2020-2022年度上海及其他省市临床实验室HPV6与HPV11型核酸检测室间质量评价结果分析.pdf

179现代检验医学杂志第 39 卷第 1 期2024 年 1 月J Mod Lab Med,Vol.39,No.1,Jan.20242020 2022 年度上海及其他省市临床实验室 HPV6 与 HPV11 型核酸检测室间质量评价结果分析徐幸，王国飞，杨依绡，肖艳群，周靖（上海市临床检验中心分子生物学室，上海 200126）摘要：目的通过开展人乳头瘤病毒（human papillomavirus，HPV）6 型、11 型核酸检测室间质量评价（external quality assessment，EQA）计划，来评估实验室检测能力，分析其存在问题，提高检测质量。方法EQA 计划一年两次，样本盘含阳性样本 4 支，包括 HPV6，HPV11 强阳性、弱阳性各 1 支，由具有尖锐湿疣（condyloma acuminata，CA）临床表现，HPV6 或 HPV11 阳性患者的宫颈分泌物（上海市第一妇婴保健院提供）制成。阴性样本 1 支，由 C-33A 细胞株（中科院购入）培养制成。样本冷链寄送至各参评实验室，要求其在规定时间内检测并上传结果。上海市临床检验中心（以下简称中心）依据回报结果计算各实验室的成绩。结果6 轮 EQA 活动共计发出样本盘 163 份，收到有效报告 140 份。实验室合格率 96.43%（135/140），样本符合率 97.86%（685/700）。假阴性 13 个，假阳性 2 个，弱阳性样本占假阴性结果的 76.92%（10/13）。结论实验室 HPV6/11 型核酸检测准确率比较高，个别实验室弱阳性样本的检出能力有待提高,通过参加 EQA 计划可及时发现问题并提高检测质量。关键词：人乳头瘤病毒；尖锐湿疣；室间质量评价中图分类号：R446文献标识码：A文章编号：1671-7414（2024）01-179-07doi:10.3969/j.issn.1671-7414.2024.01.034Analysis of External Quality Assessment Results for HPV6 and HPV11 Nucleic Acid Testing in Clinical Laboratories of Shanghai and Other Provinces and Cities from 2020 to 2022XU Xing，WANG Guofei，YANG Yixiao，XIAO Yanqun，ZHOU Jing（Department of Molecular Biology,Shanghai Center for Clinical Laboratory,Shanghai 200126，China）Abstract:Objective To evaluate the testing capabilities of laboratories,analyze existing issues,and improve testing quality,through carrying out the external quality assessment(EQA)of clinical laboratories for human papillomavirus(HPV)type 6 and 11 nucleic acid detection.MethodsEQA plan was carried out twice a year.Each panel contains 4 positive samples,including one strong positive sample and one weak positive sample of HPV6 and HPV11,made from cervical secretions from patients with clinical manifestations of condyloma acuminata(CA)and positive for HPV6 or HPV11(from Shanghai First Maternity and Infant Hospital).One negative sample was cultured from the C-33A cell line(from Chinese Academy of Sciences).Samples were sent to participating laboratories by cold chain,and