自由基化学-串联质谱用于脂质精细结构解析的研究进展.pdf

第45卷第1期2024年1月质谱学报Journal of Chinese Mass Spectrometry SocietyVol.45No.1Jan.2024自由基化学-串联质谱用于脂质精细结构解析的研究进展简瑞君，瑕瑜（清华大学化学系，生命有机磷化学及化学生物学教育部重点实验室，北京10 0 0 8 4）摘要：脂质作为六大营养素之一，与细胞膜构建、信号传导和能量代谢等多种生物学过程密切相关。然而，脂质分子结构多样性给分析带来了挑战。基于碰撞诱导解离（collision-induced dissociation，CI D)的传统串联质谱（tandemmass spectrometry，M S/M S)技术仅可以鉴定分子种类和脂肪酰基链组成，难以分析C=C位置、Sn-位置、官能团取代及位置等精细结构。近年来，在多种结构层次上分辨脂质异构体的质谱方法迅速发展，其中，自由基的引人在脂质气相离子活化和引发化学反应等方面发挥着独特作用。本文综述了近10 年来自由基化学结合串联质谱技术在脂质精细结构解析方面的应用进展，主要包括气相的自由基诱导解离（radical-induced dissociation，RI D)和自由基参与反应的衍生化-串联质谱技术。关键词：脂质精细结构；自由基化学；串联质谱；自由基诱导解离中图分类号：0 6 57.6 3doi:10.7538/zpxb.2023.0109Research Progress of Free Radical Chemistry-TandemMass Spectrometry for Fine Structure Analysis of Lipids文献标志码：A文章编号：10 0 4-2 9 9 7(2 0 2 4)0 1-0 0 57-12JIAN Rui-jun,XIA Yu(MOE Key Laboratory of Bioorganic Phosphorus Chemistry,Department of Chemistry,Tsinghua University,Beijing 100084,China)Abstract:As one of the six major nutrients,lipids play important roles in various bio-logical processes,including cell membrane construction,signal transduction,and energymetabolism.The diverse functions of lipids are intricately linked to the distinct struc-tures.More than 48 o00 molecular lipid structures have been curated in the databasewhich can be further categorized into 8 categories and more than one hundred lipid clas-ses and subclasses.The diverse structures of lipids pose challenges for their lipidomicanalysis,especially the co-existence of isomers and isobar.Traditional tandem massspectrometry(MS/MS)techniques based on collision-induced dissociation(CID)canprovide the informations of molecular species and acyl chain composition of various typesof lipids in a sensitive fashion.However,they typically fall short in providing detailed国家自然科学基金面上项目（2 2 0 7 40 7 5）；国家杰出青年科学基金（2 2 2 2 540 4）本文通信作者瑕瑜58structural information,including C-C positions,sn-positions,functional groupsubstitutions and their locations on the fatty acyl chains.In recent years,mass spec-trometry methods capable of distinguishing lipid isomers at various structural levels havebeen