生物化学与分子生物学实验技术省公共课一等奖全国赛课获奖课件.pptx

第三章：层析技术第三章：层析技术第三章第三章 层析技术层析技术第1页 层析技术是利用混合物中各组分物理化学性质(分子形状和大小、分子极性、吸附力、分子亲和力、分配系数等)不一样，使各组分以不一样程度分布在固定相和流动相中，当流动相流过固定相时，各组分以不一样速度移动，而到达分离技术。层析技术操作简便，样品可多可少，既可用于试验室研究工作，又可用于工业生产，还可与其它分析仪器配合，组成各种自动分析仪器。第2页层析技术分类 (1)按流动相状态分类：用液体作为流动相称为液相层析，或称液相色谱；以气体作为流动相称为气相层析，或称气相色谱。(2)按固定相使用形式分类：可分为柱层析(固定相填装在玻璃或不锈钢管中组成层析柱)、纸层析、薄层层析、薄膜层析等。(3)按分离过程所主要依据物理化学原理分类：可分为吸附层析、分配层析、离子交换层析、分子排阻层析、亲和层析等。本章按第三种分类进行叙述。第3页第一节 吸附层析 吸附层析是利用吸附剂对不一样物质吸附力不一样而使混合物中各组分分离方法。吸附层析在各种层析技术中应用最早，因为吸附剂起源丰富，价格低廉，易再生，装置简单，又含有一定分辩率等优点，故至今仍广泛使用。第4页 凡能够将其它物质聚集到自己表面上物质，都称为吸附剂。能聚集于吸附剂表面物质称为被吸附物。在吸附层析中应用吸附剂普通为固体。固体内部分子所受分子间作用力是对称，而固体表面分子所受力是不对称。向内一面受内部分子作用力较大，而表面向外一面所受作用力较小，因而当气体分子或溶液中溶质分子在运动过程中碰到固体表面时就会被吸引而停留在固体表面上。吸附剂与被吸附物分子之间相互作用是由可逆范德华力所引发，故在一定条件下，被吸附物能够离开吸附剂表面，这称为解吸作用。吸附层析就是经过连续吸附和解吸附完成。本节主要介绍吸附柱层析和聚酰胺薄膜层析，薄层吸附层析将在本章第六节介绍，气固吸附层析在第七节介绍。第5页一、吸附柱层析 将吸附剂填装在玻璃或不锈钢管中，组成层析柱，层析时欲分离样品自柱顶加入，当样品溶液全部流入吸附层析柱后，再加入溶剂冲洗。冲洗过程称为洗脱，加入溶剂称为洗脱剂。第6页第7页 在洗脱过程中，柱内不停地发生解吸、吸附，再解吸、再吸附过程。即被吸附物质被溶剂解吸而随溶剂向下移动，又碰到新吸附剂颗粒被再吸附，后面流下溶剂又再解吸而使其下移动。经过一段时间以后，该物质会向下移动一定距离。此距离长短与吸附剂对该物质吸附力以及溶剂对该物质解吸(溶解)能力相关。不一样物质因为吸附力和解吸力不一样，移动速度也不一样。吸附力弱而解吸力强物质，移动速度就较快。经过适当时间以后，不一样物质各自形成区带，假如被分离是有色物质话，就能够清楚地看到色带(色层)。假如被吸附物质没有颜色，可用适当显色剂或紫外光观察定位，也可用溶剂将被吸附物从吸附柱洗脱出来,再用适当显色剂或紫外光检测，以洗脱液体积对被洗脱物质浓度作图，可得到洗脱曲线。吸附柱层析成败关键是选择适当吸附剂、洗脱剂和操作方式。第8页(一)吸附剂选择 惯用吸附剂有极性和非极性两种。羟基磷灰石、硅胶、氧化铝和人造沸石属前者，活性炭属后者。在实践中不论选择那种类型吸附剂，都应具备表面积大、颗粒均匀、吸附选择性好、稳定性强和成本低廉等性能。在选择详细吸附剂时，主要是依据吸附剂本身和被吸附物质理化性质进行。普通来说，极性强吸附剂易吸附极性强物质，非极性吸附剂易吸附非极性物质。不过为了便于解吸附，对于极性大分离物，应选择极性小吸附剂，反之亦然。理想吸附剂必需经过屡次试验才能取得。第9页1.羟基磷灰石 羟基磷灰石Ca5(PO4)3OH2，简称HA吸附容量高，稳定性好(在T85，pH5.5-10.0均可使用)，所以在制备及纯化蛋白质、酶、核酸、病毒和其它生命物质方面得到了广泛应用。有时有些样品如RNA、双链DNA、单链DNA和杂合型双链DNA-RNA等，经过一次HA柱层析，就能到达有效分离。HACa2+基团和生物分子表面负电荷基团相互反应，在用HA分离生物分子过程中起着主要作用。而HAPO43-基团与生物分子表面正电荷基团相互反应，则仅起着次要作用。第10页使用HA作为固定相基质注意事项：(1)HA系干粉时，要先在蒸馏水中浸泡，使其膨胀度(水化后所占有体积)到达2-3mL/克后，再按16体积加入缓冲液悬浮，以除去细小颗粒；(2)HA悬浮液须用旋涡振荡器混合，若用磁棒或玻棒搅拌时，HA晶体结构会被破坏；(3)忌用柠檬酸缓冲液和pH5.5缓冲液。