血管内皮祖细胞(EPC)与自体骨髓干细胞移植ppt课件.ppt

血管内皮祖血管内皮祖细胞（胞（EPC）与）与自体骨髓干自体骨髓干细胞移植胞移植首都医科大学血管外科研究所首都医科大学血管外科研究所首都医科大学宣武医院血管外科首都医科大学宣武医院血管外科 吴英锋 谷涌泉 郭连瑞 张建1.1997年年Asahara等首先描述了循等首先描述了循环于外周血中的于外周血中的内皮祖内皮祖细胞胞（endothelial progenitor cell，EPC）。应用免疫磁珠法首先从外周血分离用免疫磁珠法首先从外周血分离CD34+细胞，胞，经在在纤维连接蛋白（接蛋白（fibronectin,Fn）预衬的培养皿培养，的培养皿培养，这些些细胞胞转变成内皮特征成内皮特征细胞。胞。意意义：（1）更正并充）更正并充实了了长期以来人期以来人们所所认识的血管新生机制的血管新生机制（2）为缺血性疾病及缺血性疾病及恶性性肿瘤的治瘤的治疗提供了新的靶点提供了新的靶点2.血管内皮祖血管内皮祖细胞胞（EPC）概念概念 EPC又称又称为血管母血管母细胞胞/成血管成血管细胞胞（angioblast）,是指能分化是指能分化为血管内皮血管内皮细胞胞的前体的前体细胞，包括从血液血管干胞，包括从血液血管干细胞胞(hemangioblast)到成熟内皮到成熟内皮细胞之胞之间的的多多个个阶段段的的细胞。胞。换句句话说，EPC是向成熟内皮是向成熟内皮细胞分化胞分化过程程中的具有特殊表型和特性的中的具有特殊表型和特性的过渡渡细胞群体。胞群体。3.血管内皮祖血管内皮祖细胞胞（EPC）来源（一）普遍认为内皮细胞系与造血细胞系共同来源于中胚层的一种共同祖先细胞血液血管干细胞(1)胚胎发育上的时空联系：在鼠胚7.5日龄、人胚13日龄胚外造血启动，卵黄囊的胚外中胚层聚集成血岛（blood island）。位于血岛外层的细胞分化成原始的血管内皮细胞，血岛中央的细胞则变成原始的造血细胞。多个血岛腔隙相互联结成网状结构，形成原始血管床，此过程称之为血管发生(vasculogenesis)。(2)造血细胞与血管内皮细胞共同具有众多细胞表面标记：SCL/TAL-1、CD34、VEGFR-2、GATA-2、PECAM-1、Tie-1、Tie-2和CD133等。(3)某些胚胎源细胞的双系分化能力：有人用VE-cadherin从胚胎中分离到不表达CD45和Ter119的“内皮细胞”，发现该细胞可产生包括T和B淋巴细胞在内的造血细胞，证明了胚胎期内皮细胞系与造血细胞系的同源性。同时有实验表明，小鼠、鹌鹑、鸡的胚胎干细胞、Flk-1+细胞、Tie-2+细胞及VE-cadherin+细胞在不同生长因子刺激下可同时产生造血和内皮系细胞4.血管内皮祖血管内皮祖细胞（胞（EPCEPC）n来源（二）Reyes等人从人及啮齿类动物的骨髓中分离出一种多潜能成体祖细胞（multipotent adult progenitor cell,MAPC），细胞表型为CD34-/HLA-DR-/CD133+/VEGFR-2+,同时胚胎干细胞表面标记Oct-4+。这种细胞增殖80代未见衰老，同时单个MAPC既能分化为中胚叶的肢芽组织细胞（脂肪细胞、基质细胞、成骨细胞等），又能分化为中胚叶的内脏组织细胞（内皮细胞）。在VEGF诱导下，能产生CD34+/VE-cadherin+/flk-1+细胞，后者恰与EPC的表型一致n来源（三）CD45+的单核、巨噬细胞n来源（四）循环于血液中脱落的内皮细胞5.图1 EPC的来源，AB代表angioblasts 6.血管内皮祖血管内皮祖细胞（胞（EPC）分子标记及生物学特性从形态特征上不能与成熟血管内皮细胞区别近年来发现 CD133在EPC表达而在成熟血管内皮细胞则无表达 一般认为，早期EPC的三个表面标志性抗原：CD133、CD34和内皮细胞生长因子受体-2（VEGFR-2）,后者在人类称KDR,在鼠类称flk-1 7.