laboratories were required to detect test samples and upload their results within the specified time.Shanghai Center for Clinical Laboratory(SCCL)calculated the scores of each laboratory based on the return results.ResultsA total of 163 sample panels were sent out in the 6 rounds of EQA plan and 140 valid reports were received.The laboratory qualification rate was 96.43%(135/140)and the sample compliance rate was 97.86%(685/700).There were 13 false negative results and 2 false positive results,with weakly positive samples accounting for 76.92%(10/13)of the false negative results.ConclusionThe detection accuracy of HPV6/11 nucleic acid in each laboratory was relatively high,and the detection ability of weak positive samples in individual laboratories may need to be improved.The laboratory could discover problems and improve its quality management by participating in EQA.Keywords：human papillomavirus；condyloma acuminatum；external quality assessment人乳头瘤病毒(human papillomavirus，HPV)是一种小而无包膜的双链 DNA 病毒1。DNA 序列分析发现 HPV 至少有 200 多个基因型，不同型别的作者简介：徐幸（1995-），女，本科，主管技师，研究方向：临床分子生物学检测及质量控制工作，E-mail:。通讯作者：周靖（1976-），女，硕士，副研究员，研究方向：临床实验室管理工作，E-mail:。HPV 引起不同类型的细胞病理变化2。HPV 分为高危型(high risk，HR)、可能高危型和低危型(low risk，LR)3。女性外阴感染以 LR-HPV 为主，如180现代检验医学杂志第 39 卷第 1 期2024 年 1 月J Mod Lab Med,Vol.39,No.1,Jan.2024HPV6，HPV11 等4。HPV6，HPV11 感染多表现为尖锐湿疣（condyloma acuminata，CA）和复发性呼吸道乳头瘤状病（recurrent respiratory papillomato-sis，RRP）等5-6。CA 潜伏期一般在 3 周8 个月，常以亚临床感染形式存在，传染性强、复发率高，临床治疗较为棘手7-9。RRP 是良性肿瘤，发病率约为4/100 000 万例儿童，具有复发性、多侵犯声门、远处转移、恶变可能等特点10-11。HPV6，HPV11 型核酸检测在临床已广泛开展，检测方法包括质谱、基因分型和 PCR 定量等，临床更多采用基因分型和 PCR 定量检测12。目前，国内外缺乏关于实验室 HPV6，HPV11 检测能力的研究，本研究自 2020年起通过自行制备、验证及评价 HPV6，HPV11 室间质量评价（external quality assessment,EQA）样本，开展 EQA 活动，评估参评实验室的检测能力，帮助实验室分析问题，提高检测质量。1材料与方法1.1研究对象1.1.1参评实验室：2020 2022 年间参加 EQA 活动的实验室 163 家，包括全国二、三级医疗机构和第三方独立实验室。1.1.2EQA阳性样本：收集具有典型CA临床表现，HPV6，11 型核酸结果阳性患者的宫颈分泌物（上海市第一妇婴保健院提供），混合后用生理盐水稀释成 Ct 值在 22 和 30 左右的两个浓度，0.5ml/支分装。