当用过HA层析柱再生时，要先挖去顶部一层HA，然后用一倍床体积1mol/L NaCl溶液洗涤，接着用4倍床体积平衡液洗涤平衡，如此处理后即可使用；(4)就操作容量来说，普通细颗粒HA比粗大。而从分辨率比较，粗颗粒HA也没有细好。用细颗粒HA层析时，柱子直径应大些才能到达满意流速。第11页2.硅胶 是最惯用吸附剂，通惯用SiO2.xH2O表示，是含有硅氧交联结构，表面有许多硅醇基多孔性微粒。硅醇基可与极性化合物或不饱和化合物形成氢键而使硅胶具较强吸附力。水能与硅胶表面羟基结合而使其失去活性，经加热可被除去水称自由水，若自由水含量达17%以上，则吸附力极低，此时，硅胶只能用于分配层析。若将硅胶在105-110加热30min，吸附能力显著增强，这一过程称为活化。假如将硅胶加热到500，硅醇基结构会变成硅氧烷结构，吸附能力显著下降。硅胶含有微酸性，适合用于分离酸性和中性物质，如有机酸、氨基酸、甾体等。第12页3.氧化铝 分酸性、碱性和中性三种，酸性氧化铝(pH4-5)适合于分离酸性化合物，碱性氧化铝(pH9-10)适合于分离碱性化合物，中性氧化铝(pH7)适合于分生物碱、挥发油、萜类、甾体及在酸、碱中不稳定甙类、酯类等化合物。氧化铝用前也需脱水活化，通常于400高温下加热6h，使氧化铝含水量在0%-3%之间，可得到级或级氧化铝，但温度过高也会破坏氧化铝内部结构。4.大孔吸附树脂和聚酰胺近年用于中药活性成份分离。第13页(二)洗脱涤选择 洗脱剂指是溶解被吸附样品和平衡固定相溶剂。适当洗脱剂应符合以下条件：纯度较高；稳定性好；能较完全洗脱所分离成份；黏度小；易和所需要成份分开。第14页 洗脱剂可依据分离物中各成份极性、溶解度和吸附剂活性来选择。普通蛋白质或核酸被极性强羟基磷灰石吸附后，要用含有盐缓冲液洗脱。而甾体或色素等化合物被极性较弱硅胶吸附后，则可用有机溶剂洗脱。所用洗脱剂浓度大小和极性强弱选择，需经过试验确定。在实践中，选择洗脱剂次序是由极性小到极性大(正向层析)。当把极性小洗脱剂换成极性大时，宜先将极性大和极性小洗脱剂混合使用，浓度则由低到高。总之，选取洗脱剂标准是能较完全地洗脱所要分离成份，并力争用量少、洗脱时间短。第15页(三)操作 柱层析设备主要有层析柱、部分搜集器、磁力搅拌器和恒流泵。有条件时，配置一台检测仪和一台统计仪就组成一个完整层析系统。1.层析柱 层析柱是下端有细口并带有筛板玻管。柱直径与长度之比，普通为110-140。采取极细吸附剂装柱时，宜用百分比大层析柱。反之，则宜用百分比小层析柱。这么有利于节约时间和提升分辨率。层析柱床体积是由吸附剂量和膨胀度决定。第16页2.吸附剂用量 吸附剂用量是依据其本身操作容量和分离物中各成份性质决定。当操作容量高时，吸附剂用量少。普通吸附剂用量为被分离样品30-50倍。若样品中各成份性质相同难以分开时，则吸附剂用量应增大，有时大于样品100倍 第17页3.装柱 装柱前要先将层析柱垂直固定在支架上。装柱方法分干装法和湿装法两种。干装法系直接加吸附剂到柱中，然后倒入溶剂。此法不易将气泡排尽。而湿装法系先加适量溶剂到柱内，排走其中空气，然后把预先用溶剂浸泡好吸附剂搅匀，随即将此悬浮液连续倾入柱中，待其自然沉降至柱高1/4-1/3时打开柱下端口，让溶剂慢慢流出，使柱上端悬浮液渐渐下降至需要高度。吸附剂表面要平整，应使其一直浸没在溶剂中，严防气泡产生。这种装柱法对各种基质都适用。装好层析柱应马上与洗脱剂连接，在一定操作压下(贮液器内液面与层析柱出口之间压力差)，控制其流速，让2-3倍柱体积洗脱剂流过固定相，使其到达平衡，也使固定相高度恒定或离子强度与洗脱剂一致。此时层析柱中基质应合乎填装均匀、松紧一致和没有气泡标准。第18页4.上样和洗脱 经过平衡层析柱，当平衡液流到与固定相表面一致位置时，用滴管轻轻地把样品溶液加到固定相表面，要尽可能防止冲动基质。加入样品液体积普通应小于床体积1/2(当加入样品量相同时，体积越小越有利于提升分辨率)。待样品液液面流到固定相表面时，用滴管加入洗脱剂(其体积用液面距固定相表面高度约5厘米计)，并在柱上端与装有洗脱剂贮液瓶连接开始冼脱。同时在柱下端与部分搜集器接通，马上进行分级搜集(按体积或时间分管搜集)。随即将搜集每管溶液进行浓度或活性测定。依据测定结果，即可绘制出洗脱曲线(以管号或洗脱体积为横坐标，以每管溶液中样品浓度或活性为纵坐标，有适当检测器和统计仪时，洗脱液流经检测器再搜集，用统计仪可自动绘制洗脱曲线。