developed,among which radical chemistry plays important role in both gas-phaseion activation and chemical derivatization.This article summarized the MS/MS tech-niques for lipid structural analysis at detailed structural levels via harnessing the powerof both radical chemistry and tandem mass spectrometry in the past decade.Radical-induced dissociation(RID)refers to a group of gas-phase dissociation methods whichcan generate intrachain CC cleavages in the fatty acyl chain and thus produce fragmen-tation patterns useful for identification of chain modification.Ultraviolet photodissocia-tion(UVPD)and CID triggered radical-directed dissociation,and electron impact excita-tion of ions from organics(EIEIO)are the major RID methods.By coupling RID withseparation methods,such as reversed-phase liquid chromatography(RPLC),identifica-tion and quantitation of lipid isomers consisting of methyl branching,hydroxy group,and cyclopropane modification and their locations have been achieved.The two majorderivatization methods utilizing radical chemistry for C-C bond modification werediscussed,including radical initiated epoxidation reactions and the Paterno-Buchireaction.Furthermore,the future direction of combining radical chemistry and tandemmass spectrometry for deep lipidotyping was discussed,which included the couplingwith advanced separation methods,integrated workflows for multi-level structure analy-sis,and development of automated annotation tools for data analysis.Key words:fine structure of lipids;radical chemistry;tandem mass spectrometry;radical-induced dissociation随着软电离技术，特别是电喷雾电离（elec-trospray ionization，ESI)的出现以及串联质谱(tandem mass spectrometry，M S/M S)的发展，实现了复杂脂质分子的高灵敏分析，推动了脂质组学在2 1世纪的迅速兴起-2 。2 0 0 3年，Han和Gross提出3,脂质组学是通过对生物体系脂质组进行全面地定性定量分析来揭示脂质生物学功能，阐明脂质代谢及其与疾病和健康联系的科学。脂质组学研究的内容主要包括：脂质定性（结构分析）和准确定量，脂质空间分布和动态变化，以及与其他生物分子的相互作用。脂质结构解析是脂质分析的基础，但脂质分子种类繁多、结构层次多、存在大量的异构体，这给质谱分析带来了极大的挑战。1脂质的多层次结构与分析挑战脂质的结构表征通常包含多级结构信息4-5,以甘油磷脂为例，复杂脂质的完整结构解析包含6 个层次（示于图1）：1）分子种类质谱学报第45卷水平，以磷脂的头部基团进行划分，如磷脂酰胆碱（phosphatidylcholine，PC）、磷脂酰乙醇胺(phosphatidylethanolamine，PE);2）脂肪酰基/醚链组成；3）碳碳双键（C=C)位置；4）甘油主链上酰基或醚链的sn位置；5）官能团取代的特征及位置（如甲基支链或羟基）；6）立体化学,包括C=C的 Z/E构型和官能团的手性。