血管内皮祖血管内皮祖细胞（胞（EPC）分子标记及生物学特性骨髓中的早期EPC尚不表达VE-cadherin和vW因子，在成体外周血中发现的EPC是较成熟的EPC，基本失去了CD133抗原但仍保留CD34 和VEGFR-2阳性，外周血的EPC还以不同强度表达内皮系的其他标志分子：CD31、CD146、VE-cadherin、vW因子和内皮型NO合成酶等，成熟的血管内皮细胞（EC）则高表达VEGFR-2、VE-cadherin和vW因子 CD133抗原的丢失标志着外周循环中的EPC在向着成熟EC转化 8.血管内皮祖血管内皮祖细胞（胞（EPC）较高的数量和迟发的高增殖潜能实验证明，外周循环中成熟的EC数量极少，约2.61.6（2-3）个/ml，而EPC则约500-1000个/ml，两者比较相差悬殊成熟微血管内皮细胞在体外能很快进入增殖期，但4-6周（8-10代）后增殖活力即逐渐下降。与此相反，外周血、胎肝、骨髓来源的CD34+细胞在15-20天后形成迅速生长的鹅卵石样内皮细胞层，并能稳定传代30次以上，其增殖潜能是脐静脉内皮细胞的10倍。Lin等发现骨髓来源的EPC与EC体外扩增能力之比为50:1。9.血管内皮祖血管内皮祖细胞（胞（EPC）动员 不同祖系的细胞由骨髓释放到外周血称为动员 许多生长因子、酶、配基及表面受体调节EPC的动员基质金属蛋白酶-9（MMP-9）的活化可能是动员的第一步其他促使动员的信号尚不清楚，但至少包括来自外周的促血管生长因素明显的例子包括肢体缺血、血管损伤、烧伤和冠脉旁路术后循环中EPC数量的迅速增加，这些事件都与内源性VEGF水平的增高有关10.血管内皮祖血管内皮祖细胞（胞（EPC）分离EPC可从脐带血及成体外周血、胎肝、骨髓中获取目前，分离EPC的方法主要有以下两种（1）根据EPC表型用免疫磁珠法获得。先用Ficoll液密度梯度离心获取单个核细胞，然后用标记有相应细胞表面抗体的免疫磁珠将单个核细胞中的带有特定表面抗原的EPC筛选出来，一般选用CD34和/或CD133免疫磁珠（2）贴壁法特定培养基分化分离EPC。通过密度梯度离心得到单个核细胞后，把这些细胞接种在表面涂有胞外基质（主要用Fn）培养容器里，使用添加有特殊生长因子的培养基培养。这些特殊的促生长因子有VEGF、干细胞生长因子（SCGF）、牛脑提取物以及复加bFGF、IGF、EGF、ascorbic acid 的混合物11.EGM-2MV 培养液(包含5%FBS、VEGF、hFGF-b、hEGF、IGF-1、Hydrocortisone和Ascorbic acid等)(Cambrex)，IMDM培养液(Hyclone)，DMEM完全培养液(中日友好临床医学研究所)，FBS(Hyclone)Fibronectin(Sigma)，Histopaque-1077(Sigma)，MTT(Sigma)，Dil-ac-LDL(BTI)抗因子单抗(Zymed)，抗flk-1单抗(Santa Cruz)，抗CD133单抗(Miltenyi Biotec)APC标记的CD34单抗(BD)，FITC标记的CD133单抗(R&D)，PE标记VEGFR-2单抗(R&D)酶标仪(Pasteur)，流式细胞仪(Becton Dickinson)，Olympus倒置相差显微镜，Olympus普通光学显微镜，Nikon荧光显微镜，JEM-1010型透射电子显微镜(JEOL)贴壁培养材料和壁培养材料和仪器器12.技技术路路线犬骨髓1018ml(n=5)获取单个核细胞(BMMNC)Fn衬底EGM-2MV培养接种24孔板玻片送FCM梯度密度离心3、7日免疫组化原代汇合(平均10天)第7日送FCM第10日送FCM爬片作免疫组化传代，继续培养生长曲线测定TEM检测犬颈外静脉酶法获取EC2%明胶衬底DMEM培养原代汇合继续培养Dil-ac-LDL摄取实验IMDM培养原代汇合继续培养13.