第19页 理想洗脱曲线如图3-1所表示。图中A峰和B峰均呈对称形，二者没有重合，这表明样品液中组分已完全分开。层析峰面积(FEG)、峰高(BE)和半峰高宽度(HI)等参数是定性、定量洗脱物依据。第20页 为了取得满意分离结果，洗脱液流速务必恰当控制。假如太快，洗脱物在两相中平衡过程不完全；假如太慢，洗脱物会扩散。若峰与峰之间有重合，宜降低洗脱剂强度，若峰间距离过大，或一些成份不能洗脱时，宜加大洗脱剂强度(极性)，成份复杂时，可采取洗脱剂由弱到强梯度洗脱(方法见离子交换层析)。由层析柱分离出样品经浓缩或冻干处理后，可进行纯度测定。如杂质含量仍大时，应该用其它方法继续纯化。第21页二、聚酰胺薄膜层析 聚酰胺薄膜(尼龙薄膜)层析是指样品溶液随流动相经过聚酰胺薄膜时，因为聚酰胺与各极性分子产生氢键吸附能力不一样，而将各组分分离方法。聚酰胺是由己二酸与己二胺聚合而成或由己内酰胺聚合而成高分子化合物。含有大量酰胺基团，其羰基可与含羟基物质形成氢键，其亚氨基又可与硝基化合物或醌类形成氢键，而产生吸附作用。不一样物质因为形成氢键能力不一样，故吸附力也不一样，经过吸附和洗脱就可到达分离目标。第22页 聚酰胺薄膜层析只适合用于极性分子分离。如，酚类、醌类、硝基化合物、氨基酸及其衍生物、核酸类物质等。尤其是在蛋白质化学结构分析中，氨基酸衍生物，如DNS(二甲氨基苯磺酰)-氨基酸、DNP(二硝基苯)-氨基酸等分析，灵敏度高，分辨力强，操作方便，速度较快。洗脱时，洗脱剂取代被吸附物与聚酰胺形成氢键，而使被吸附物解吸。各种化合物与聚酰胺形成氢键能力主要由物质分子结构所决定。另外也与所使用溶液相关。普通用水作溶剂时形成氢键能力最强，故轻易吸附，难于洗脱。在有机溶剂中形成氢键能力较弱，在碱性溶液中形成氢键能力最弱，所以洗脱剂最好选取碱性溶液，如二甲基甲酰胺(DMF)溶液、稀氢氧化钠溶液或稀氨水等。第23页第二节 分配层析 分配层析是利用各组分分配系数不一样而给予分离方法。分配系数(K)是指一个溶质在两种互不相溶溶剂中溶解到达平衡时，该溶质在两相溶剂中浓度比值：K=固定相中溶质浓度/流动相中溶质浓度 分配系数与溶剂和溶质性质相关，同时受温度、压力影响。所以不一样物质分配系数不一样。而在恒温恒压条件下，某物质在确定层析系统中分配系数为一常数。在分配层析中，通惯用多孔性固体支持物如滤纸、硅胶等吸着一个溶剂作为固定相，另一个与固定相溶剂互不相溶溶剂沿固定相流动组成流动相，某溶质在流动相带动下流经固定相时，会在两相间进行连续动态分配。当样品中含有各种分配系数各不相同组分时，分配系数越小组分，随流动相迁移越快。两个组分分配系数差异越大，在两相中分配 次数越多，越轻易被彻底分离。第24页 纸层析属于经典分配层析，且系统简单，使用方便，在生物化学发展中发挥过极其主要作用。本节主要经过纸层析介绍分配层析基本知识。另外，将硅胶、硅藻土等铺在玻璃或金属板上进行层析可组成薄层层析系统，因为薄层层析还可做吸附、离子交换等层析，将在本章第六节专门叙述，在硅藻土上吸附或化学键合一定溶剂，装到层析柱上，以气体为流动相可组成气液分配层析，即气相色谱系统，在硅胶等固体材料上吸附或化学键合一定溶剂，装到层析柱中，用一定洗脱剂洗脱，可组成液液分配层析，这种系统在高效液相色谱中应用普遍。气相色谱和高效液相色谱系统复杂，将在本章第七节和第八章专门介绍。第25页二、纸层析(一)原理 滤纸普通能吸收22%-25%水，其中6%-7%水是以氢键与滤纸纤维上羟基结合，普通情况下较难脱去。纸上层析实际上是以滤纸纤维结合水为固定相，而以有机溶剂(与水不相混溶或部分混溶)作为流动相。展开时，有机溶剂在滤纸上流动，样品中各物质在两相之间不停地进行分配。因为各物质有不一样分配系数，移动速度所以不一样，从而到达分离目标。第26页 溶质在滤纸上移动速率可用Rf值表示：Rf=a/b式中a：溶质斑点中心移动距离 b：溶剂前沿移动距离 Rf值决定于被分离物质在两相间分配系数以及两相间体积比。因为在同一试验条件下，两相体积比是一常数，所以Rf值决定于分配系数。不一样物质分配系数不一样，Rf值也不相同，由此能够依据Rf值大小对物质进行定性分析。第27页(二)影响Rf值主要原因 1.1.物质结构和极性物质结构和极性 物质结构和分子极性是影响Rf值主要原因。极性较大物质，在水中溶解度较大，其Rf值就较小，反之亦然。2.2.滤纸滤纸 不一样滤纸厚薄程度和纤维松紧度各不相同，所以结合水量不一样，两相体积比也就不一样。