EQA 阴性样本：将 C-33A 细胞株（中科院）培养在 DMEM（含 10ml/dl 胎牛血清）培养液中，置 37，5ml/dl CO2培养箱内，2 次/周传代，第10 代时 2 000r/min 离心，收集细胞，生理盐水重悬后调整至 104个/ml，0.5ml/支分装。1.2仪器与试剂CO2培养箱（德国 Memmert 公司）；ABI 7500 荧光定量 PCR 仪（美国 Thermo Fisher Scientific 公司）；Centrifuge 5424R 高速离心机（德国 Eppendorf 公司）；DMEM 培养液，胎牛血清（Gibco 公司）；0.01mol/L 磷酸盐缓冲液(上海生工）；HPV6/11 型检测试剂盒（上海之江）。1.3方法1.3.1EQA 方案设计：EQA 活动一年两次，样本盘含 5 份样本，HPV6，11 高低浓度各 1 支，阴性样本 1 支，随机编号后冷链至实验室。实验室在样本接收起 1 周内，用常规检测系统（仪器+试剂+方法）检测并通过网络系统上报。1.3.2EQA 样本验证与评价1.3.2.1PCR+膜杂交法：抽取样本盘一份，用HPV 分型检测试剂盒（凯普生物，PCR+膜杂交法）检测。阳性：Biotion 对照和 HPV 杂交点同时显色，阳性点为清晰可见蓝色原点。阴性：只有 Biotion对照及内对照（IC）显色。结果判读见图 1。图 1PCR+膜杂交法结果判读图1.3.2.2实时荧光 PCR 法(qPCR 法)：抽取样本盘一份，用 HPV6/11 型核酸测定试剂盒（上海之江）检测。阴性质控 Ct 值：UNDET 或 40，阳性质控：Ct 值 35。阳性：待测样本 Ct 值 38，扩增曲线呈典型 S 型。阴性：非典型 S 型。1.3.2.3PCR 毛细电泳片段分析法：抽取样本盘一份，用 HPV 核酸检测及基因分型试剂盒 PCR 毛细电泳片段分析法（海尔施基因）检测。有效样本的结果中应出现pcDNA（峰高500RFU）和-globin特异峰。因细胞量太少导致未出现-globin特异峰，但出现特异 HPV 型别的峰时，仍为有效样本。阳性对照峰高：750RFU15600RFU。阳性：特异 HPV型别的峰高 300RFU。1.3.2.4均匀性评价：参照 CNAS-GL003：2018能力验证样品均匀性和稳定性评价指南要求，从能力验证样品中随机抽取 HPV6，HPV11 高低浓度样本各 10 支，用试剂盒（上海之江）检测，每支样本重复检测 2 次。1.3.2.5稳定性评价：参照 CNAS-GL003：2018能力验证样品均匀性和稳定性评价指南要求，选取同一批号HPV6，HPV11高低浓度、阴性样本各6支，2 8保存 7 天，在结果上报截止日前后 3 日内，用试剂盒（上海之江）检测，每支样本重复检测1次。1.4统计学分析依据回报结果统计参评实验室的得分，回报结果与预期相符计 20 分，与预期不符计0分，得分80分EQA成绩合格，80分不合格。采用 Microsoft Excel 2016 软件作为数据统计分析工具，计算实验室的合格率、样本总体符合率、假阳性率和假阴性率。2结果2.1EQA 样本验证与评价结果2.1.1PCR+膜 杂 交 法：见 图 2。结 果 依 次 为HPV6，HPV6，HPV11，HPV11，阴性，均符合预期靶值。181现代检验医学杂志第 39 卷第 1 期2024 年 1 月J Mod Lab Med,Vol.39,No.1,Jan.2024图 2PCR+膜杂交法结果图2.1.2qPCR 法：见图 3。结果均符合预期靶值。2.1.3PCR 毛细电泳片段分析法：见图 4。结果依次为 HPV6，HPV6，HPV11，HPV11，阴性，均符合预期靶值。图 3qPCR 法扩增曲线图图 4PCR 毛细电泳片段分析结果图182现代检验医学杂志第 39 卷第 1 期2024 年 1 月J Mod Lab Med,Vol.39,No.1,Jan.2024续图 4PCR 毛细电泳片段分析结果图2.1.4EQA 样本均匀性和稳定性评价：采用 qPCR法进行检测，结果均符合预期靶值，见图 5，图 6。表明样本具有良好的均匀性和稳定性，可满足样本发放和传递的要求。图 5均匀性评价 qPCR 法扩增曲线图图 6稳定性评价 qPCR 法扩增曲线图2.2参评实验室结果回报2020 2022 年共计发出样本盘 163 份，收回有效报告 140 份，有效回报率依次为 90.91%(40/44)，80.95%(51/63)和 87.50%（49/56）。参评实验室使用最多的试剂品牌为湖南圣湘，其次为上海之江。实验室最常用的方法为 qPCR 法，占 84.29%（118/140）,其次是杂交法10.71%（15/140）和电泳法 5.00%（7/140）。