培养48小时，可见长梭形、三角形、纺锤形或不规则形贴壁细胞呈集落样生长第911日，原代细胞汇合成层，近似单层铺路石状排列结 果果第48小时（200）EPCs原代汇合时（200）14.原代汇合时，平均每毫升骨髓可获细胞约(1.30.3)106细胞生长曲线第5代，细胞增殖明显减缓结 果果*15.免免疫疫细胞胞化化学学F-EPCs ECs MSCs VEGFR-2 CD133-actin16.TEMTEM检测 EC EPC MSC17.功能检测：n绝大多数细胞呈阳性反应EPCECMSCDil-ac-LDLDil-ac-LDL摄取取实验18.增殖效率：增殖效率：新分离的BMMNCs，CD34、VEGFR-2和CD133三个表面抗原均阳性的细胞占0.12%第10天，VEGFR-2和CD133双阳性细胞达29.03%，增加了242倍流式流式细胞胞术19.目前，获取EPCs的方法主要有两种表面抗原分离法,具体采用免疫磁珠法获得离体扩增培养法表面抗原分离法不可能获得纯度较高的EPCs上述三种细胞表面抗原也同时存在于造血干细胞尚存在CD34内皮祖细胞免疫磁珠法具有操作复杂、反复筛洗使获取细胞活性降低、费用高等缺点，不适于临床应用和大规模培养离体扩增培养法不仅可以克服上述缺陷，还因为BMMNCs中含有CD34+和CD34-细胞，共培养这些细胞还可促进CD34+的EPCs增殖 讨 论20.新分离的BMMNCs中的含有也同时表达上述三个表面抗原的HSCs，而扩增10日的贴壁细胞中不会含有HSCs，故实际扩增倍数要高得多免疫细胞化学和流式细胞术因子亦呈明显阳性反应，说明EPCs在向成熟方向ECs转化阳性细胞率不完全一致两种方法的敏感性不一致目前没有商品化的犬的单克隆抗体可利用胰蛋白酶消化贴壁细胞时也破坏了一定数量的细胞表面抗原 讨 论21.结论（1）应用离体扩增培养法可成功地从骨髓中分离培养并扩增出一个具有EPCs特征的细胞群体：单层鹅卵石样外观，CD133、因子相关抗原和VEGFR-2阳性，接近于ECs的超微结构，能够摄取Dil-ac-LDL这些细胞具有较高的增殖能力22.胚胎干细胞向内皮细胞分化1996年，Vittet D等采用小鼠ESC定向分化产生血管内皮细胞 2002年，Levenberg S等从人ESC诱导分化出血管内皮细胞 ESC来源的血管祖细胞具有体内成血管作用 23.试剂配制鼠ESC培养基：高糖DMEM，含15%FBS（胎牛血清），100 mmol/L NEAA（非必需氨基酸），0.55 mmol/L-ME（-巯基乙醇），0.1 mmol/L L-GLU（L-谷氨酰胺），105U/L PS（青链霉素）。使用前添加106U/L LIF（白血病抑制因子）。分化培养基：不含LIF的ESC培养基添加终浓度50ng/ml 的VEGF（血管内皮生长因子）。VB分化培养基：不含LIF的ESC培养基，添加VEGF 50ng/ml、bFGF（碱性成纤维细胞生长因子）100ng/ml。细胞冻存液：50%ESC培养基，40%ES专用胎牛血清，10%DMSO，混匀后备用（现用现配）。24.ESC的形态学观察鼠ESC在饲养层上能保持未分化状态，细胞团形态呈鸟巢样，边缘清晰，单个细胞体积小，折光性强，核质比高，集落大小不等，与索条状的MEF分界清晰，未见分化细胞 脱离饲养层细胞后，在LIF的作用下，集落周边可出现扁平的细胞突起，呈现出轻微的分化状态20020025.ESC的鉴定碱性磷酸酶检测：鼠ES细胞集落全部红染，为碱性磷酸酶染色阳性（100）26.ESC的鉴定Oct-4：20020027.ESC的鉴定SSEA-120020028.拟胚体形成 悬浮培养法：以0.25%的胰酶/EDTA消化接近完全融合的鼠ESC，离心去上清，重悬计数。