根据“脂质代谢途径研究计划（lipid metabolitesand pathways strategy，LIPID M A PS)”记载，目前已有超过48 0 0 0 种脂质分子。高分辨质谱和传统的低能碰撞诱导解离(collision-induced dissociation，C I D)串联质谱(tandem mass spectrometry，M S/M S)技术通常只能提供前2 个层次的信息，这是常规脂质组学所能达到的解析层面。而对于更深的结构层次，即脂质的精细结构，CID无法直接解析。近年来，基于异构体分辨的质谱技术发展迅速5-6 ，主要分为新型气相离子活化技术和化学衍生结合CID串联质谱技术。自由基的活泼性第1期使自由基诱导解离（radical-induced dissocia-tion，RI D)成为重要的离子活化技术，另外，还有许多基于自由基反应的化学衍生技术。本文将综述近10 年来自由基诱导解离和自由基参与反应的衍生化方法结合串联质谱在脂质精细结构解析方面的应用。2自由基诱导解离对于软电离产生的脂质偶电子离子，低能CID易引发电荷诱导的极性键异裂得到偶电子离子碎片7-8 ,例如，磷脂在CID下断裂CO键得到酰基链碎片，而无法得到精细结构信息。脂肪酸(fatty acid，FA)结构仅含 C一H、C C键等非极性基团，不易发生电荷诱导异裂。因此，电荷远程碎裂（charge remote fragmenta-tion，CRF)是解析C=C和甲基支链等非极性官能团修饰的一种策略。通过衍生化(如，N-4-(氨甲基)苯基吡啶（N-4-(aminomethyl)phenylpyridinium，A M PP)9）或者气相离子/离子反应（FA一H十Mgphen+）10 1将电荷固定以引入脂肪酸,CID引发碳链上的1,4-H2消除反应，断裂C一C键。然而，含极性键的复杂脂质会优先发生电荷诱导碎裂而非电荷远程碎裂。与偶电子离子的碎裂行为不同，电子电离（e le c t r o n io n iz a t io n，EI)会使离子源产生的自由基离子发生进一步碎裂得到丰富的结构信息。基于此，对于通过软电离才能保持完整结构的蛋白质12 、脂质13 等生物分子，研简瑞君等：自由基化学-串联质谱用于脂质精细结构解析的研究进展PE 16:0_18:2;0脂肪酰基链组成213OH34C-C位置sn位置PE 16:0_18:2(9,11);0PE 16:0/18:2(9,11);0图1甘油磷脂多层次结构解析示意图Fig.1 Schematic diagram of multi-level structure analysis of glycerophospholipids究者采用多种方法使其在气相活化时产生自由基离子，经碰撞激活发生进一步碎裂得到更丰富的结构信息，即自由基诱导解离（RID）。脂质RID是指以不同方式形成缺电子脂质自由基离子,在碰撞活化中，自由基经由H搜取过程转移至碳链，进而发生-裂解，示于图2 a。自由基诱导碎裂受电荷影响较小，相较于电荷远程碎裂，还可应用于复杂脂质链内修饰的鉴定。产生脂质自由基离子的方式主要有2 类：1）将自由基前体通过衍生引入脂质，以紫外光解离（ultraviolet photodissociation，U V PD）C1键11,14 或CID断裂低键能化学键15-16 的方式在特定位置引人自由基，示于图2 b，称为自由基定向解离（radical-directed dissociation，RDD);2）高能粒子束与脂质离子作用诱导产生能量较高的不定点自由基离子，示于图2 c，如有机物离子电子激发裂解（electron impactexcitation of ions from organics,EIEIO)和亚稳态原子激发裂解（metastable atom-activateddissociation,MAD)。2.1紫外光解离C一I键根据芳基CI键在2 6 6 nm紫外光下可高效解离17 的特点,Blanksby和Julian等利用非共价形成脂质复合物13.18 或共价修饰14.19 的形式，将芳基C一I键引入脂质。在2 6 6 nm紫外光激发下，C一I键均裂产生高活性的苯自由基,其前体离子在碰撞活化后引发RDD,产生脂肪酰基的链内碎裂，可用于定位C一C键、甲基支链等修饰位置。59PE34:2;0传统中联质谱方法分子种类0一NH2HO95官能团取代的特征及位置PE 16:0/18:2(9,11);130 H新型串联质谱技术6立体化学PE 16:0/18:2(9Z,11E);130H(S)60ab266nmUVPD解离C-ICID断裂低键能化学键266.nm?