外源基因表达与基因工程药物ppt课件.ppt

第十章外源基因表达与基因工程药物1 1.第一节 概 述外源基因的表达：利用细胞内相关酶系及其调控系统，将外源基因转录成肽链或加工成活性蛋白质的过程。具体的说，利用分子生物学技术，在体外将编码外源蛋白质的基因重组至适宜的表达载体上，通过相关技术将其导入宿主细胞内，借助宿主细胞的转录、翻译或翻译后修饰酶系及相应的调控系统，在宿主细胞合成或分泌具有原有生物活性的蛋白质。2 2.目的：针对难以或无法从自然界直接提取、分离、纯化所获得的，或制造成本、产量规模等受限制的，或利用化学方法无法合成的多肽，蛋白质、酶这类生物分子药物，利用细胞或组织或器官或生命体的复制、转录、翻译及其调控系统以及翻译后加工、修饰等体系，按人的意愿生物合成这些生物分子，并从中将表达产物分离纯化至预期程度，最终加工成药品。3 3.基因工程概念基因工程概念基因工程基因工程基因工程基因工程(genetic engineering(genetic engineering）是指采用人工方法将不同来源的是指采用人工方法将不同来源的是指采用人工方法将不同来源的是指采用人工方法将不同来源的DNADNA进进行重行重行重行重组组，并将重，并将重，并将重，并将重组组后的后的后的后的DNADNA引入宿主引入宿主引入宿主引入宿主细细胞中胞中胞中胞中进进行增殖或行增殖或行增殖或行增殖或表达的表达的表达的表达的过过程，从而改程，从而改程，从而改程，从而改变变生物特性生物特性生物特性生物特性或或或或创创造新的生物造新的生物造新的生物造新的生物类类型的技型的技型的技型的技术术4 4.基因工程的基因工程的发展史展史5 5.一、基因表达基本原理基因表达(gene expression)是指储存遗传信息的基因在各种调节机制下经过一系列步骤表现出其生物功能的整个过程。典型的基因表达是基因经过转录和翻译，产生有生物活性的蛋白质过程。基因工程技术的核心是基因表达技基因表达技术。基因重组的主要目的是要使目的基因在某一细胞中能得到高效表达。6 6.基因表达在原核生物与真核生物中的差基因表达在原核生物与真核生物中的差别7 7.原核生物与真核生物原核生物与真核生物肽链合成合成过程的主要差程的主要差别原核生物原核生物真核生物真核生物mRNA一条一条mRNA编码几种蛋白几种蛋白质（多（多顺反子）反子）一条一条mRNA编码一种蛋白一种蛋白质（单顺反子）反子）转录后很少加工后很少加工转录后后进行首尾修行首尾修饰及剪接及剪接转录、翻、翻译和和mRNA的降解可同的降解可同时发生生mRNA在核内合成，加工后在核内合成，加工后进入胞液，再入胞液，再作作为模板指模板指导翻翻译核蛋白体核蛋白体30S小小亚基基50S大大亚基基 70S核蛋白核蛋白体体40S小小亚基基60S大大亚基基 80S核蛋白体核蛋白体起始起始阶段段起始氨基起始氨基酰-tRNA为fMet-tRNAfMet起始氨基起始氨基酰-tRNA为Met-tRNAiMet核蛋白体小核蛋白体小亚基先与基先与mRNA结合合,再与再与fMet-tRNAfMet结合合核蛋白体小核蛋白体小亚基先与基先与Met-tRNAiMet结合，合，再与再与mRNA结合合mRNA中的中的S-D序列与序列与16S rRNA 3-端端的一段序列的一段序列结合合mRNA中的帽子中的帽子结构与帽子构与帽子结合蛋白复合合蛋白复合物物结合合有有3种种IF参与起始复合物的形成参与起始复合物的形成有至少有至少10种种eIF参与起始复合物的形成参与起始复合物的形成延延长阶段段延延长因子因子为EF-Tu、EF-Ts和和EF-G延延长因子因子为eEF-1、eEF-1和和eEF-2终止止阶段段释放因子放因子为RF-1、RF-2和和RF-3释放因子放因子为eRF8 8.蛋白质合成的特点 1.真核生物真核生物的蛋白的蛋白质合成与合成与mRNA的的转录分开分开进行行 原核生物原核生物的蛋白的蛋白质合成与合成与mRNA的的转录偶偶联在一起同在一起同时进行行2.