所以同一个物质在不一样型号滤纸上进行层析时，所得到Rf值也不相同。另外，滤纸上所含杂质也会影响Rf值，必要时要进行预处理，以去除杂质影响。比如：可用0.01-0.4mol/LHCl处理滤纸，以除去滤纸上金属离子，然后再用水洗至中性。层析滤纸由高纯度棉花制成。要求质地均一，厚薄一致，纤维松紧度适中，含有一定机械强度，并含有一定纯度。国产新华滤纸、日本东洋滤纸等均经常被采取。第28页3.层析所用溶剂 同一物质在不一样溶剂系统中进行层析时，Rf值不一样。所以溶剂配制和使用必须严格，才能使Rf值重现性好。在好溶剂系统中被分离物质Rf值应在0.05-0.85之间，样品中被分离组分Rf之差最好大于0.05。溶剂系统中试剂若纯度不够，需经过预处理后才能使用。处理方法因溶剂性质而异。常用处理方法有：酸、碱抽提，水洗涤，重蒸馏，脱水干燥等。举比如下：(1)苯酚：重蒸馏，收集180馏分。(2)乙酸：在冰醋酸中加入1%重铬酸钾，蒸馏，收集118馏分。(3)正丁醇：先后用2.5mol/L硫酸溶液和5mol/L氢氧化钠溶液洗涤，再用无水碳酸钾脱水，用磨口蒸馏器蒸馏，收集117馏分。第29页4.pH4.pH值值 溶剂和样品pH值会影响物质解离，从而影响物质极性和溶解度，使Rf值改变。溶剂酸碱度增大则流动相含水量增高，使极性物质Rf值增加；反之则降低。为了防止或降低pH值对Rf值影响，可将滤纸和溶剂用缓冲溶液处理，使之保持一定pH值，经过调整溶剂或样品溶液pH值，使pH值保持恒定。5.5.温度温度 温度能影响物质在两相中溶解度，即影响分配系数；也影响滤纸纤维水合作用，即影响固定相体积；同时在多元溶剂系统中，温度显著地影响溶剂系统含水量，即影响流动相组分百分比。所以温度改变使Rf值改变很大，为此，层析必须在恒温条件下进行。一些对温度敏感溶剂系统，最好不要配成饱和溶液。如水饱和酚溶液，可改成酚水 41或51等。第30页6.6.展开方式展开方式 同一物质在其它层析条件完全相同情况下，用不一样展开方式进行层析时，所得到Rf 值不相同。用下行法展开时，Rf值较大；用上行法展开时，Rf值较小；用圆形滤纸层析时，因为内圈较外圈小，限制了溶剂流动，Rf值也较小。7.7.样品溶液中杂质样品溶液中杂质 样品溶液中存在杂质时，有时对Rf值有所影响。比如：氯化钠存在会影响氨基酸Rf 值。第31页(三)操作方法 1.1.样品处理样品处理 用作纸层析样品，应尽可能除杂纯化。调整到一定pH值，浓度太低可用真空浓缩提升浓度，浓度太高则需稀释。2.2.点样点样 将滤纸裁成适当大小，用铅笔在距边线2cm左右划一直线(称为原线)，线上每隔2-3cm划一圆点(称为原点)。然后用点样器(定性分析可用普通毛细管，定量分析需用血球计数管或微量注射器)轻轻点在原点上。样品点直径约0.3-0.5cm。点样量应依据纸长短以及样品性质来决定，普通每一样品量为5-30g。点样普通采取少许屡次，每点一次必须用冷风吹干，然后再点第二次。每次点样位置应完全重合，不然会出现斑点畸形现象。第32页3.3.平衡平衡 点样以后展开以前先将滤纸与层析缸用配好溶液系统蒸汽来饱和，这个过程称之为“平衡”。若不经平衡，滤纸和层析缸未被溶剂蒸汽饱和，在层析过程中，滤纸会从溶剂中吸收水分，溶剂也会从滤纸表面挥发，从而改变溶剂系统组成，严重时纸上会出现不一样水平溶剂前沿，严重影响层析效果。平衡普通在密闭层析缸内进行。第33页4.4.展开展开 平衡结束后，将滤纸靠样品点一端浸入溶剂中，溶剂液面距原线距离约1cm，此时即开始展开。当溶剂前沿抵达滤纸另一端0.5-1cm处时，展开结束，取出滤纸，在溶剂前沿处做一标识，晾干或用冷风吹干。按溶剂在滤纸上流动方向不一样，展开有上行、下行和环行三种方式。(1)上行法：将滤纸点样一端向下浸入溶剂中，溶剂因毛细管引力作用从下向上流动。上行法操作简单，重现性好，是最惯用展开方法，但展开时间较长。(2)下行法：在层析缸上部有一盛展开剂液槽，将滤纸点样一端朝上浸入槽中，溶剂主要靠重力作用自上而下流动。下行法展开速度快，但Rf值重现性较差，斑点易扩散。第34页 (3)环行法：又称水平法，样品点于圆形滤纸距圆心1cm左右环形线(原线)上。滤纸水平放置，溶剂由滤纸条引向圆心，然后不停向四面水平方向流动。因为溶剂向圆周方向扩散，所以展开图谱呈弧形。用环行法展开时，最好使用无方向性特制滤纸。如东洋51UH滤纸等。