第六节转录后处理转录产物的修饰——真核生物mRNA的帽子和尾巴省公共课一等奖全国赛课获奖课件.pptx

第六节第六节第六节第六节 转录后处理转录后处理转录后处理转录后处理转录产物修饰转录产物修饰转录产物修饰转录产物修饰真核生真核生真核生真核生物物物物mRNAmRNA帽子和尾巴帽子和尾巴帽子和尾巴帽子和尾巴第第1页页在真核生物中，大部分成熟在真核生物中，大部分成熟mRNA都含都含有有5帽子，同时还含有帽子，同时还含有3多聚多聚A尾巴。这尾巴。这是真核生物是真核生物mRNA主要特征。主要特征。第第2页页一、帽子一、帽子成熟成熟mRNA分子没有自由分子没有自由5端。端。5端是一端是一个以个以5-5三磷酸二酯键三磷酸二酯键相连二核苷酸，相连二核苷酸，而且在而且在5一个核苷酸总是一个核苷酸总是N7-甲基鸟氨甲基鸟氨酸（酸（m7GpppX），不能被，不能被RNAase水解。水解。mRNA 5端这种结构就称为端这种结构就称为帽子帽子。第第3页页不一样真核生物不一样真核生物mRNA含有不一样帽子含有不一样帽子,同一个生物也常同一个生物也常含有不一样帽子含有不一样帽子。N7-甲基鸟氨酸（甲基鸟氨酸（m7GpppX）称为帽子称为帽子0，单细胞真核生，单细胞真核生物，如酵母，只有帽子物，如酵母，只有帽子0。如在原来转录物第一个核苷酸如在原来转录物第一个核苷酸2-O位上产生甲基化，则位上产生甲基化，则组成组成帽子帽子1（包含帽子（包含帽子0），其符号为），其符号为m7GpppXm。这是。这是除了单细胞真核生物其余真核生物主要帽子形式。在高除了单细胞真核生物其余真核生物主要帽子形式。在高等生物中，假如第一个核苷酸是等生物中，假如第一个核苷酸是A，则在，则在AN6位上还有一位上还有一个甲基化。个甲基化。在有些真核生物中，在第二个核苷酸在有些真核生物中，在第二个核苷酸2-O位上还能够再位上还能够再甲基化，组成甲基化，组成帽子帽子2，其符号为，其符号为m7GpppXmpYm。第第4页页第第5页页mRNA5帽子结构是由一系列酶催化。帽子结构是由一系列酶催化。其中其中RNA鸟氨酸基转移酶称为鸟氨酸基转移酶称为戴帽酶戴帽酶。甲基供体都为甲基供体都为S-腺苷甲硫氨酸（腺苷甲硫氨酸（SAM），），失去甲基后变为失去甲基后变为S-腺苷高半胱氨酸。腺苷高半胱氨酸。第第6页页帽子结构功效帽子结构功效（1）帽子结构为核糖体对与帽子结构为核糖体对与mRNA识别提供了识别提供了信号。帽子信号。帽子 0部分结构部分结构，包含，包含 5端鸟嘌呤核端鸟嘌呤核苷酸，甲基和苷酸，甲基和三磷酸二酯键，三磷酸二酯键，是核糖体识别是核糖体识别所必须所必须；帽子和结构中甲基；帽子和结构中甲基化也能够化也能够促进促进核糖体对核糖体对RNA结合，但并非结合，但并非决定性。甲基作用是引入一个正电荷而决定性。甲基作用是引入一个正电荷而不是甲基本身，用乙基代替甲基能一样促进核不是甲基本身，用乙基代替甲基能一样促进核糖体结合。糖体结合。缺乏缺乏5帽子帽子mRNA，不能进行有效翻译。，不能进行有效翻译。第第7页页（2）帽子结构帽子结构增加增加mRNA稳定性，保护稳定性，保护mRNA免遭免遭5外切核酸酶作用。外切核酸酶作用。（3）引发作用引发作用。外加带有帽子结构。外加带有帽子结构RNA能促进能促进流感病毒流感病毒RNA（+）链合成。而且帽子结构和）链合成。而且帽子结构和开始开始1215个核苷酸还共价结合于新合成个核苷酸还共价结合于新合成RNA（+）链）链5端。帽子端。帽子1或帽子或帽子2结构对于这结构对于这种引发是必须。种引发是必须。第第8页页二、多聚（A）尾巴大多数真核生物大多数真核生物mRNA都含有都含有3末端多聚末端多聚A尾巴。尾巴。记为记为poly（A）+。多聚。多聚A尾巴大约为尾巴大约为200b。多聚多聚A尾巴不是由尾巴不是由DNA编码，而是由一个分子量编码，而是由一个分子量为为300KDaRNA末端腺苷酸转移酶末端腺苷酸转移酶（又称为（又称为poly（A）聚合酶）聚合酶）催化）催化，以，以ATP为前体，一为前体，一个一个地聚合到个一个地聚合到mRNA3末端。末端。第第9页页poly（A）尾巴并不是加在转录中止）尾巴并不是加在转录中止3末端，而末端，而是在转录产物是在转录产物3末端由一个分子量为末端由一个分子量为360KDa特异酶作用切除一段。特异酶作用切除一段。