真核生物真核生物中的中的mRNA为单顺反子反子 原核生物原核生物中的中的mRNA为多多顺反子反子 3.真核生物真核生物合成体系中的合成体系中的RNA和蛋白和蛋白质在在结构上与原核生物构上与原核生物不同，且其不同，且其线粒体有独立的蛋白粒体有独立的蛋白质生物合成体系生物合成体系 9 9.阻遏蛋白介阻遏蛋白介导的的负调控和控和cAMP-CAP介介导的正的正调控共同担控共同担负着原核生物体内糖源的着原核生物体内糖源的协调利用利用翻翻译水平的水平的调控是控是对原核生物原核生物转录水平的水平的补充充 1.转录与翻与翻译的偶的偶联提高了基因表达提高了基因表达调控的有控的有效性效性 2.SD序列序列影响翻影响翻译起始速率起始速率 3.翻翻译阻遏利用蛋白与自身阻遏利用蛋白与自身mRNA的的结合合实现翻翻译起始的起始的调控控 4.mRNA密密码子的子的编码频率率影响翻影响翻译的延伸的延伸速度速度基因表达基因表达调控的影响因素控的影响因素原核生物1010.（一）一）真核生物染色真核生物染色质结构构影响基因影响基因转录 1.转录活化的染色活化的染色质对核酸核酸酶极极为敏感敏感 2.转录活化的染色活化的染色质的的组蛋白蛋白发生改生改变 3.RNA聚合聚合酶结合位点的上游和下游具有不同的合位点的上游和下游具有不同的超螺旋构象超螺旋构象 4.CpG岛甲基化水平降低甲基化水平降低（二）（二）顺式作用原件式作用原件（启（启动子、增子、增强子和沉默子）子和沉默子）直接影响基因表达活性直接影响基因表达活性（三）（三）转录因子因子的的调控控（四）真核生物在（四）真核生物在转录后仍可控制后仍可控制mRNA的的结构和构和功能，其在功能，其在转录后后层次次不同于原核生物不同于原核生物基因表达基因表达调控的影响因素控的影响因素真核生物真核生物1111.目标蛋白性质是否需要糖基化三维结构复杂程度简单结构复杂的三维结构原核表达系统真核表达系统是否1212.二、基因表达基本类型原核细胞表达系统真核细胞表达系统大肠杆菌系统，芽孢杆菌系统等产物溶解情况表达位置产物结构状态转基因动植物酵母细胞、昆虫细胞和动物细胞等包涵体 可溶性胞内定位表达分泌表达非融合表达融合表达1313.第二节外源基因表达基本过程 将外源基因通将外源基因通过体外重体外重组后后导入受体入受体细胞，使胞，使该基因能在受体基因能在受体细胞内复制、胞内复制、转录、翻翻译和表达和表达【四个要素四个要素】工具工具酶、载体、基因和受体（宿主）体、基因和受体（宿主）细胞胞 1414.基因工程的基本基因工程的基本过程程1.目的基因的目的基因的目的基因的目的基因的获获取取取取：从生物体中分离或人工合成：从生物体中分离或人工合成：从生物体中分离或人工合成：从生物体中分离或人工合成 2.重重重重组载组载体的构建体的构建体的构建体的构建：对对目的基因和目的基因和目的基因和目的基因和载载体体体体DNADNA进进行剪行剪行剪行剪切、修切、修切、修切、修饰饰，在，在，在，在连连接接接接酶酶的作用下的作用下的作用下的作用下连连接形成完整有复接形成完整有复接形成完整有复接形成完整有复制能力的重制能力的重制能力的重制能力的重组组体体体体3.重重重重组组DNADNA分子分子分子分子导导入合适的受体入合适的受体入合适的受体入合适的受体细细胞胞胞胞：重：重：重：重组组DNADNA分子引入受体分子引入受体分子引入受体分子引入受体细细胞中胞中胞中胞中进进行行行行扩扩增增增增1515.基因工程的基本基因工程的基本过程程4.重重组体的体的筛选与与鉴定定：直接：直接筛选法法(如抗如抗药标志志选择)和免疫学方法和免疫学方法5.目的基因的表达及分离目的基因的表达及分离纯化化：原核与真核：原核与真核表达表达1616.