（4）双向展开法：假如样品组分较多，用一个溶剂系统（常为酸性）不能将各组分全部分开时，可将样品点在方形滤纸一角，用一个溶剂系统展开后吹干溶剂，将滤纸转动90o后再用另一个溶剂系统（常为碱性）展开，这称为“双向展开法”。第35页5.5.显色显色 为了显示层析斑点位置，可依据物质性质不一样，采取显色剂显示或紫外光显示。(1)显色剂显示：被分离物质与显色剂生成有颜色化合物，显示斑点位置。惯用喷雾法、浸渍法或涂刷法。(2)紫外光显示：有些物质有紫外光吸收性质，如核苷酸类物质。有些物质受紫外光照射会发出荧光，如维生素B1、B2等，所以可在紫外光照射下观察到被分离物质斑点。6.6.定性分析定性分析 层析后斑点显示出来后，计算出各斑点Rf值，就能够对物质进行定性。第36页7.7.定量分析定量分析 对被分离物质进行定量方法很多，惯用有：(1)剪洗比色法：将斑点剪下，用适当溶剂洗脱后，经过分光光度计进行比色定量。(2)直接比色法：用特制分光光度计直接测量滤纸上斑点颜色浓度，画出曲线，由曲线所包含面积可求出待测物含量。(3)面积测量法：试验证实，圆形或椭圆形斑点面积与物质含量对数成正比。所以，可用测量斑点面积方法求得物质含量。第37页第38页第三节 凝胶层析 凝胶层析，又称为凝胶过滤、分子排阻层析或分子筛层析。是以各种凝胶为固定相，利用流动相中所含各物质相对分子质量不一样而到达物质分离一个层析技术。其设备简单，操作方便，不需要再生处理即可重复使用，适合用于不一样相对分子质量各种物质分离，已广泛地用于生物化学、生物工程和工业、医药等领域。一、基本原理 当含有各种组分样品流经凝胶层析柱时，大分子物质因为分子直径大，不易进入凝胶颗粒微孔，沿凝胶颗粒间隙以较快速度流过凝胶柱。而小分子物质能够进入凝胶颗粒微孔中，向下移动速度较慢，从而使样品中各组分按相对分子质量从大到小次序先后流出层析柱，而到达分离目标。第39页第40页 样品中各组分流出次序，可用分配系统Ka来量度：Ka=(Ve-Vo)/ViKa=(Ve-Vo)/Vi 式中Ve：为洗脱体积(elution volume)，表示某一组分从层析柱洗出到最高峰出现时，所需洗脱液体积；Vo：外体积(outer volume)，为层析柱内凝胶颗粒之间空隙体积；Vi：内体积(inner volume)，为层析柱内凝胶颗粒内部微孔体积。当某组分Ka=0Ka=0时(即Ve=Vo)，说明该组分完全不进入凝胶颗粒微孔，洗脱时最先流出；若某组分Ka=1Ka=1(即Ve=Vo+ViVe=Vo+Vi)时，说明该组分可自由地扩散进入凝胶颗粒内部微孔中，洗脱时，最终流出；KaKa在0-10-1之间组分，洗脱时Ka值小先流出，KaKa值大后流出。第41页 上述内体积Vi能够从凝胶干重和吸足水后湿重求得，也可用小分子物质(如(NH4)2SO4,NaCl等)实际测量而得到(Vo+Vi)。外体积Vo可用相对分子质量很大物质溶液(如血红蛋白、印度黑墨水、相对分子质量为200万蓝色葡聚糖-、铁蛋白等)经过实际测量求出。也能够从下式间接计算，Vo=Vt-Vi-VgVo=Vt-Vi-Vg 式中 Vg：凝胶基质本身体积；Vi：内体积；Vt：层析柱内凝胶床总体积。Vt可经过测量柱内径和凝胶床高度计算出来，即 Vt=Vt=（1/41/4）RR2 2h h 洗脱体积Ve可经过加进某一组分后实际测量而得，也能够在已知Ka后计算出来。即 Ve=Vo+KaVi Ve=Vo+KaVi 第42页 在普通情况下，凝胶对组分没有吸附作用。当洗脱液体积等于Vo+Vi时，全部组分都应该被洗脱出来，即Ka最大值为1。然而在某种情况下Ka值会大于1。这种反常现象说明这一层析过程不是单纯凝胶层析，其中可能还夹杂有吸附或离子交换等过程。对于同一类型化合物而言，组分洗脱体积Ve与相对分子质量(Mr)关系可用下式表示：Ve=KVe=K1 1-K-K2 2lgMrlgMr 式中K1，K2为常数。第43页 若以组分洗脱体积(Ve)对组分相对分子质量对数(lgMr)作图，可得一曲线，其中主要部分成直线关系。以此为标准曲线，能够经过测定某一未知组分洗脱体积，而从标准曲线中查得其相对分子质量。在实际应用中多以相对洗脱体积Kav(Kav=Ve/Vt)对lgMr作曲线，称为选择曲线，曲线斜率说明凝胶特征。每一类型化合物，如球蛋白类、右旋糖酐类、酶与清蛋白类等都有各自特定选择曲线。测定时，未知相对分子质量组分应位于直线部分。若不在直线部分，可选取另一个凝胶重新试验。