此酶能识别切点上游方向此酶能识别切点上游方向1320碱基附近序列碱基附近序列AAUAAA及切点下游方向及切点下游方向GUGUGUG，然后，然后再由再由poly（A）聚合酶催化加上）聚合酶催化加上poly（A）尾）尾巴。如巴。如U突变为突变为G，则切除作用和聚合作用均，则切除作用和聚合作用均显著降低。显著降低。第第10页页第第11页页第七节第七节第七节第七节 转录后处理（二）转录后处理（二）转录后处理（二）转录后处理（二）基因间序列去除基因间序列去除基因间序列去除基因间序列去除稳定稳定稳定稳定RNARNA从从从从多基因转录产物中分离多基因转录产物中分离多基因转录产物中分离多基因转录产物中分离第第12页页一、一、不稳定不稳定RNA与稳定与稳定RNA在原核生物中，多基因在原核生物中，多基因mRNA生成后，绝生成后，绝大部分直接作为模板去翻译各个基因所大部分直接作为模板去翻译各个基因所编码蛋白质，并以此为伎俩协调相关基编码蛋白质，并以此为伎俩协调相关基因表示量。原核生物因表示量。原核生物mRNA寿命很短，寿命很短，其半衰期常为几分钟。这与原核生物调其半衰期常为几分钟。这与原核生物调控机制是相关，当一个蛋白质不再需要控机制是相关，当一个蛋白质不再需要时，只要简单地关闭其时，只要简单地关闭其mRNA合成就行。合成就行。第第13页页在真核生物中，可能有尤其机制来延长需要翻在真核生物中，可能有尤其机制来延长需要翻译译mRNA寿命，而缩短不再需要寿命，而缩短不再需要mRNA寿命。寿命。rRNA和和tRNA则不一样，它们不是翻译模板，则不一样，它们不是翻译模板，而是蛋白质合成机器组成部分。不论在原核生而是蛋白质合成机器组成部分。不论在原核生物中还是真核生物中，都很稳定，普通半衰期物中还是真核生物中，都很稳定，普通半衰期为几个小时。为几个小时。第第14页页rRNA和和tRNA与与mRNA不一样：不一样：（1）rRNA和和tRNA分子分子5端都是端都是单磷酸单磷酸，而不是三磷酸；而不是三磷酸；（2）rRNA和和tRNA 分子分子 都比原始转录产都比原始转录产物物小小，即比对应，即比对应DNA小；小；（3）全部）全部tRNA 都含有原始转录产物中没有都含有原始转录产物中没有异常碱基异常碱基。所以都需要做。所以都需要做转录处理转录处理，以删除基，以删除基因间序列及基因内介入序列因间序列及基因内介入序列。第第15页页二、二、rRNA转录后处理转录后处理原核生物以原核生物以E.coli为例：其有为例：其有三种三种rRNA，即，即5S rRNA、16S rRNA 和和23S rRNA，它们分别含有，它们分别含有120、1541和和2904个核苷酸。个核苷酸。其特点：其特点：（1）与）与tRNA基因混杂在一个操纵元中；大基因混杂在一个操纵元中；大肠杆菌有肠杆菌有7个这么操纵元。其中个这么操纵元。其中rRNA基因在各操纵元基因在各操纵元中相对位置都相同，即中相对位置都相同，即16S rDNA，间隔，间隔tDNA，23S rDNA，5S rDNA，收尾，收尾tDNA；但但tDNA在各在各操纵元数量、种类和位置都不相同。操纵元数量、种类和位置都不相同。（2）这）这7个操纵元大多数都集中在复制原点两侧附近，个操纵元大多数都集中在复制原点两侧附近，其转录方向与其转录方向与DNA复制方向相同。复制方向相同。第第16页页当当rrn操纵元转录产生一个多基因操纵元转录产生一个多基因30S RNA后，必须切除先导序列、拖尾序列后，必须切除先导序列、拖尾序列和基因间序列。和基因间序列。这些工作都有这些工作都有RNAase完成。其特点：完成。其特点：必须作用于双链必须作用于双链RNA，在两条链切点通，在两条链切点通常是错开两个碱基对。常是错开两个碱基对。第第17页页第第18页页真核生物有四种真核生物有四种rRNA，即，即5.8SrRNA、18SrRNA、28SrRNA和和5SrRNA。前。前三者基因组成一个转录元，产生三者基因组成一个转录元，产生45S前体前体RNA。第第19页页第第20页页三、三、tRNA转录后处理转录后处理原核生物原核生物tRNA基因转录单元大多数是多基因转录单元大多数是多基因。基因。同一个同一个tRNA几个基因拷贝能够转录在一几个基因拷贝能够转录在一条条RNA中，不一样中，不一样tRNA也能够转录在也能够转录在一条一条RNA中，还有中，还有tRNA与与rRNA组成转组成转录单元。录单元。第第21页页以大肠杆菌以大肠杆菌tRNATyr1为例。它携带酪氨酸为例。它携带酪氨酸tRNA，识别密码子为，识别密码子为GAU。这个分子含。