将细胞悬液按不同的密度接种至低粘附的培养皿中，采用不同的培养基培养，观察细胞形成悬浮的球形细胞团，即拟胚体（embryoid body，EB）的数量及生长状态。29.拟胚体形成：悬浮培养法Day2Day9Day4Day1220030.ESC的分化诱导简单两步法 第一步：EB形成：采用悬浮培养法第二步：EB的直接种植培养：取培养第4天的EB悬液，按50-100l/孔用量移入0.1%明胶预衬的6孔培养板中，以分化培养基培养，每1-2天换液一次，换液时以PBS或Hanks液洗去未贴壁细胞。待细胞至70%-80%融合时，进行消化传代，即为ESC-EC P1。一般5-7天传代一次，多余细胞冻存。31.拟胚体的分化种植将Day4的EB直接种植，采用分化培养基培养，6小时内即贴壁生长，24h后可见从贴壁生长的EB周围出芽样长出梭形或多角形细胞，向外放射状生长，并与周围集落融合。EB Day4，400Day1，200Day2，100Day4，100Day9，100Day15，10032.分化细胞的鉴定DiI-Ac-LDL摄取实验：P9P9，40033.分化细胞的鉴定DiI-Ac-LDL摄取实验：L929（阴性对照）40034.分化细胞的鉴定荧光双染：DiI-Ac-LDL摄取及FITC-UEA-1 P1，40035.分化细胞的鉴定免疫组化染色：CD31空白空白对照，照，400P15，40036.分化细胞的鉴定免疫组化染色：Flk-1空白空白对照，照，400P15，40037.分化细胞的鉴定流式细胞仪检测：CD31阳性细胞比例逐渐增加，第2代（P2）时即可达71.7%82.4%（平均76.6%），P6时则达84.8%90.1%（平均86.1%），不断传代后最终维持在90%左右的较高水平。P2P6P938.分化细胞的鉴定透射电镜检测：分化产生的细胞胞质内细胞器丰富，核周有散在的粗面内质网和丰富的糖原颗粒，线粒体甚为丰富。39.分化细胞的鉴定透射电镜：细胞膜下及胞质内常见大小不等的吞饮小泡及多泡小体。40.分化细胞的鉴定透射电镜：Weibel-Palade（W-P）小体，是位于胞浆内的棒状呈束的微管，周围有单层膜包被。41.结论（2）采用简单的贴壁培养，单独采用VEGF即可成功诱导小鼠胚胎干细胞分化产生内皮样细胞。经传代培养后，分化细胞中CD31阳性细胞可达到90%以上，纯度高。42.EPC的的临床床应用与骨髓干用与骨髓干细胞移植胞移植血管新生（neovascularization）有三种方式：血管生成（angiogenesis）、血管发生（vasculagenesis）和动脉生成（arteriogenesis）血管生成是指通过血管内皮细胞迁移、增殖，在原有的血管上以出芽的方式生长出新的血管；血管发生是指在原来没有血管系统的情况下，通过EPCs和造血干细胞产生血流的新通道传统观念认为vasculagenesis仅和angiogenesis共存于胚胎发育时期，而不参与出生后的血管新生。正是1997年Asahara等首先报道了“出生后血管发生（postnatal vasculagenesis）”，才使这一观念得以纠正目前认为：vasculagenesis和angiogenesis不仅共存于胚胎发育时期，而且还参与出生后的血管新生43.图 2 血管生成和血管发生 44.EPC参与出生后诸多的生理过程补充血管壁脱落的EC 女性子宫和卵巢的周期性变化都有血管发生的参与转基因小鼠的系统研究证明，在脑、肺、肝、肠、皮肤及肌肉的血管中都整合有一定的转化细胞，在排卵期的黄体和子宫内膜上尤为明显EPC的的临床床应用与骨髓干用与骨髓干细胞移植胞移植45.EPC参与了出生后诸多的病理过程肢体缺血心肌梗塞肥胖相关疾病：型糖尿病、高血压、高血脂糖尿病视网膜病变肿瘤动脉粥样硬化 EPC的的临床床应用与骨髓干用与骨髓干细胞移植胞移植46.