第44页 二、凝胶选择二、凝胶选择 凝胶种类很多，其共同特点是内部含有微细多孔网状结构，其孔径大小与被分离物质相对分子质量大小有对应关系。惯用有：(1)聚丙烯酰胺凝胶 是一个人工合成凝胶，由丙烯酰胺(CH3=CH-CONH2)与甲叉双丙烯酰胺(CH3=CH-CONH-CH2-NHCO-CH=CH2)共聚而成。商品名称为生物胶P(Bio-Ge1P)。聚丙烯酰胺凝胶是完全惰性，适宜于各种蛋白质、核苷及核苷酸等分离纯化。缺点是遇强酸时酰胺键会水解，普通在pH2-11范围内使用。第45页 (2)葡聚糖凝胶 由相对分子质量为4 104-20 104葡聚糖交联聚合而成。由Pharmacia(GE)企业生产商品名为Sephadex葡聚糖凝胶，含有良好化学稳定性等优点，为最惯用凝胶之一。Sephadex耐碱，在0.01mol/L盐酸中放置六个月不受影响，故广泛用于各种物质分离纯化。Sephadex有G10、G15、G25、G50、G75、G100、G150、G200等各种型号、和粗、中、细、超细各种规格，G后面数字越大，胶粒内孔经越大，越适合于大分子分离，但颗粒 机械强度随孔经增大而降低，较高操作压会使G75、G100、G150、G200等颗粒变形而使洗脱液流速下降，故用上述型号Sephadex进行层析时，流速慢，时间长。同型号Sephadex，颗粒越细，在一样柱长柱子中分辨力越好，但流速也越慢。第46页 (3)琼脂糖凝胶 从琼脂中除去带电荷琼脂胶，可制成不带电荷琼脂糖，用琼脂糖制成颗粒内孔径不等各种型号层析用琼脂糖凝胶，商品为Sepharose。Sepharose孔经大，机械强度好，层析时流速较快，但只能分离相对分子质量较大分子。近年Pharmacia(GE)企业推出商品名为Supersose琼脂糖凝胶，主要有含琼脂糖6%Superose6 和含琼脂脂糖12%Superose12 及其衍生物。Superose刚性特好，理化稳定性高，在高黏度液体(如8mol/L尿素)下能保持很好流速，适合于糖类、核酸、病毒和包含体蛋白在促溶剂中纯化。第47页 4.聚丙烯酰胺葡聚糖凝胶 商品名Sephacryl，是由甲撑双丙烯酰胺交联丙烯葡聚糖形成球形凝胶颗粒，反压尤其低，机械性能好，分离速度快，分辨率高，理化稳定性好，在SDS、6mol/L盐酸胍及8mol/L尿素中均可使用。有S-100HR、S-200HR、S-300HR、S-400HR、S-500HR、S-1000SF6种型号，可分离相对分子质量1 103-1 108 蛋白质，亦可用于分离多糖和核酸。第48页 5.Superdex5.Superdex Pharmarcia企业提供新型凝胶过滤介质，是将葡聚糖共价结合到交联多孔琼脂糖珠体上制成球形凝胶珠，流速快、反压低、非特异性吸附很低，因而样品回收率很高，是当前分辨率和选择性最好凝胶过滤介质。理化稳定性很高，在0.1mol/L HCl及0.1 mol/L NaOH中40保温400小时分辨力保持不变，在1%SDS、8mol/L尿素及6mol/L盐酸胍中均能保持良好色谱性能，有各种型号可供选择，适合于生物大分子精细纯化。第49页三、操作三、操作 层析柱普通内径1-4cm，柱长10-150cm，装柱方法同吸附柱层析。加样方法同吸附柱层析，样品液浓度大些为好，但黏度不能过大，样品体积普通为柱体积1%-10%。凝胶柱平衡和洗脱普通用同一个溶液，洗脱液无特殊要求，普通选择使样品稳定缓冲液。洗脱液流速要稳定，分离蛋白质和核酸时，惯用输液泵、柱、检测器、分部搜集器、统计仪组成层析系统，要经过试验合理调整流速、检测器和统计仪灵敏度，统计仪走纸速度，才能取得良好洗脱曲线。若峰有重合，宜加长柱子，降低流速，若峰间距离过大，峰过宽，宜缩短柱子，加紧流速，降低走纸速度。峰过高，可降低加样量，或降低检测器和统计仪灵敏度。峰过低则需加大灵敏度，或加大加样量。凝胶暂时不用时，可加少许防腐剂如0.02%叠氮钠或0.002%洗必泰预防染菌。用过凝胶可加热灭菌后低温保留或用20%左右乙醇保留。第50页 一、基本原理一、基本原理 离子交换剂是由基质、电荷基团(或功效基团)和反离子组成，基质与电荷基因以共价键连 接，电荷基因与反离子以离子键结合。离子交换剂与水溶液中离子或离子化合物反应主要以离子交换方式进行，假设以RA+代表阳离子交换剂，其中A+为反离子，A+能够与溶液中阳离子B+发生可逆交换反应，反应式为：RA+B+RB+A+第四节 离子交换层析 离子交换层析是在以离子交换剂为固定相，液体为流动相系统中进行。