这个分子含有有85个核苷酸，在大肠杆菌个核苷酸，在大肠杆菌DNA中有两中有两个基因拷贝，每个基因是个基因拷贝，每个基因是350个核苷酸，个核苷酸，两个基因间有一段两个基因间有一段200bP间隔子。两个基间隔子。两个基因转录成一条因转录成一条RNA。第第22页页tRNATyr1转录后处理过程主要有五步转录后处理过程主要有五步（1）一个能识别发卡结构）一个能识别发卡结构内切核酸酶在箭头所指处切断；内切核酸酶在箭头所指处切断；（2）RNAaseD识别识别CCA末端，一个一个切除末端，一个一个切除7个核苷个核苷酸。生成酸。生成 分子称为前分子称为前tRNA。（3）RNAaseP在箭在箭 头所指处切断，负责头所指处切断，负责 5-P末端处理；末端处理；（4）RNAaseD除去除去 3末端二个核苷酸。末端二个核苷酸。（5）有）有6个碱基通个碱基通 过专一性酶处理变为过专一性酶处理变为 异常碱基。异常碱基。第第23页页tRNA加工酶主要包含加工酶主要包含tRNA核苷酸转移酶核苷酸转移酶，RNAaseP、RNAaseD、RNAase及及RNAaseP4。（1）tRNA核苷酸转移酶核苷酸转移酶：能特异地以：能特异地以ATP和和CTP为前体催化为前体催化tRNA3末端末端CCA生成。生成。tRNA基基因有两种类型，一个是有因有两种类型，一个是有CCA序列（序列（型），一型），一个是没有个是没有CCA序列（序列（型）。成熟有功效型）。成熟有功效tRNA都都有有CCA3-OH末端，这是末端，这是tRNA结合并携带氨基结合并携带氨基酸功效所必须。酸功效所必须。第第24页页原核生物原核生物tRNA绝大多数为绝大多数为型，少数噬型，少数噬菌体为菌体为型；真核生物均为型；真核生物均为型。型。tRNA核苷酸转移酶核苷酸转移酶反应是专一，当反应是专一，当tRNA缺乏缺乏CCA末端时，总是生成末端时，总是生成CCA末末端。此酶没有种族特异性，不一样种类端。此酶没有种族特异性，不一样种类酶与酶与tRNA配合都能添加配合都能添加CCA末端。末端。第第25页页（2）RNAaseP：是一个内切酶。全部是一个内切酶。全部tRNA5末端都末端都由该酶产生。大肠杆菌由该酶产生。大肠杆菌RNAaseP温度敏感突变体在非温度敏感突变体在非许可温度时使许可温度时使40各种各种tRNA前体发生积累。该酶是一前体发生积累。该酶是一个核蛋白，由两部分组成。这两部分在不一样物种之个核蛋白，由两部分组成。这两部分在不一样物种之间是非常保守。间是非常保守。各种各种tRNA前体分子前体分子与与RNAaseP反应，都能取得该反应，都能取得该tRNA正确正确5端序列。端序列。RNAaseP识别识别tRNA空间构象，而不空间构象，而不是几个核苷酸序列。各种是几个核苷酸序列。各种tRNA都有其保守核苷酸，都有其保守核苷酸，以维持以维持tRNA空间构象。空间构象。第第26页页（3）RNAaseD：为外切核酸酶。作用为外切核酸酶。作用于于tRNA3末端多出核苷酸，直到末端多出核苷酸，直到CCA序序列为止。其作用是一个一个列为止。其作用是一个一个CCA外围切外围切除核苷酸。除核苷酸。第第27页页第八节第八节第八节第八节 转录后处理（三）转录后处理（三）转录后处理（三）转录后处理（三）内元去除内元去除内元去除内元去除RNARNA拼接拼接拼接拼接第第28页页RNA拼接机制研究，是拼接机制研究，是80年代生物化学和年代生物化学和分子生物学领域中最有生气课题之一。分子生物学领域中最有生气课题之一。它不但处理了不连续基因转录产物拼接它不但处理了不连续基因转录产物拼接问题，而且对了解不连续基因起源及整问题，而且对了解不连续基因起源及整个生命起源与进化问题都是有力推进。个生命起源与进化问题都是有力推进。核酸分子催化功效发觉拓宽了人们对酶核酸分子催化功效发觉拓宽了人们对酶认识。认识。第第29页页内元分为四类内元分为四类（1）类内元：由四个类内元：由四个1012bp保守序列及其组保守序列及其组成二级结构；这类内元分布比较广。成二级结构；这类内元分布比较广。（2）类内元：不具备保守序列和其二级结构。类内元：不具备保守序列和其二级结构。（3）类内元：指核基因类内元：指核基因mRNA前体中内元，前体中内元，snRNA参加拼接机制参加拼接机制。（4）类内元：类内元：tRNA前体拼接。前体拼接。第第30页页一、一、tRNA拼接拼接在酵母约在酵母约400 个核个核Trnajyin 中有中有40个是个是不连续基因，每一个都含有一个内元，位不连续基因，每一个都含有一个内元，位于反密码子于反密码子3方向且与反密码子毗邻。