一、目的基因的获得外源基因表达的第一步是获得目的基因获得目的基因的主要方法包括：化学合成 RT-PCR从含有目的基因的总RNA或mRNA中扩增 从cDNA文库或基因组文库中PCR扩增 通过杂交技术筛选 利用合适的筛淘技术从各种文库中筛选1717.聚合聚合酶链式反式反应(PCR)PCR PCR（polymerase chain reactionpolymerase chain reaction）:在体外由引物介在体外由引物介在体外由引物介在体外由引物介导导的、的、的、的、酶酶促快速合成促快速合成促快速合成促快速合成扩扩增特定基因或增特定基因或增特定基因或增特定基因或DNADNA片段的一种片段的一种片段的一种片段的一种方法。方法。方法。方法。原理原理原理原理 在适当在适当在适当在适当缓缓冲液（冲液（冲液（冲液（Mg2+Mg2+）反）反）反）反应应体系中，根据碱基配体系中，根据碱基配体系中，根据碱基配体系中，根据碱基配对对原理利用原理利用原理利用原理利用DNADNA聚合聚合聚合聚合酶酶催化和催化和催化和催化和dNTPsdNTPs的参与下，引物的参与下，引物的参与下，引物的参与下，引物依依依依赖赖于于于于DNADNA模板特性指模板特性指模板特性指模板特性指导导DNADNA合成合成合成合成1818.基本步基本步骤1.变变性：性：性：性：双双双双链链DNADNA解离成解离成解离成解离成为单链为单链(90(90以上以上以上以上)2.退火退火退火退火(复性复性复性复性)：引物与模板引物与模板引物与模板引物与模板DNADNA单链单链的互的互的互的互补补序列序列序列序列配配配配对结对结合（合（合（合（50 50 左右）左右）左右）左右）3.延伸：延伸：延伸：延伸：DNADNA模板模板模板模板-引物引物引物引物结结合物在合物在合物在合物在TaqDNATaqDNA聚合聚合聚合聚合酶酶的作用下，以的作用下，以的作用下，以的作用下，以dNTPdNTP为为反反反反应应原料，靶序列原料，靶序列原料，靶序列原料，靶序列为为模板，模板，模板，模板，按碱基配按碱基配按碱基配按碱基配对对原原原原则则，合成一条新的互，合成一条新的互，合成一条新的互，合成一条新的互补链补链 （70 70 左右）左右）左右）左右）1919.2020.PCR反反应五要素五要素n n引物、引物、酶、dNTP、模板和、模板和Mg2+n nPCR反反应的特异性决定因素：的特异性决定因素：引物与模板引物与模板DNA特异正确的特异正确的结合合 碱基配碱基配对原原则 Taq DNA聚合聚合酶合成反合成反应的忠的忠实性性 靶基因的特异性与保守性靶基因的特异性与保守性2121.PCR的的应用用1.研究研究研究研究基因克隆；基因克隆；基因克隆；基因克隆；DNADNA测测序；分析突序；分析突序；分析突序；分析突变变2.诊诊断断断断细细菌、病毒、寄生虫菌、病毒、寄生虫菌、病毒、寄生虫菌、病毒、寄生虫检测检测及及及及诊诊断断断断3.人人人人类类基因基因基因基因组组工程工程工程工程遗传图谱遗传图谱的构建；的构建；的构建；的构建；DNADNA测测序；表达序；表达序；表达序；表达图谱图谱4.法医法医法医法医犯罪犯罪犯罪犯罪现场标现场标本分析本分析本分析本分析5.肿肿瘤瘤瘤瘤各种各种各种各种肿肿瘤瘤瘤瘤检测检测6.其他其他其他其他2222.二、目的基因与表达载体的重组重重组载体的构建体的构建：对目的基因和目的基因和载体体DNA进行剪切、修行剪切、修饰，在，在连接接酶的作用下的作用下连接接形成完整有复制能力的重形成完整有复制能力的重组体。体。2323.（一）载体对于外源基因的表达，第二个问题就是选择合适的表达载体并将目的基因重组至表达载体上。表达载体主要包括：质粒载体、噬菌体或病毒载体。表达载体是目的基因在宿主细胞中遗传、转录、翻译以及可能的翻译后修饰加工的保障。2424.基因工程基因工程载体的基本条件体的基本条件1.能在宿主能在宿主细胞中复制繁殖胞中复制繁殖2.容易容易进入宿主入宿主细胞胞3.