此法广泛应用于很多生化物质(比如氨基酸、多肽、蛋白质、糖类、核苷和有机酸等)分析、制备、纯化，以及溶液中和、脱色等方面。第51页第52页 离子交换剂对溶液中不一样离子含有不一样结协力，这种结协力大小是由离子交换剂选择性决定。强酸性(阳性)离子交换剂对H+结协力比对Na+小；强碱性(阴性)离子交换剂对OH-结协力比对Cl-小得多；弱酸性离子交换剂对H+结协力远比对Na+大；弱碱性离子交换剂对OH-结协力比对Cl-大。所以，在应用离子交换剂时，采取何种反离子进行电荷平衡是决定吸附容量主要因子之一。离子交换剂与各种水合离子(离子在水溶液中发生水化作用形成)结协力与离子电荷量成正比，而与水合离子半径平方成反比。所以，离子价数越高，结协力越大。在离子间电荷相同时，则离子原子序数越高，水合离子半径越小，结协力亦越大。第53页 两性离子如蛋白质、酶类、多肽和核苷酸等物质与离子交换剂结协力，主要取决于它们物理化学性质和在特定pH条件下展现离子状态。当pH低于等电点(pI)时，它们带正电荷能与阳离子交换剂结合；反之，pH高于pI时，它们带负电荷能与阴离子交换剂结合。pH与pI差值越大，带电量越大，与交换剂结协力越强。离子交换层析之所以能成功地把各种无机离子、有机离子或生物大分子物质分开，其主要依据是离子交换剂对各种离子或离子化合物有不一样结协力。第54页第55页氨基酸离子交换分离原理氨基酸离子交换分离原理第56页氨基酸分离过程氨基酸分离过程第57页二、离子交换剂二、离子交换剂 离子交换剂应满足基本条件有：有高度不溶性。即在各种溶剂中不发生溶解；有疏松多孔结构或巨大表面积，使交换离子能在交换剂中进行自由扩散和交换；有较多交换基团；有稳定物理化学性质。在使用过程中，不因物理或化学因子改变而发生分解和变形等现象。第58页(一一)离子交换剂种类离子交换剂种类 依据离子交换剂中基质组成和性质，可将其分成两大类：1.1.疏水性离子交换剂疏水性离子交换剂 疏水性离子交换剂中基质是人工合成、与水结协力较小树脂。惯用树脂是由苯乙烯和二乙烯苯合成聚合物，其中二乙烯苯是交联剂，能把聚乙烯苯直链化合物连接成类似海绵状结构，在此结构中以共价键引入不一样电荷基团。离子交换树脂以电荷基团性质分则有：阳离子交换树脂、阴离子交换树脂(分别包含强、中、弱三种电荷基团)和螯合离子交换树脂(对金属离子有较强选择性)。第59页 (1)(1)阳离子交换剂阳离子交换剂 阳离子交换剂电荷基团带负电，反离子带正电。所以，能够与溶液中正电荷化合物或阳离子进行交换反应。依据电荷基团强弱，又可将阳离子交换剂分为强酸型(带磺酸基团)、中强酸型(带磷酸基团或亚磷酸基团)和弱酸型(带羧基或酚基)三种。(2)(2)阴离子交换剂阴离子交换剂 阴离子交换剂是在树脂中分别引入季胺-N(CH3)3、叔胺-N(CH3)2、仲胺-NHCH3和伯胺-NH2基团组成。当引入季胺和叔胺基团时，分别为强阴性和中强阴性离子交换剂。当引入仲胺和伯胺基团时，为弱阴性离子交换剂。第60页 树脂型离子交换剂普通都呈网络结构珠状体，其大小在20-50目之间。近年Bio-Rad企业还制造了50-100目、100-200目以及200-400目标产品，目数大树脂对提升分辨率和交换容量是有利。疏水性离子交换剂因为含有大量活性基团，交换容量高、机械强度大、流动速度快。所以，主要用于分离无机离子、有机酸、核苷、核苷酸和氨基酸等小分子物质，其次可用于从蛋白质溶液中除去表面活性剂(如十二烷基硫酸钠)、清洁剂(如tritonX-100)、尿素、两性电解质(Ampholyte)。另外，还可用于分离一些不易变性蛋白质。第61页疏水性离子交换剂对带电荷多和疏水性强被分离物有较强截留能力。阳离子交换树脂对氨基酸分离第62页 2.2.亲水性离子交换剂亲水性离子交换剂 这类交换剂与水亲和力较大，载体孔径大，适合于分离生物大分子，有各种类型：(1)纤维素离子交换型 以纤维素为基质，惯用功效基因有磷酸基(P.中强酸型)、磺酸乙基(SE，强酸型)、羧甲基(CM、弱酸型)、三乙基氨基乙基(TEAE，强碱型)、二乙氨基乙基(DEAE，弱碱型)、氨基乙基(AE，中等碱型)、三乙醇基氨基(ECTE，中等碱型)等，可制成纤维状、微粒、短纤维、球形四种类型，Pharmacia(GE)企业生产DEAE-Sephacel为球形颗粒，机械性能和理化稳定性好，对蛋白质、核酸、激素等都有良好分辨率、回收率和交换容量，使用简单方便，在生物化学与分子生物学中使用普遍。