质谱学报第45卷HG-断裂XHGA-XHGHGHIGA134 k.J/molPB8CEIEIO M+Hr*+e(10 ev)MAD M+Hr*+HeM(6 kev)CTD M+H*.HAD M+H*.TTEMPOM+H.一eM+H2+He+e-+Het-M+H?2+He+IIMI+H2注：EIEIO：有机物离子电子激发裂解；MAD：亚稳态原子激发裂解；CTD：电荷转移解离；HAD：氢原子搜取解离图2 自由基诱导碎裂途径(a),脂质离子产生定点(b)和不定点(c)自由基离子的方法Fig.2Radical-induced fragmentation pathway(a),methods to generate site-specific(b)and nonspecific(c)lipid radical ions2019年,Blanksby课题组14发展了对脂肪酸衍生、既包含固定电荷又含有光解离基团的4-I-AMPP试剂，示于图2 b。A M PP固定电荷将脂肪酸的电离效率提高了百倍。苯自由基引发的RID可对C一C键、环丙烷修饰、甲基支链等进行鉴定和定位。对于直链饱和脂肪酸，碳链上的RID会形成一系列相差14 u(CH）的谱图序列，多为偶电子碎片。当存在C一C时，双键烯丙位两侧的碎裂明显增强，而双键处的碎裂较微弱且出现多峰，从而形成相隔54u的“V形区域,可大致判断C一C位置。对于环丙烷修饰，则形成相隔40 u的“V”形区域，由于C一C和自由基的同时存在使自由基诱导重排增加，导致双键和环丙烷2 种碎裂模式趋同，且不够清晰，较难实现复杂样品中C一C的定性定量分析。对于甲基支链修饰，RDD碎裂模式会在支链两侧产生2 8 u的间隔，并在靠近羧酸端的支链位点出现信号增强，示于图3a，这是由于仲碳自由基比伯碳自由基更易丢失。将RDD碎裂与反相色谱（reversed-phase liquidchromatography，RPLC)结合，发现在胎儿皮脂水解的脂肪酸中FA17：0 可能有7 种支链，但由于支链脂肪酸的分离度不足，定性结果不够明确且无法实现定量。2.2CID断裂低键能化学键2005年，Beauchamp等2 0 提出了FRIPS(free radical initiated peptide sequencing)技术，通过CID断裂低能化学键产生定点自由基离子，从而进行RDD产生c/z离子对多肽进行测序。2，2，6，6-四甲基哌啶（2，2，6，6-tetramethylpiperidoxIl，T EM PO)自由基较稳定，近年来以 TEMPO为基础的 FRIPS试剂得以发展,如TEMPO-基-NHS 酯(TBN)21和TEMPO-吡啶甲基-NHS酯（TPN)22，其中，NHS酯用于多肽N端的衍生化。本课题组15将TPN/TBN衍生至氨基磷脂PE,示于图2 b。由于TEMPO-吡啶甲基/苄基的键能低至134kJ/mol,由CID释放吡啶甲基/芊基自由基连接的脂质离子，随后产生的碳中心自由基引发酰基链内的RDD,可用于鉴定、定位链内修饰（包括C一C、环丙烷环和甲基支链）。TPN衍生化结合CID触发的RDD还被用于准确定位氧化磷脂酰乙醇胺（OxPE)中的一OH23。本课题组16 将 O-芊基羟胺（O-benzylhydroxyl-amine,O-BHA)衍生至脂肪酸羧基上,在加人锂离子作为固定电荷的情况下，NO芊基键在CID下均裂产生氮氧自由基，从而引发脂肪酸链的RDD。在脂肪链存在甲基支链时的碎裂模式与I-AMPP在UVPD下引发的 RDD相似，即14u的连续序列在支链两侧被中断而形成2 8 u的间隔，示于图3b。将该衍生方法与反相色谱-串联质谱(RPLC-MS/MS)结合，在血浆中鉴定了10 种支链脂肪酸并进行异构体间的相对定量分析，首次发现了血浆中的FA17：0 可能存在n-5甲基支链。本课题组2 4 发现，PC分子的磷酸胆碱头基可与碳酸氢根形成较强的氢键，生成的复合物在CID下会诱导胆碱内C一N键发生均裂，并形成以碳原子为中心的磷酸乙酯自由基。在优势构象的驱使下，高丰度RDD碎片离子为第1期简瑞君等：自由基化学-串联质谱用于脂质精细结构解析的研究进展a407.3168.9379.3mH61563.2PD266436.32.5436.3100182.9225.9239.050200262b234LO901100LOZ11SOt650F50注：a.ai-17：0-I-A M PP在2 6 6 nm下的UVPD谱图14;b.ai-17：0-O BH A+L门+的CID谱图16 图3不同自由基诱导解离方式对支链脂肪酸鉴定的串联质谱图Fig.3 MS/MS spectra for identification of branched chain fatty acids using different RDD methods只含有 sn-1位置酰基链的“sn-1诊断离子”。通过检测sn-1诊断离子可准确定量同时存在的PC的sn异构体，而无需分离异构体。