内方向且与反密码子毗邻。内元长度为元长度为1445bp。携带同一个氨基酸各种携带同一个氨基酸各种tRNA中内元序列是中内元序列是相关，而不一样氨基酸相关，而不一样氨基酸tRNA内元序列是内元序列是不相关。不相关。第第31页页tRNA基因内元没有为拼接酶系所识别一致序列。基因内元没有为拼接酶系所识别一致序列。所以，在拼接之前前体中反密码子总是处于双所以，在拼接之前前体中反密码子总是处于双链链RNA状态，从而受到保状态，从而受到保 护而不致为拼接酶所破坏。这部分护而不致为拼接酶所破坏。这部分 双链使得反密码子噜噗柄部比成双链使得反密码子噜噗柄部比成 熟熟tRNA反密码子噜噗柄部反密码子噜噗柄部 长得多。而长得多。而三叶草三叶草结构其余部分结构其余部分 与成熟与成熟tRNA完全一样。所以，完全一样。所以，拼接酶系识别是共同二级结构，拼接酶系识别是共同二级结构，而不是保守序列而不是保守序列。第第32页页体外试验发觉体外试验发觉tRNA拼接步骤：拼接步骤：由一个内切酶所催化两个磷酸二酯键断裂，释放由一个内切酶所催化两个磷酸二酯键断裂，释放出一条线状内元分子和两个相互由二级结构作出一条线状内元分子和两个相互由二级结构作用力连接在一起用力连接在一起“tRNA半分子半分子”。这一步反应。这一步反应不需要不需要ATP。tRNA半分子很快采取成熟半分子很快采取成熟tRNA分子构象，只不过在反密码子环上留下分子构象，只不过在反密码子环上留下一个切刻。然后再发生第二步反应，即由一个切刻。然后再发生第二步反应，即由RNA连接酶所催化依赖于连接酶所催化依赖于ATP连接反应。连接反应。第第33页页第第34页页二、二、类内元拼接类内元拼接类内元特点类内元特点:(1)拼接点含有序列特征拼接点含有序列特征.5拼接点和拼接点和3拼接点大拼接点大部分序列为部分序列为U.G.第第35页页(2)内元内还含有比较保守四种内元内还含有比较保守四种1012核苷酸序列，核苷酸序列，分别以分别以5-P-Q-R-S-3表示。表示。P序列能与序列能与Q序列序列互补，互补，R序列能与序列能与S序列互补，形成一个序列互补，形成一个中部关中部关键结构键结构。这么，位于内元序列中靠近。这么，位于内元序列中靠近5拼接点一拼接点一段序列就能与两个拼接点边界序列配对，将两个段序列就能与两个拼接点边界序列配对，将两个拼接点拉在一起便于磷酸二酯键切断和再连接。拼接点拉在一起便于磷酸二酯键切断和再连接。内元中能与两个拼接点边界序列配正确一段序列内元中能与两个拼接点边界序列配正确一段序列称为称为内部引导序列内部引导序列（IGS）。）。第第36页页第第37页页用放射性标识鸟嘌呤核苷处理用放射性标识鸟嘌呤核苷处理35S RNA，发觉拼接步骤：，发觉拼接步骤：（1）取代转酯反应取代转酯反应：G经过正常磷酸二酯键与内元序列经过正常磷酸二酯键与内元序列5端相连。这是鸟嘌呤核苷端相连。这是鸟嘌呤核苷3-OH进攻第一个外元与进攻第一个外元与内元之间磷酸二酯键结果，同时在第一个外元内元之间磷酸二酯键结果，同时在第一个外元3端产端产生了生了-OH。（2）取代转酯反应取代转酯反应：第一个外元：第一个外元3-OH进攻第二个外元进攻第二个外元与内元之间磷酸二酯键，结果两个外元连接起来。而与内元之间磷酸二酯键，结果两个外元连接起来。而释放出来内元再经过两次释放出来内元再经过两次转酯转酯反应，释放出反应，释放出15和和4核核苷酸两个小片段，最终形成稳定线状分子，称为苷酸两个小片段，最终形成稳定线状分子，称为L-19。第第38页页第第39页页内元进行两次内元进行两次转酯转酯反应意义反应意义可能可能是使基因拼接不是使基因拼接不可逆进行下去。可逆进行下去。整个反应过程都没有蛋白质参加，即拼接这种活整个反应过程都没有蛋白质参加，即拼接这种活性是性是35S RNA内元本身含有性质，称为内元本身含有性质，称为本身本身催化催化。其特点：催化已经有一处磷酸二酯键转变成另一其特点：催化已经有一处磷酸二酯键转变成另一处新磷酸二酯键，且不需要能量。内元既是酶，处新磷酸二酯键，且不需要能量。内元既是酶，又是对应底物。只是此酶在反应结束后不再生，又是对应底物。只是此酶在反应结束后不再生，而是变成了新分子。所以，内元又称为而是变成了新分子。所以，内元又称为RNA重排酶重排酶或或RNA异构酶。异构酶。