2.3EQA 结 果 实 验 室 总 体 合 格 率 为 96.43%（135/140），三年间合格率依次为 92.5%(37/40)，98.04%(50/51)和 97.96%（48/49）。样本总体符合183现代检验医学杂志第 39 卷第 1 期2024 年 1 月J Mod Lab Med,Vol.39,No.1,Jan.2024率 97.86%（685/700），共 15 个检测错误，假阴性率 1.86%(13/700)，假阳性率 0.29%（2/700）。弱阳性 10 个，占假阴性结果的 76.92%（10/13）。预期靶值、符合率、假阳性率及假阴性率见表 1。表 1 样本靶值、符合率、假阳性率及假阴性率%（n）样本标号预期靶值符合率假阳性率假阴性率第 1 轮98.00（98/100）0（0/100）2.00（2/100）2011HPV-6100.00（20/20）-0（0/20）2012HPV-695.00（19/20）-5.00（1/20）2013HPV-11100.00（20/20）-0（0/20）2014HPV-1195.00（19/20）-5.00（1/20）2015阴性100.00（20/20）0（0/20）-第 2 轮95.00（95/100）2.00（2/100）3.00（3/100）2021HPV-6100.00（20/20）-0（0/20）2022HPV-695.00（19/20）-5.00（1/20）2023HPV-1195.00（19/20）-5.00（1/20）2024HPV-1195.00（19/20）-5.00（1/20）2025阴性90.00（18/20）10.00（2/20）-第 3 轮97.60（122/125）0（0/125）2.40（3/125）2111HPV-6100（25/25）-0（0/25）2112阴性100（25/25）0（0/25）-2113HPV-692.00（23/25）-8.00（2/25）2114HPV-11100（25/25）-0（0/25）2115HPV-1196（24/25）-4.00（1/25）第 4 轮99.23（129/130）0（0/130）0.77（1/130）2121HPV-6100.00（26/26）-0（0/26）2122HPV-6100.00（26/26）-0（0/26）2123阴性100.00（26/26）0（0/26）-2124HPV-1196.15（25/26）-3.85（1/26）2125HPV-11100.00（26/26）-第 5 轮97.50（117/120）0（0/120）2.50（3/120）2211HPV-6100.00（24/24）-0（0/24）2212HPV-11100.00（24/24）-0（0/24）2213HPV-691.67（22/24）-8.33（2/24）2214HPV-1195.83（23/24）-4.17（1/24）2215阴性100.00（24/24）0（0/24）-第 6 轮99.20（124/125）0（0/125）0.80（1/125）2221HPV-1196.00（24/25）-4.00（1/25）2222HPV-6100.00（25/25）-0（0/25）2223HPV-11100.00（25/25）-0（0/25）2224HPV-6100.00（25/25）-2225阴性100.00（25/25）-0（0/25）注：“-”表示无假阳性或假阴性的情况存在。184现代检验医学杂志第 39 卷第 1 期2024 年 1 月J Mod Lab Med,Vol.39,No.1,Jan.20243讨论准确检出HPV6，11感染对诊断尖锐湿疣（CA）和复发性呼吸道乳头瘤状病(RRP)具有重要意义，随着基因检测的检出限越来越低，检测结果的准确度和可靠性也越来越受到挑战。稀释低浓度水平核酸样品，扩增定量和传感过程中引入的偏差都给最终结果带来很大的不确定度13。本研究通过组织 EQA 活动，对实验室检测质量进行有效评估。报告显示，错误集中在假阴性，造成的原因较为复杂，可总结以下几点：试剂储存或运输条件不当导致 Tag DNA 聚合酶活性不足或丧失；实验人员操作不当：未充分混匀样本和抽提液致核酸获得率低；离心机离心效果差导致未分离出目标 DNA；PCR 扩增仪温控、灯源损坏或未正确设置扩增程序等导致扩增失败；一次性耗材存在 PCR 抑制剂。建议实验室从以下几个方面改进：使用弱阳性样本进行试剂质检，增加弱阳性质控；规范实验操作,强化人员培训,完善实验室质量管理体系、保证合理分区14；定期校准设备如离心机、金属浴、移液器等；使用蒸馏水浸泡冲洗、高压灭菌后的一次性耗材，消除或部分消除外源性抑制剂的影响15。