向喷雾溶剂中加人碳酸氢铵可以直接用于解吸电喷雾电离（desorption electrospray ionization，DESI)成像2 5，酰基链上的低丰度RDD碎片离子可用于 PC和溶血磷酰胆碱（lysophos-phatidylcholine，LPC)的链内修饰表征2 6 。链内RDD成功整合到RPLC-MS系统，实现了对人血浆LPC 17：0 中iso 和anteiso异构体的定性和相对定量分析。此外，该方法还被用于鞘磷脂（sphingomyelin，SM)中鞘氨醇骨架异构的鉴别2 7 。2.3EIEIO产生脂质自由基离子以电子/离子反应为基础的解离技术是产28u379.3407.3250300m/zFAai-17:0IIoSI961100150350LLL-EA-NOJ*291.27200250m/z生自由基离子的重要方法2 8 。对于多电荷的多肽，通过电子捕获解离（electron capture dissocia-tion，EC D)等方法可得到富电子自由基离子。而脂质离子通常为单电荷离子，可采用EIEIO方式解离。EIEIO又称电子诱导解离（electron-induced dissociation，EID),是Freiser和 Cody在19 7 9 年开发的单电荷/电子反应解离技术2 9 ，直到2 0 15年Baba和Campbell通过改造Q-TOF质谱实现了EIEIO首次用于脂质分析30 。在EIEIO中，带正电的脂质离子与动能约为10 eV的电子束相互作用，许多高能和自由基诱导的解离通道被激活。EIEIO是一种非官能团特异的裂解技术，可以产生丰富的碎片离子，提取多级结构信息，包括头基、C一C位置及构型、sn位置，甚至是复杂脂质中的聚糖400LiH300450291-Ph382M#+Lil382.3335040050062信息30-3。但是，EIEIO的碎片离子强度低，且谱图复杂，手动解谱较为困难，灵敏度受到限制。对于不饱和脂肪酰基链，乙烯基C一C和C一C键的直接裂解相对于烯丙基C一C键裂解更不易发生，相对峰强度上的差异形成“V”形碎裂模式，可用于定位C一C，示于图4a。用质谱学报第45卷C一C附近C一C碎裂模式的差异可区分顺式和反式双键的同分异构体，对于n-7的双键，反式较顺式在n-8“H获得”和n-6“H丢失 形成的偶电子碎片强度更高，示于图4b。然而，在含2 条及以上酰基链的复杂脂质中，不同酰基链的链内碎裂谱图可能会相互干扰，从EIEIOaH3CH;C-H;C 183.065+H 100 x280PC6040200241.107227.091-HHOOH20Sn-2-0:0200LPC(18:1)257.102H606891011121314151617sn-1300m/zn-7,cisM+H500LPC(18:0)60n-7,cisbn-9n-8 n-7n-6n-5-CH,-CH2-CH=CH-CH2-CH2-.-CH,0.300.20%/isuaul0.100.00-0.10F-0.20F604.402-0.30-0.40E0621.407635.421619.426|620.434632.567一605.410H gainn-7,trans650.577644.4355645.442一Hloss660.464658.450659.458n-7,trans注:a.LPC18：1(9 Z)和LPC18：0 的EIEIO谱图30 ;b.质子化PC16：1(9 Z)/16：1(9 Z)和PC16：1(9 E)/16：1(9 E)的EIEIO谱图中双键区域33；黑点代表自由基碎片图4EIEIO鉴定复杂脂质双键位置及顺反异构质谱图Fig.4 EIEIO spectra for identifying double bond positions and cis/trans isomers of complex lipids0第1期谱中定位C一C通常需要借助计算机软件解卷积解谱34。由于EIEIO谱图的复杂性，预先分离脂质同重素或同分异构体有利于提高脂质鉴定的可信度。Baba等32 将差分离子消度与EIEIO联用,实现了猪脑脂质提取物中40 0 多种脂质分子(包括甘油磷脂、甘油酯和鞘脂)的精细结构解析。目前，商用质谱 Zeno TOF7600配备了EIEIO模块，使其更易应用于脂质分析。2.4其他气相活化方法其他产生不定点脂质自由基的气相活化方法示于图2 c。Ja c k s o n 课题组利用MAD35和电荷转移解离36 1（charge transfer dissociation,CTD)产生PC自由基阳离子,从而引发RID进行C一C位置鉴定。在MAD中,PC单电荷阳离子与亚稳态氨原子束（6 keV)发生碰撞反应生成二价自由基阳离子；在CTD中,PC单电荷阳离子与高电子亲和能（2 4.6 eV)的He+反应生成二价自由基阳离子。