第第40页页RNA催化功效发对于了解生命催化功效发对于了解生命进化过程进化过程有有重大意义。很可能在原始生命中，重大意义。很可能在原始生命中，RNA催催化断裂化断裂-连接反应是最早出现催化过程。连接反应是最早出现催化过程。依据从遗传信息到蛋白质合成过程中，依据从遗传信息到蛋白质合成过程中，RNA所表现出多方面作用，人们早就推测所表现出多方面作用，人们早就推测RNA是生物体系中最早出现大分子种类。是生物体系中最早出现大分子种类。第第41页页酵母拼接过程中所包括酵母拼接过程中所包括2磷酸酯键，是磷酸酯键，是DNA不可不可能有。所以，能有。所以，RNA催化功效必定出现在催化功效必定出现在DNA成为遗传信息载体之前。即，在原始生命中遗成为遗传信息载体之前。即，在原始生命中遗传信息载体是传信息载体是RNA而不是而不是DNA。因为。因为DNA稳稳定性和空间结构方面某种优势而取代了定性和空间结构方面某种优势而取代了RNA成为主要遗传物质，而且蛋白质以其侧链多样成为主要遗传物质，而且蛋白质以其侧链多样性和灵活性取代了性和灵活性取代了RNA成为主要催化剂。成为主要催化剂。第第42页页三、编码三、编码RNA成熟酶内元成熟酶内元在许多在许多类内，存在着外元和内元联合编码类内，存在着外元和内元联合编码一个蛋白质一个蛋白质RNA成熟酶成熟酶现象。现象。类类内元也发觉了类似情况，如眼虫叶绿体内元也发觉了类似情况，如眼虫叶绿体有有32KDaRNA成熟酶成熟酶。以酵母线粒体细胞色素以酵母线粒体细胞色素b基因（基因（cob基因，基因，又称又称BOX基因）为例，来说明基因）为例，来说明RNA成熟成熟酶生成和其调整机制。酶生成和其调整机制。第第43页页不一样酵母含有长短不一样不一样酵母含有长短不一样cob基因。基因。长基因长基因编码序列为编码序列为1155bp，整个基因长，整个基因长6400bp，包，包含含6个外元（个外元（B1-B6）和）和5个内元（个内元（1-5）。）。短基因短基因大约是长基因二分之一，包含大约是长基因二分之一，包含3个外元和两个个外元和两个内元。第一个外元相当于内元。第一个外元相当于长基因长基因外元外元B1-B4，而，而长长基因基因内元内元1-3在在短基因短基因中消失。中消失。长短基因编码一样长短基因编码一样 385氨基酸，含有一样表示能氨基酸，含有一样表示能力。第第44页页RNA成熟酶成熟酶：cob基因中基因中2-4各编码一个各编码一个为删除各自内元序列所不可缺乏蛋白质。为删除各自内元序列所不可缺乏蛋白质。第第45页页以内元以内元2所编码所编码RNA成熟酶为例，说明成成熟酶为例，说明成熟酶熟酶mRNA产生过程：产生过程：第一个外元第一个外元B1编码细胞色素编码细胞色素bN端端139氨基酸（氨基酸（417bp）。）。第一个内元第一个内元1756bp，其中三个阅读框均被阻断。，其中三个阅读框均被阻断。B2是一是一个很小外元，只有个很小外元，只有14bp。2长长1240bp，在其前有一个开，在其前有一个开放阅读框，与放阅读框，与B1+B2阅读框完全一致。这么，当阅读框完全一致。这么，当1被除去被除去时，时，B1、B2和和2及其以后部分就连接在一起，成为一个及其以后部分就连接在一起，成为一个较短较短mRNA前体。这么，从前体。这么，从B1AUG密码子开始，共有密码子开始，共有144+280=424个密码子，能翻译产生一个个密码子，能翻译产生一个423个氨基酸个氨基酸RNA成熟酶。其前成熟酶。其前144个氨基酸与细胞色素个氨基酸与细胞色素bN端端144个个氨基酸完全相同，而其余氨基酸完全相同，而其余279个氨基酸则由个氨基酸则由2编码。编码。第第46页页当当2去除之后，去除之后，B1、B2和和B3相互衔接起来，不相互衔接起来，不再产生去除再产生去除2这个这个RNA成熟酶成熟酶。正是因为。正是因为RNA成熟酶造成合成本身能力丧失，所以细成熟酶造成合成本身能力丧失，所以细胞内胞内RNA成熟酶成熟酶含量极低。也说明含量极低。也说明RNA成熟成熟酶组成了一个自动调整酶组成了一个自动调整负反馈网络负反馈网络。正是这个。正是这个负反馈网络负反馈网络说明说明RNA成熟酶只作用其对应内成熟酶只作用其对应内元拼接过程，对其它内元拼接不起作用。元拼接过程，对其它内元拼接不起作用。第第47页页四、四、类内元拼接类内元拼接类内元除了前提到两个拼接点序列特征外，在其类内元除了前提到两个拼接点序列特征外，在其3末端末端还有特征序列还有特征序列（1）离开）离开3；拼接点；拼接点612bp序列比较保守，一致序列序列比较保守，一致序列为为PyPuPyPyTA*Py，其中，其中 A*为为100%保守一个核苷保守一个核苷酸。