130 次/min）。LAD冠状动脉在距起始处 2 mm 处用 7-0 缝线结扎。心肌梗死后第六天，将小鼠按随机表法随机分成四组，其中 JQ1 组以 25 mg.kg-1.d-1持续腹腔注射给药 6d，给药剂量改为 50 mg.kg-1.d-1，持续 16d。ABBV-744 组以 5 mg.kg-1.d-1持续灌胃给药 22d。WT 组 3 只、MI 组 7 只、JQ1 组 4 只、ABBV-744组 7 只，术后 4 周采集心功能、收取心脏组织供后续染色分析。4.心脏病理组织学观察 心脏组织石蜡包埋切片后，行天狼星红和 WGA 染色，光学显微镜下观察心脏纤维化情况，以及心肌细胞的病理改变。5.统计学方法 利用 GraphPad Prism 9 软件进行统计分析，组间比较采用 t 检验以及单因素方差分析。P0.05 表示差异具有统计学意义。结 果1.表观转录元件 BRD4 在心肌梗死后心脏成纤维细胞中显著升高 心肌梗死后，心脏损伤区域 BRD4 不同时间点表达持续上升（损伤区 vs.远端区，P0.001）（图 1A）。心肌梗死后心脏单细胞数据显示，相对于其他细胞类型，成纤维细胞中 BRD4 的阳性率最高（图 1BC）。对照小鼠和心肌梗死术后不同时间点小鼠心脏成纤维单细胞数据 CCA 分析显示，成纤维细胞可以划分为11 个亚群，数量持续增加，第 7 天达到峰值（图1D），在心肌梗死模型小鼠心脏中，不同亚群成纤维细胞均表达 BRD4（图 1E），且在心肌梗死后 30d，成纤维细胞中 BRD4 表达量持续上升（图1F），提示 BRD4 在心肌梗死后心力衰竭病理发展过程中发挥重要作用。2.BRD4 抑制剂可改善心功能 通过冠脉结扎构建心肌梗死后，在第 6 天灌胃一代药 JQ1、腹腔注射二代药 ABBV-744（图 2A）。心肌梗死后 28d，对不同处理组小鼠的心功能进行分析，结果显示 MI 组与 WT 组相比，EF%值和 FS%值显著降低（P0.001），与 MI 组相比，JQ1 组和ABBV-744组EF%值和FS%值显著增加（P0.05），而 JQ1 组和 ABBV-744 组之间无明显差异（图2BC）；提示 BRD4 抑制剂能够改善心肌梗死后心功能。进一步分析心肌梗死后 4 周时心脏质量图 1 心肌梗死后不同时间点心脏成纤维细胞中 BRD4 的表达升高 A：BRD4 在心肌梗死后 14d 心脏损伤和非损伤区域的转录表达水平；B：心肌梗死小鼠单细胞分群图；C：BRD4 在心肌梗死小鼠各类细胞亚群中阳性细胞百分比；D：对照小鼠和 MI 后 7d、14d、30d 成纤维细胞分群图；E：BRD4 在成纤维细胞的RNA-seq 表达分布图；F：BRD4 在心肌梗死不同时间点阳性成纤维细胞百分比，注：两组比较，*P 0.001ADBECFBRD4 平均表达量BRD4 阳性细胞面分比/%181614121086420BRD4 阳性成纤维细胞百分比/%心梗后时间/天BRD4 在成纤维细胞中高表达心梗后时间/天309心肺血管病杂志 2024 年 3 月第 43 卷第 3 期 Journal of Cardiovascular&Pulmonary Diseases,March 2024,Vol.43,No.3/体质量和心脏质量/胫骨长度数据，结果显示，与 MI 组相比，BRD4 抑制剂可以显著减轻心脏病理性重构（P0.05）（图 2D），与 JQ1 组对比，ABBV-744 组在改善心脏胫骨长度比指标上表现出显著增益（P0.01）（图 2E）。3.BRD4 抑制剂减轻心脏纤维化及心肌肥大 （1）天狼星红染色观察各组小鼠心脏梗死面积结果显示：与 MI 组相比，BRD4 抑制剂 JQ1 和ABBV-744 药物组小鼠心脏损伤及胶原纤维累积面积显著减少（P0.01）。在 BRD4 抑制剂组中，二代药物 ABBV-744 组心脏组织梗死瘢痕面积显著小于一代药物 JQ1 组（P0.05，图 3）。（2）如图 4 显示，WGA 染色结果显示，MI组梗死交界区心肌细胞明显肥大（MI vs.WT，图 2 BRD4 抑制剂减轻心肌梗死后心脏损伤 A：动物模型构建以及给药实验流程图；B：BRD4 抑制剂改善心肌梗死后心力衰竭小鼠 LVEF；C：BRD4 抑制剂改善心肌梗死后心力衰竭小鼠左心室缩短分数；D：BRD4 抑制剂对心肌梗死后心力衰竭小鼠心脏体质量比；E：BRD4 抑制剂对心肌梗死后心力衰竭小鼠心脏胫骨长度比的影响，注：MI（n=7）组与对照组（n=3）相比，*P 0.001；治疗组与 MI 组（n=7）相比，*P 0.05，*P 0.01；ABBV 组（n=7）与 MI（n=7）组相比，*P 0.001；ABBV-744 组（n=7）与 JQ1 组（n=4）相比，*P 0.01图 3 BRD4 抑制剂减轻心脏纤维化图 A：天狼星红染色的心脏组织代表性图像；B：天狼星红染色的纤维化面积的统计，注：MI 组（n=7）与对照 WT 组（n=3）相比，*P 0.001；JQ1 