Takahashi等37 开发了氢原子搜取解离（hydrogen abstractiondissociation，H A D)技术，脂质离子与离子阱内的中性氢原子（H)相互作用生成自由基离子诱导沿脂质酰基链的RID。M A D、C T D 和CIDAYHG简瑞君等：自由基化学-串联质谱用于脂质精细结构解析的研究进展化和PB反应。3.1自由基为衍生化试剂的环氧化反应-MS/MSC一C可通过环氧化转化为具有极性且不稳定的三元环。通过对脂质环氧化物进行CID,可得到1对相差16 u的碎片离子，实现C一C的鉴定,示于图5a。脂质的环氧化多通过向溶液中加人过氧酸40.42 1 或原位生成过氧16 u间隔HGCIDAY-163HAD生成的碎片模式与EIEIO相似。虽然这些方法在脂质分析方面具有潜力，但需要复杂的质谱改造且灵敏度有限，因此尚未用于大规模的脂质分析。此外，Gavin Reid等38 用2 13nm紫外光激发金属离子或铵根加合的留醇产生M+，继而进行MS3的CID可产生有关结构碎片。3自由基相关衍生化方法-串联质谱除气相离子活化技术外，异构体分辨质谱的另一策略是将不能在CID下碎裂的基团进行衍生化修饰使其产生特征碎裂。目前，发展的衍生化策略多针对C一C,如Paterno-Buchi(PB)反应39 、环氧化反应40 1和氮杂环丙烷化417。下面将讨论经自由基路径实现脂质衍生化的方法，包括自由基为衍生化试剂的环氧HGbdHOcis-3HOtran.s-3注：a.环氧化-MS/MS碎裂；b.等离子体羟基自由基驱动环氧化反应；c.光引发苯甲酰过氧自由基环氧化;d.水自由基阳离子环氧化-MS/MS图5以自由基为衍生化试剂的环氧化反应-MS/MSFig.5 Epoxidation reactions of free radicals as derivatization reagents-MS/MSHG1IGPhCoo(H2O)2HO.ml/z118OHHO-PhCO.HGCPHHO.ml/z116HG0HHOOH+CIDm/z88cis-favoredHOtrans-m/z74favored64化物43441，经由亲电加成反应实现。最近，研究发现,可以利用一些含氧自由基实现C一C的氧插人。Zhong等45 发现在MALDI成像中以金纳米线和有氧化还原活性的间氯过氧苯甲酸作为基质，产生的热电子在静电场加速下被间氯过氧苯甲酸俘获，迅速产生羟基自由基和偶电子负离子。羟基自由基体积、空间位阻小，与双键发生加成,能在纳秒内与脂肪酸双键发生快速的环氧化，示于图5b，结合MS/MS可以实现组织切片脂肪酸原位C一C异构体成像。苯甲酰过氧自由基是一种快速环氧化试剂，Xu等46 以苯偶姻为前体，2 54nm光照下生成的苯甲酰自由基与空气中O2反应生成苯甲酰过氧自由基，可对脂质进行环氧化，示于图5c,可在5min内实现溶液中8 0%的脂肪酸环氧化。此外,还可以将苯偶姻喷涂在组织切片上，通过离线环氧化-解吸附电喷雾电离-串联质谱(DESI-MS/MS)进行脂肪酸异构体成像47 。Chen 等L48 发展了一种特殊的水自由基阳离子环氧化方法。水蒸气等离子体中的(H,O)，+与喷雾中已烯醇的C=C反应生成环氧自由基阳离子，CID下产生的碎片可用于区分已烯醇双键异构体。然而，不同位置双键的反应效率差别较大，在甲基末端和链中间形成的碎片形式不同，难以实现C一C位置异构体的定量分析。但碎片离子强度对cis/trans构型有偏好性，示于图5d，基于此，作者建立了标准曲线对红酒中3-已烯醇的顺反异构体进行相对定量分析。3.2PB-MS/MS及自由基诱导异构化PB反应是光激发后的醛或酮与C=C之间的2 十2 环加成反应。PB反应产物所产生的2 个区域异构体(Pi和P2)在CID裂解中会形成1对 CC诊断离子,其中一个在断裂位点处包含烯烃（Fo），另一个包含醛（FA），这些诊断离子为C一C的位置鉴定提供了明确信息，并可进行异构体的相对定量分析。2 0 14年,本课题组39 以丙酮作为PB试剂和ESI溶剂，报道了Paterno-Bichi-串联质谱（PB-MS/MS)在脂质双键分析中的应用。作为第一代PB试剂,丙酮有以下优点：1）对各种极性或非极性脂质具有良好的溶解性；2）与水和许多其他有机溶剂具有高度的混溶性；3）与ESI相质谱学报第45卷容。因此,可以大量使用丙酮，在10 s内可达到30%产率。此外，本课题组分别建立了丙酮PB反应的“鸟枪法脂质组学”分析平台49 和“LC-PB-MS/MS高通量解析 C一C位置异构体分析平台50 。然而，丙酮PB反应会出现包括Norrish I类型在内的副反应，导致产率不高，且只适合衍生极性脂质。因此，近年来多个研究小组不断开发新的PB衍生试剂以提高反应产率51-52 和电离效率53 等，并用于各种脂质（极性54、中性55-56 ）和分析场景（如MALDI成像57 、单细胞分析58 ）中。已有文章59 总结了PB-MS/MS相关的发展和应用。