酸。（2）在上述）在上述7核苷酸序列中间和两侧各有一段核苷酸序列中间和两侧各有一段35核苷核苷酸短序列能与上游方向核苷酸互补；而保守酸短序列能与上游方向核苷酸互补；而保守A*总是不总是不包含在这些互补序列之中。即，在形成部分双链结构包含在这些互补序列之中。即，在形成部分双链结构中，保守中，保守A*总是不在双链部分，而是向外突出总是不在双链部分，而是向外突出“芽状芽状物物”之中。之中。第第48页页体外试验：将细胞色素体外试验：将细胞色素c氧化酶亚基内元氧化酶亚基内元15克克隆到包含隆到包含SP6开启子质粒开启子质粒pKM2中，可得到大中，可得到大量包含此内元量包含此内元RNA转录产物。这种产物有转录产物。这种产物有体体外自我拼接外自我拼接能力，但与能力，但与类内元有所不一样：类内元有所不一样：不需要带有不需要带有3-OH鸟核苷（酸），也不需要一价鸟核苷（酸），也不需要一价阳离子，仅阳离子，仅需要需要5mM左右左右Mg+和少许和少许亚精胺亚精胺；如增加如增加Mg+浓度，能够不需要亚精胺。反应浓度，能够不需要亚精胺。反应最适温度约最适温度约45。第第49页页切下来内元呈套索状，由切下来内元呈套索状，由2，5-磷酸二酯键连磷酸二酯键连接成环形。套索状产物能够接成环形。套索状产物能够HELA细胞提取液细胞提取液（含有去分枝酶）处理可变为线形分子。以套（含有去分枝酶）处理可变为线形分子。以套索状产物为模板进行反转录，则在分枝处快速索状产物为模板进行反转录，则在分枝处快速终止反应。因为套索状结构含有终止反应。因为套索状结构含有自由自由3-OH末末端，所以能够用与套索互补单链端，所以能够用与套索互补单链DNA为模板，为模板，以套索为以套索为引物引物合成合成DNA链。两种反应都能够链。两种反应都能够用用RNAase切除套索结构而终止反应。切除套索结构而终止反应。第第50页页类内元拼接反应也是转酯作用，发动第一个转类内元拼接反应也是转酯作用，发动第一个转酯反应正是保守酯反应正是保守A*。A以其以其2-OH发动亲核攻发动亲核攻击；保守击；保守A不参加二级结构碱基配对，确保了不参加二级结构碱基配对，确保了它发动转酯反应功效。它发动转酯反应功效。第第51页页五、核基因五、核基因mRNA拼接拼接核基因核基因mRNA内元拼接点序列很简单，均内元拼接点序列很简单，均为为 CU.AG。在内元。在内元3末端，也有一末端，也有一个核苷酸序列，其一致序列是个核苷酸序列，其一致序列是PyXPyTPuA*Py。这两个保守序列突变。这两个保守序列突变就不能正确拼接就不能正确拼接mRNA前体，但仅靠这前体，但仅靠这么简单保守序列是不可能确保正确拼接，么简单保守序列是不可能确保正确拼接，snRNA参加了这一识别过程。参加了这一识别过程。第第52页页真核生物细胞中，有真核生物细胞中，有105106个个100300bP小分子小分子RNA。它们有是。它们有是RNA聚合酶聚合酶转录，有是转录，有是RNA聚合酶聚合酶转录，其中有还像转录，其中有还像mRNA一样戴上帽子。一样戴上帽子。在核中小在核中小RNA称为称为snRNA，在细胞质中，在细胞质中称为称为scRNA。普通情况下，它们多以核。普通情况下，它们多以核蛋白形式存在，即蛋白形式存在，即snRNP和和scRNP。第第53页页各种各种snRNA之间有序列共同性，造成各种之间有序列共同性，造成各种sNRNP也可能有共同蛋白质亚基，所以也可能有共同蛋白质亚基，所以一个一个sNRNP抗体能识别许各种抗体能识别许各种snRNP。除了共同蛋白质亚基形成关键颗粒外，除了共同蛋白质亚基形成关键颗粒外，每一个每一个snRNP还有各自辅助蛋白因子。还有各自辅助蛋白因子。第第54页页在各种在各种snRNA中，只有中，只有U1sNRNA5端序端序列能够与列能够与mRNA前体两个拼接点序列互前体两个拼接点序列互补。补。U1snRNA已发觉于哺乳动物，鸟类，已发觉于哺乳动物，鸟类，昆虫细胞中。人类昆虫细胞中。人类U1snRNA中除了中除了RNA外，还含有外，还含有8个蛋白质亚基。其个蛋白质亚基。其5末末端端11个核苷酸呈单链状态，所以能与拼个核苷酸呈单链状态，所以能与拼接点序列互补。接点序列互补。第第55页页第第56页页snRNA与拼接点配对情况与拼接点配对情况模式如图。上图表示模式如图。