治疗性血管发生（therapeutic vasculogenesis）1999年，Isner等首先提出了“治疗性血管发生”的概念倡导以提高补充EPC数量来增加血管生长因子的作用底物，达到更好的血管新生效果，治疗缺血性疾病这一疗法充分利用成年机体血液循环中存在EPC、EPC对缺血组织的自动趋化能力和归巢能力、EPC能分化形成血管的生物学特性，可以说是一个生理加强疗法。EPC的的临床床应用与骨髓干用与骨髓干细胞移植胞移植47.治治疗性血管性血管发生生治疗肢体缺血（图3）48.EPC功能分类Early EPC:来源于CD14+细胞Late EPC:来源于CD14-细胞Mukai N，et al.Experimental cell research 2 0 0 8，3 1 4：4 3 0 4 4 049.治治疗肢体缺血肢体缺血大量的动物实验表明，外源EPC有助于缺血肢体模型的血管化hintani等用家兔下肢缺血模型研究，经血管造影、激光多普勒、缺血组织切片毛细血管密度观察，发现细胞移植组侧支血管形成及血管新生均有明显改善 Crosby等用有基因组标记的转基因小鼠的胎肝细胞移植经射线照射的小鼠，随后在小鼠背部皮下植入小海绵，4周后取出海绵和一些未损伤的皮肤、动脉和脑标本制成切片。计数切片中总的内皮细胞，发现海绵中来源于供体EPC的内皮细胞占总内皮细胞数的8.3%-11.2%，而在正常组织中只占0.2%-1.4%50.治疗急性心肌梗塞 心梗后坏死心肌不能停止疤痕化，存活心肌代偿性肥大、左心室结构重排，即“心室重建”，最终发展为心衰EPC治疗急性心梗有很多成功的动物研究报道临床上Strauer用自体骨髓单个核细胞移植治疗一名大面积心梗的患者获得成功，植入的细胞成功的再造了被破坏的心肌组织和血管组织 51.治疗急性心肌梗塞可能机理 EPC在梗塞核心区以血管发生的方式形成新毛细血管和其它细胞共同分泌VEGF等生长因子，刺激梗塞边缘区健康小血管通过血管生成方式发芽生长在和有活力心肌细胞接触过程中，横向分化为心肌细胞参与重建52.肿瘤细胞可分泌多种与血管生成有关的细胞因子如bFGF、aFGF、VEGF、HGF和angiopoietin等，这些细胞因子动员骨髓EPC进入血液循环并参与肿瘤的血管生成 在肿瘤分泌的细胞因子作用下，EPC可定向归巢于肿瘤。利用抑制血管发生因子偶联于EPC可抑制肿瘤的生长将某些抗肿瘤基因或自杀基因修饰后的EPC移植入体内，定位于肿瘤的血管新生部位，通过“Trojan Horse”效应表达抗肿瘤生长因子，也可破坏肿瘤细胞的生长和转移 治疗肿瘤53.组织工程产物的血管化是目前遇到的一个普遍问题，尤其是大器官的血管化问题研究表明，仅靠营养的渗透作用，体积超过几个立方毫米的人工组织就不能存活EPC的高增殖潜能又成为一个有希望的组织工程血管的种子细胞来源动物试验方面，已经有EPC种植于血管移植物管腔内面，动物体内证实了其良好的抗血栓形成潜能。其临床应用也在进一步研究当中 组织工程产物血管化54.治疗肿瘤基因修饰还可用来改变EPC的生物学形状，从而增强其治疗的活性Iwaguro等证实体外VEGF基因转导增强了EPC的增殖、黏附功能，较未转导者的VEGF表达高两倍。将转导细胞注入无胸腺裸鼠的缺血后肢，新血管形成和血流恢复均提高Murasawa等则利用端粒酶逆转录酶转染EPC，通过提高端粒酶的活性使EPC的有丝分裂活性、迁移活性、细胞存活和血管新生能力均得到提高，为EPC基因修饰开拓了一条新道路基因治疗的安全性仍是一个普遍争论的问题，其临床应用时机还不成熟 基因载体55.结语EPC在成体的分离和培养是一个重大的发现EPC有着广泛的临床应用前景EPC的广泛的应用还需要大量的临床前研究工作 56.结语存在的问题（举例）EPC生物学特性（低剂量生长激素、阿司匹林、HDL、红酒、二手烟等）EPC富集、分离纯化方法的改进EPC治疗的适应症、途径基因治疗的安全性促血管发生与促肿瘤生长的矛盾 57.58.59.