三线态PB试剂与C一C形成的双自由基中间体除了可以发生2 十2 环加成外，还可以发生自由基消除，重新生成PB试剂和顺反异构化的C一C,在顺式和反式构型之间可以发生相互转化且在平衡时以反式构型为主6 0-6 1，示于图6。Chen等L61用苯甲酰甲酸甲酯作为PB试剂,以IrdFppy（d t b b p y)PF。作为光催化剂，建立了光环加成-光异构化的可见光激发双反应体系，以实现脂质C一C位置和构型的定性定量分析。在该体系中：1）PB-MS/MS用于鉴定和定量C一C位置异构体；2）脂质分别于光反应前后进人RPLC-MS，反式产物比顺式产物的保留时间更长，会在其右侧出现新的色谱峰，而顺式产物会在其左侧出现新的色谱峰。此特异性为不饱和脂质顺反异构体引人第二维度的身份标签，实现其可靠的鉴定分析，可以通过反应前色谱面积比对Z/E异构体定量。4结论与展望近年来，在多个结构层次的脂质异构体分辨质谱技术发展迅速，其中,CC解析技术相对成熟，已广泛用于生物样本分析。自由基诱导解离为除C一C外的其他链内官能团修饰（如甲基支链、羟基、环丙烷）的鉴定提供可能，但仍处于技术发展早期阶段，还需在以下方面进行发展：1）由于异构体的RID谱图碎片离子繁杂，除特征碎裂间隙外，碎片离子基本重叠，需要将RID与异构体分离技术整合，特别是LC分离。离子迁移谱可以在毫秒级实现异构体分离，若其可以分离链内修饰异构体，将有第1期望实现链内异构体的质谱成像。2）各层次的异构体解析技术需要有机结合，以实现复杂样品中同一脂质分子各层次的精确解析。例如，氧化脂质同时存在C一C和OH修饰，目前通过反相色谱-自由基定向解离(（RPLC-RDD)可实现oxPE混合物OH的精确解析，但对于双键定位需将每种oxPE单独制备分离，使用PB-MS/MS进行确定2 3。3）自由基诱导解离碎片离子分散，该方法用于链修饰鉴定的检出限通常在数十nmol/L到亚mol/L级，比不区分脂质异构体的检出限(nmol/L)高出12 个数量级。为实现低丰度脂质的深度结构解析，通过与预富集方法整合将有助于提高LC-RDD灵敏度。4）发展深层结构水平的数据分析工具和自动化脂质注释工具。参考文献：1WENK M R.The emerging field of lipidomicsJ.Nat Rev Drug Discovery,2005,4(7):594-610.2WENK M R.Lipidomics:new tools and applica-tionsJJ.Cell,2010,143(6):888-895.3HAN X,GROSS R W.Global analyses of cellu-lar lipidomes directly from crude extracts of bio-logical samples by ESI mass spectrometry:abridge to lipidomicsLJ.JLipid Res,2003,44(6):1 071-1 079.4LIEBISCH G,FAHY E,AOKI J,DENNIS EA,DURAND T,EJSING C S,FEDOROVA M,FEUSSNER I,GRIFFITHS W J,KOFELER H,简瑞君等：自由基化学-串联质谱用于脂质精细结构解析的研究进展RCIDHGFARR3hv图6 PB-MS/MS用于C=C位置鉴定及自由基诱导异构化-LC用于C=C构型分析Fig.6 PB-MS/MS for the identification of C=C bond positions andradical-induced isomerization-LC for C=C configuration analysis65RFAFoCIDP/P2十HGPI2+2环加成*3+HGHGZGP2HGJr MERRILL A H,MURPHY R C,ODONNELLV B,OSKOLKOVA O,SUBRAMANIAM S,WAKELAMM JO,SPENER F.UpdateonLIPID MAPS classification,nomenclature,andshorthand notation for MS-derived lipid struc-turesJJ.J Lipid Res，2 0 2 0,6 1(12):1 539-1555.5ZHANG W,JIAN R,ZHAO J,LIU Y,XIAY.Deep-lipidotyping by mass spectrometry:recent technical advances and applicationsJ.JLipidRes，2 0 2 2,6 3(7):10 0 2 19.6BONNEY J R,PRENTICE B M.Perspective onemerging mass spectrometry technologies 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