上图表示snRNA与内元相互结合总体结构；与内元相互结合总体结构；下列图为一个经典内元序列下列图为一个经典内元序列与与snRNA碱基配对情况。碱基配对情况。对于大多数内元来说，其左对于大多数内元来说，其左拼接点有拼接点有46碱基配对，其碱基配对，其右拼接点只有两个碱基配对。右拼接点只有两个碱基配对。第第57页页与拼接点结合是整个与拼接点结合是整个U1snRNP性质，提纯性质，提纯snRNA不能与拼接点结合。不能与拼接点结合。UIsnRNA与其它蛋白质可与其它蛋白质可能组成一个复杂拼接体，能组成一个复杂拼接体，U1snRNA只有在这么只有在这么一个复合体中才能识别拼接点序列。一个复合体中才能识别拼接点序列。当前还发觉了其它种类当前还发觉了其它种类snRNP：U2snRNP、U5snRNP、U4/U6snRNP。迄今没有发觉这些。迄今没有发觉这些小小RNA含有酶活性。含有酶活性。第第58页页第十节第十节 逆转录逆转录第第59页页逆转录酶是逆转录酶是1960年由年由Temin等人发觉，在研究鸟类路斯等人发觉，在研究鸟类路斯氏肉瘤病毒时发觉了一个依赖于氏肉瘤病毒时发觉了一个依赖于RNADNA聚合酶。聚合酶。发觉了各种高等真核生物发觉了各种高等真核生物RNA肿瘤病毒都有逆转录酶，肿瘤病毒都有逆转录酶，这些这些RNA病毒统称为病毒统称为还原病毒还原病毒。全部还原病毒都有三。全部还原病毒都有三个基因，一个为个基因，一个为gag，编码病毒种族特异性抗原；一，编码病毒种族特异性抗原；一个是个是pol，编码逆转录酶；一个是，编码逆转录酶；一个是env，编码病毒外膜，编码病毒外膜蛋白。蛋白。这三个基因只是指其编码序列，而实际上经过这三个基因只是指其编码序列，而实际上经过不一样转录和翻译后处理能够产生不一样蛋白质。不一样转录和翻译后处理能够产生不一样蛋白质。第第60页页逆转录病毒基因组为逆转录病毒基因组为RNA，普通称为正链病毒。，普通称为正链病毒。逆转录酶负责使病毒逆转录酶负责使病毒RNA基因组（正链基因组（正链RNA）转化为互补）转化为互补DNA链，这个过程称为链，这个过程称为逆逆转录转录。合成。合成DNA链称为链称为负链负链DNA。以负链。以负链DNA为模板合成新为模板合成新DNA链称为链称为正链正链DNA。第第61页页逆转录与转录区分逆转录与转录区分1 过程和产物完全相反。过程和产物完全相反。2 逆转录酶逆转录酶与与RNA聚合酶完全不一样。聚合酶完全不一样。（1）从本质上说）从本质上说逆转录酶逆转录酶属于属于DNA聚合酶，其聚合酶，其前体为前体为dNTP，产物为，产物为DNA链；链；（2）必须有引物存在下才能起始聚合；）必须有引物存在下才能起始聚合；（3）逆转录酶逆转录酶是金属蛋白，需要是金属蛋白，需要Zn+激活。激活。3 目标不一样：转录在于制造基因产物目标不一样：转录在于制造基因产物RNA或或DNA；还原病毒直接目标在于基因组重组。；还原病毒直接目标在于基因组重组。第第62页页正是因为逆转录酶和逆转录作用发觉，才正是因为逆转录酶和逆转录作用发觉，才使中心法则得到补充和完善。使中心法则得到补充和完善。1957年年 Crick提出了中心法测提出了中心法测(central dogma)DNA RNA 蛋白质蛋白质DNA RNA 蛋白质蛋白质第第63页页逆转录酶是一类非常复杂酶，在其简单一条肽链逆转录酶是一类非常复杂酶，在其简单一条肽链上含有各种酶活性。主要酶活性有上含有各种酶活性。主要酶活性有DNA聚合聚合酶活性、酶活性、RNAaseH活性，活性，DNA内切酶活性，内切酶活性，DNA旋转酶活性，螺旋酶活性及旋转酶活性，螺旋酶活性及tRNA结合活结合活性性。第第64页页1 DNA聚合酶活性聚合酶活性：逆转录酶有双重活性，现：逆转录酶有双重活性，现有有RNA指导指导DNA聚合酶活性，又有聚合酶活性，又有DNA指导指导DNA聚合酶活性。所以，此酶能以聚合酶活性。所以，此酶能以RNA和和DNA为模板，在引物存在下合成为模板，在引物存在下合成DNA。发觉，大肠杆菌发觉，大肠杆菌DNA聚合酶聚合酶也能以也能以RNA为模板为模板拷贝出拷贝出DNA链。链。第第65页页还原病毒逆转录酶与还原病毒逆转录酶与DNA聚合酶聚合酶区分区分（1）利用不一样模板利用不一样模板引物体系来区分。引物体系来区分。逆转录酶能利用（逆转录酶能利用（Cm）n（dG）15-进行有效进行有效DNA合成而不合成而不能利用（能利用（dT）n（A）15-和（和（Da）（）（dT）15-；而；而DNA聚合酶恰恰相反。