治疗组与 MI 组（n=7）相比，*P 0.01；ABBV-744治疗组（n=7）与MI组（n=7）相比,，*P 0.001；ABBV-744组（n=7）与JQ1组（n=4）相比，*P 0.05ADBEC左室射血分数/%心脏质量/体重质量（mg/g）心脏质量/胫骨长度（mg/gmm左室缩短分数/%AB心脏纤维化面积/%310心肺血管病杂志 2024 年 3 月第 43 卷第 3 期 Journal of Cardiovascular&Pulmonary Diseases,March 2024,Vol.43,No.3P0.01）；JQ1 和 ABBV-744 组小鼠心肌细胞肥大程度显著降低（JQ1 vs.MI，P0.01；ABBV-744 vs.MI，P0.001），ABBV-744 组小鼠心肌细胞肥大程度低于 JQ1 组（P0.05）（图 4）。以上结果表明二代药物在减轻心脏纤维化以及心脏重构方面表现出更为显著的效果。讨 论心肌梗死后。持续心肌缺血引起其细胞凋亡及坏死，主要表现为左心室病理性重构，收缩功能障碍。MI 后，心脏损伤最严重后果之一是心力衰竭10，尽管心肌梗死死亡率随着医疗水平的提高有所降低，但心肌梗死后 5 年内心力衰竭的发生率持续上升11。心脏纤维化是参与介导心肌细胞损伤以及修复的主要病理机制12。心脏纤维化的过程涉及多个调控网络，包括表观遗传学水平上13的 DNA 甲基化、组蛋白修饰和非编码 RNA 等机制。此外，炎症反应和线粒体功能异常也参与其中10。目前，靶向表观遗传修饰药物在 I 期动物实验中被证明可以有效减轻心脏纤维化，如组蛋白赖氨酸特异性去甲基化酶（LSD1）抑制剂14、支架附着因子B 相互作用 lncRNA（lncRNA-SAIL）抑制剂15。尽管这些药物可以显著减轻纤维化，但心肌梗死后心力衰竭的发病率仍然持续升高11，因此迫切需要寻找心脏纤维化治疗的新靶点药物。表观遗传因子 BRD4 在心脏纤维化过程中发挥着重要的调控作用，其溴结构域能够识别和结合乙酰化的组蛋白5，在转录活性调控元件上积累并在起始和延伸步骤中促进基因转录。BRD4抑制剂 JQ1，作为 BD1 和 BD2 的泛抑制剂，可减轻心脏肥大和心脏纤维化程度16。与上述报道一致，我们的研究成功构建小鼠慢性心力衰竭MI 模型，并利用 BRD4 抑制剂进行干预，观察到抑制 BRD4 表达能够显著改善心肌梗死诱导的心脏纤维化、心脏质量指数上升、心功能障碍和心肌细胞肥大。最近的研究发现，二代药物 ABBV-744 作为高选择性抑制 BRD4 BD2 结构域的抑制剂，通过改良药代动力学性质降低了药物的脱靶效应9。此前研究报道，高选择抑制剂可以减少广谱抑制剂带来的血小板和胃肠道毒性7，但是对于心脏疾病中的作用尚不明确。我们研究发现，二代药物 ABBV-744 在减轻心肌梗死后纤维化、心肌细胞肥厚以及心脏胫骨指数表现出更好的效果，但是对心功能的改善并不明显。我们数据提示，BRD4 不仅存在于成纤维细胞中，也在心脏中的内皮细胞17、巨噬细胞18有一定的表达。未来研究可以进一步讨论 BRD4 在心脏不同细胞类型中的作用，并进一步探究 ABBV-744 抑制 BRD4图 4 BRD4 抑制剂减轻心肌细胞肥大 A：WGA 染色的心脏组织横截面的代表性图像；B：WGA 染色心肌细胞面积的统计，注：MI 组（n=4）与 WT 组（n=3）相比，*P 0.001；JQ1 组（n=4）与 MI 组（n=4）相比，*P 0.01；ABBV-744 治疗组（n=7）与 MI 组（n=4）相比，*P 0.001；ABBV-744 治疗组（n=7）与 JQ1组（n=4）相比，*P 0.05AB心脏细胞面积（倍数）311心肺血管病杂志 2024 年 3 月第 43 卷第 3 期 Journal of Cardiovascular&Pulmonary Diseases,March 2024,Vol.43,No.3后是否会影响内皮细胞的正常功能以及对炎症细胞的作用。综上所述，表观转录元件 BRD4 抑制剂减少心肌梗死模型小鼠心脏纤维化、病理性心脏重构，能够有效减轻心脏损伤，改善心肌梗死后心功能。参考文献1Virani SS,Alonso A,Benjamin EJ,et al.Heart disease and stroke statistics2020 update:a report from the American Heart Association J.Circulation,2020,141(457):e139-e596.2van Berlo JH,Maillet M,Molkentin JD,et al.Signaling effectors underlying pathologic growth and remodeling of the heart J.J Clin 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