另外，Watman企业DE-、CM-、P-、AE-、SE-及QA-纤维素，Bio-Rad企业CellexD、CellexE、CellexP和CellexCM，及一些国产DEAE-纤维素和CM-纤维素也可选择使用。第63页 (2)葡聚糖系离子交换剂 以SephadexG25和G50为基质，分别引入DEAE、QAE(二乙基(二羧 丙基)氨基乙基，弱碱型)、CM、SP(磺丙基、强酸型)等功效基因，组成8种交换剂，交换容量较离子交换纤维素大，除离子交换作用外，还有分子筛作用，但层析时床体积随洗脱剂离子强度增加而缩小，以SephadexG50为基质交换剂尤其显著，为使用带来不便。第64页 (3)琼脂糖系列离子交换剂：琼脂糖系列离子交换剂：以琼脂糖为基质，主要有Pharmacia(GE)企业Sepharose和Bio-Rad企业Bio-gel两个系列。Sepharose系列离子交换剂：早期产品为DEAE-Sepharose CL-6B和CM-Sepharose CL-6B，对生物大分子分辨力好，交换容量大，床体积随洗脱液离子强度和pH改变小，使用较 Sephadex系列方便。后续产品Sepharose Fast Flow(Sepharose FF)理化稳定性和机械性能更加好。交换容量大，能够在床清洗，床体积随pH离子强度改变很小，因为流速和载量高，适合于进行大量粗产品纯化工作。引入功效机团有Q(强碱性)、SP、DEAE、CM四种。另外，Sepharose High Performnce(Sepharose HP)有Q-Sepharose HP和SP-Sepharose HP两种，颗粒细、分辨率高，理化稳定性好，流速和载量均适合于试验室或大量制备使用。Bio-GelA系离子交换剂：有DEAE-Bio-GelA和CM-Bio-GelA两种，回收率极高，床体积随pH和离子强度改变小，pH和化学稳定性好。第65页 (4)Source (4)Source系列离子交换剂系列离子交换剂 有Q(强碱型)和S(强酸型)两种，是低压层析系统中分辨率最高，流速最快离子交换剂，理化稳定性极好，可用1mol/L HCl和1mol/L NaOH在床清洗，使用寿命长，样品回收率高，重复性好，工艺放大轻易。(5)Mono Beads (5)Mono Beads系列离子交换剂系列离子交换剂 是Pharmacia(GE)企业推出新型交换剂，以亲水性聚醚为基质，能快速分离蛋白质，肽和低聚核苷酸，动态载样量大，可分离从mg到g单克隆抗体。第66页(二二)离子交换剂选择离子交换剂选择 任何一个离子交换剂都不可能适合用于分离全部样品。所以，选择理想离子交换剂是提升有效成份得率和分辨率一个主要步骤。1.1.阴、阳离子交换剂选择阴、阳离子交换剂选择 假如被分离物质带正电荷，应选择阳离子交换剂；假如被分离物质带负电荷，则应选择阴离子交换剂；假如被分离物质为两性离子，要按照其稳定状态净电荷来选择交换剂。假设一蛋白质等电点为5，若该物质在pH5-8稳定时，应选择阴离子交换剂；若该物质在pH5以下稳定时，则可选择阳离子交换剂。2.2.强、弱离子交换剂选择强、弱离子交换剂选择 普通来说，强离子交换剂适用pH范围很广。所以惯用它来制备无离子水和分离一些在极端pH溶液中解离且较稳定物质。而弱性离子交换剂适用pH范围较窄，在pH为中性溶液中交换容量也高，用于分离生物大分子物质时，其活性不易丧失。所以，分离生物样品多采取弱离子交换剂。第67页 3.3.反离子选择反离子选择 离子交换剂处于电中性时往往带有一定反离子。为了提升交换容量，普通应选择结协力较小反离子。所此，强阳性和强阴性离子交换剂应分别选择H型和OH型；弱酸性和弱碱性离子交换剂应分别选择Na型和Cl型。4.4.基质选择基质选择 树脂基质是疏水性化合物，而纤维素、葡聚糖和琼脂糖基质则是亲水性化合物。在分离生物大分子时，亲水性基质交换容量高，且对生物大分子物质吸附和洗脱都比较温和，被分离物质活性不易受到破坏。要恰当地选择离子交换剂，必须对被分离物性质和所处溶液组分及酸碱度等原因进行全方面分析。综合考虑上述4个方面，选择离子交换剂才能成功地分离样品。第68页三、操作三、操作 1.1.离子交换剂处理、再生和转型离子交换剂处理、再生和转型 取适量固体离子交换剂先用水浸泡，待充分膨胀后加大量水悬浮除去细颗粒，尔后改用酸碱浸泡，方便除去杂质和使其带上需要反离子。疏水性离子交换剂能够用2-4倍2mol/L NaOH或2m