聚合酶恰恰相反。（2）逆转录酶不具备逆转录酶不具备3 5和和5 3外切酶活性，且逆转外切酶活性，且逆转录没保真度比原核和真核生物录没保真度比原核和真核生物DNA聚合酶低得多，错配聚合酶低得多，错配几率比它们高几率比它们高13个数量级个数量级。这也是各种。这也是各种RNA肿瘤病毒肿瘤病毒含有很高自发突变原因。含有很高自发突变原因。第第66页页2 RNAaseH活性活性：还原病毒要将自己单链：还原病毒要将自己单链RNA分子转变为双链分子转变为双链DNA分子才能整合到寄主染分子才能整合到寄主染色体中。要完成这种转变，就必须有降解色体中。要完成这种转变，就必须有降解RNA酶。所以，全部逆转录酶都有酶。所以，全部逆转录酶都有RNAaseH活性。但逆转录酶只有外切酶活性，而无内切活性。但逆转录酶只有外切酶活性，而无内切酶活性，所以作用较慢。酶活性，所以作用较慢。第第67页页3 DNA内切酶活性内切酶活性：全部逆转录酶都有一定：全部逆转录酶都有一定DNA内切酶活性，这种酶含有位点特异性。内切酶活性，这种酶含有位点特异性。但有但有Mn+存在时，则失去位点特异性，成为存在时，则失去位点特异性，成为对超螺旋更为敏感切刻酶活性。可能与重组功对超螺旋更为敏感切刻酶活性。可能与重组功效相关。效相关。第第68页页4 DNA旋转酶活性旋转酶活性：报道：报道ASV病毒粒子有病毒粒子有DNA旋转酶活性，能使旋转酶活性，能使型型DNA变为变为0型。型。5 螺旋酶活性螺旋酶活性：病毒病毒AMV逆转录酶逆转录酶和和都含都含有旋转酶活性。有旋转酶活性。6 tRNA结合活性结合活性：全部逆转录酶都含有与其引：全部逆转录酶都含有与其引物物tRNA结合能力。结合能力。第第69页页逆转录酶生物活性逆转录酶生物活性1 RNA指导指导DNA聚合酶聚合酶，能够利用病毒，能够利用病毒RNA为模板合为模板合成一条互补成一条互补DNA链，形成链，形成RNA-DNA杂交分子；杂交分子；2 DNA指导指导DNA聚合酶聚合酶，以新形成，以新形成DNA链为模板，链为模板，合成另一条互补合成另一条互补DNA链，形成双链链，形成双链DNA分子；分子；3 RNAase H活性活性，指除去杂合分子中，指除去杂合分子中RNA，能够从，能够从两个方向水解两个方向水解DNA-RNA。第第70页页End第第71页页以四膜虫大以四膜虫大rRNA前体分子拼接为例，前体分子拼接为例，说明说明类内元拼接分子机制类内元拼接分子机制四膜虫特点四膜虫特点:微核微核二倍体基因组保留在微核二倍体基因组保留在微核中；中；大核大核基因扩增发生在大核。基因扩增发生在大核。在在大核，大核，rDNA扩增产生了大量染色体外线状分扩增产生了大量染色体外线状分子，每个分子都是回纹序列二聚体。二聚体含子，每个分子都是回纹序列二聚体。二聚体含两个完全相同转录单元，转录成两个完全相同转录单元，转录成35SrRNA前前体。含有内元体。含有内元26S rRNA位于这个前体位于这个前体3端。端。第第72页页将分离但将分离但大核大核进行保温，进行保温，35S RNA释放出释放出413核苷酸长核苷酸长线状线状RNA单链，即内元序列，没有游离外元出现。如单链，即内元序列，没有游离外元出现。如延长保温时间，释放出来延长保温时间，释放出来线状线状内元则变成内元则变成环状环状单链分单链分子。子。第第73页页将分离得到将分离得到35S RNA前体分子在一个含前体分子在一个含有一价阳离子、二价阳离子和有一价阳离子、二价阳离子和GTP溶液溶液中时，也能得到上述结果。中时，也能得到上述结果。GTP可用可用GDP、GMP和鸟嘌呤核苷（酸）替换，和鸟嘌呤核苷（酸）替换，只要该核苷（酸）含有只要该核苷（酸）含有3-OH。表明，此反应不需要能量。表明，此反应不需要能量。第第74页页拼接机制和拼接机制和L-19分子分子polyC聚合酶活性聚合酶活性机制机制：内元序列折叠为一定空间结构，其内部引导序列：内元序列折叠为一定空间结构，其内部引导序列又与边界处外元序列配对。当鸟苷酸与其结合位点又与边界处外元序列配对。当鸟苷酸与其结合位点（内元中某种特定空间构象），经过氢键结合时，其（内元中某种特定空间构象），经过氢键结合时，其3-OH恰好处于恰好处于5端外元最终一个核苷酸端外元最终一个核苷酸3磷酸酯键磷酸酯键发动亲核进攻位置上，于是发动亲核进攻位置上，于是5拼接点断裂。与这类似，拼接点断裂。与这类似，当当5拼