值得关注的是，第 3 轮 EQA 活动中一家实验室出现了 2 个弱阳性样本假阴性。实验室使用试剂A（无内标，qPCR 法），阴阳性质控在控，仪器与试剂均在效期内。错误原因为实验人员在抽提核酸时未离心 EQA 样本，直接向样本管内加入核酸抽提剂，核酸产物未达试剂A检测下限（1103copies/ml）。第轮 EQA 活动中，一家实验室同样出现了2个弱阳性样本假阴性，该实验室使用试剂B（外源性内标，qPCR 法），阴阳性质控、内标结果均在控，该内标可监测因核酸提取及扩增过程中 PCR抑制物、仪器及耗材的不良影响而造成的假阴性。需要注意的是，因外源性内标在反应中会与目的基因产生竞争性关系，对反应过程产生影响16，若靶标检测结果为阴性，即使外源性内标结果正常也应警惕因提取或扩增效率不足所致的假阴性。第 5 轮EQA中，一家实验室出现了1个弱阳性样本假阴性，该实验室使用试剂 C（内源性内标，PCR+膜杂交法），阴阳性质控在控，假阴性结果的内标信号未起线。在排除样本保存不当、核酸降解等因素后，推测原因为不良的提取或扩增过程导致该孔扩增失败。建议实验室关注内标情况，若内标信号未起线，无论靶基因有无曲线，均提示实验环节出现问题，实验室应寻找原因，复检样本，防止发生检测错误。假阳性的原因可能是：人员操作(如交叉污染)或实验室污染(如气溶胶)17；PCR 仪的性能差异等质量问题造成非特异扩增。建议实验室：若存在核酸污染，第一时间查找污染源和污染原因，明确原因后采取有效的去污染措施18；加强人员培训，增加阴性质控数量并随机摆放，对仪器进行清洁和去核酸，不同分区使用各自的清洁用具以防交叉污染，对使用后的实验室清洁消毒19；试剂配制、核酸提取、PCR 扩增等环节按要求分区操作；检测系统使用前进行方法学性能验证；因参评实验室收到的样本编号不同，不排除实验室之间比对数据，上传错误的实验结果。本研究使用的 EQA 样本为稀释的临床样本与培养的细胞株制成，可最大程度模拟临床样本监督实验室检测质量。不足的是低浓度样本 Ct 值在 30左右，无法评估实验室检测更低浓度临床样本的能力。中心拟在 2023 年 EQA 计划中改进此不足，制备发放更低浓度的 EQA 样本，进一步帮助实验室提高此方面的检测质量。综上所述，大部分实验室检测 HPV6，11 能力良好，个别实验室弱阳性样本的检出能力有待提高。分析 EQA 长期数据后发现，参加时间越久，实验室检测能力提高越明显20。EQA 活动中出现错误的实验室在下一次活动中均未再发生相同的错误，说明实验室通过参加 EQA 活动能够发现检测过程中的不足，在分析原因并做好纠正措施后，可有效提高检测质量，为临床治疗及用药提供有力的帮助。参考文献：1 丁宁,徐文健,张慧林.HPV DNA 和 mRNA 检测的应用现状和对比分析 J.现代妇产科进展,2023,32(5)：392-396.DING Ning,XU Wenjian,ZHANG Huilin.Application situation and comparative analysis of HPV DNA and mRNA detectionJ.Progress in Obstetrics and Gynecology,2023,32(5):392-396.2 GARBUGLIA A R,LAPA D,SIAS C,et al.The use of both therapeutic and prophylactic vaccines in the therapy of papillomavirus diseaseJ.Frontiers in Immunology,2020,11:188.3 GAUTAM A,GEDDA M R,RAI M,et al.Human papillomavirus genome based detection and typing:a holistic molecular approachJ.Current Molecular Medicine,2019,19(4):237-246.4 张仕华,孙辉,杜彦丹.人乳头瘤病毒感染与生殖器病变关系的研究进展 J.中国医药导报,2020,17(4)：48-51.ZHANG Shihua,SUN Hui,DU Yandan.Advances in research on the relationship between human 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