有合适的限制性核酸内切有合适的限制性核酸内切酶位点，容易位点，容易插入外来核酸片段，插入后不影响其插入外来核酸片段，插入后不影响其进入宿主入宿主细胞和在胞和在细胞中的复制胞中的复制4.有容易被有容易被识别筛选的的标志志5.容易从宿主容易从宿主细胞中分离胞中分离纯化出来化出来2525.基因工程基因工程载体分体分类根据根据根据根据载载体的分子生物学特性划分体的分子生物学特性划分体的分子生物学特性划分体的分子生物学特性划分1.1.质质粒型粒型粒型粒型载载体体体体环环状状状状dsDNAdsDNA分子，自主复制分子，自主复制分子，自主复制分子，自主复制2.2.病毒型病毒型病毒型病毒型载载体体体体环环状、状、状、状、线线状、状、状、状、ss-ss-和和和和ds-DNAds-DNA分子，形成病分子，形成病分子，形成病分子，形成病毒毒毒毒颗颗粒粒粒粒3.3.混合型混合型混合型混合型载载体体体体具具具具质质粒和病毒特性，特性的粒和病毒特性，特性的粒和病毒特性，特性的粒和病毒特性，特性的转换转换依依依依赖赖于于于于宿主宿主宿主宿主细细胞生物学特性胞生物学特性胞生物学特性胞生物学特性 根据根据根据根据载载体功能划分：体功能划分：体功能划分：体功能划分：1.1.克隆克隆克隆克隆载载体体体体质质粒、粒、粒、粒、噬菌体、粘性噬菌体、粘性噬菌体、粘性噬菌体、粘性质质粒、粒、粒、粒、M13M13噬菌体噬菌体噬菌体噬菌体2.2.表达表达表达表达载载体体体体大大大大肠肠杆菌表达杆菌表达杆菌表达杆菌表达载载体、哺乳体、哺乳体、哺乳体、哺乳动动物物物物细细胞表达胞表达胞表达胞表达载载体体体体2626.常用常用载体体质质粒粒粒粒(plasmid)(plasmid)独立于独立于独立于独立于细细菌染色体以外的菌染色体以外的菌染色体以外的菌染色体以外的遗传遗传物物物物质质，能，能，能，能够够自我复制的双自我复制的双自我复制的双自我复制的双链闭链闭合合合合环环状状状状DNADNA分子分子分子分子2727.质粒的特点粒的特点1.大多数大多数大多数大多数质质粒粒粒粒DNADNA是是是是是是是是环环状双状双状双状双链链的的的的DNADNA分子分子分子分子 2.复制复制复制复制类类型分型分型分型分为严紧为严紧型和松弛型型和松弛型型和松弛型型和松弛型3.有共价有共价有共价有共价闭闭合合合合环环形、开形、开形、开形、开环环和和和和线线性三种构型性三种构型性三种构型性三种构型4.泳泳泳泳动动速度：速度：速度：速度：SCDNA LDNA OCDNASCDNA LDNA OCDNA5.质质粒具有不相容性粒具有不相容性粒具有不相容性粒具有不相容性6.具有具有具有具有转转移移移移现现象和迁移作用象和迁移作用象和迁移作用象和迁移作用2828.pBR322质粒粒分子量分子量较小。小。两种抗菌素抗性基因两种抗菌素抗性基因 较高的拷高的拷贝数，且数，且经氯霉素霉素扩增之后增之后,每个每个细胞中可累胞中可累积10003000个拷个拷贝对多种常多种常见的限制性的限制性内切核酸内切核酸酶只含有一只含有一个能切割的位点个能切割的位点2929.pUC质粒粒多克隆位点；多克隆位点；松弛复制；松弛复制；氨氨苄青青酶素抗性；素抗性；可通可通过化学化学显色色筛选 3030.噬菌体噬菌体载体体特点特点特点特点双双双双链链DNADNA分子（分子（分子（分子（线线性或性或性或性或环环形）形）形）形）两端具有两端具有两端具有两端具有1212个个个个ntnt单链单链互互互互补补粘粘粘粘性末端性末端性末端性末端具非必需区（中具非必需区（中具非必需区（中具非必需区（中间间区区区区约约1/31/3长长度）度）度）度）可在可在可在可在E.ColiE.Coli中大量繁殖中大量繁殖中大量繁殖中大量繁殖可克隆可克隆可克隆可克隆15Kb15Kb左右的外源基因左右的外源基因左右的外源基因左右的外源基因3131.载载体体体体类类型型型型 （两种）（两种）（两种）（两种）插入型插入型插入型插入型载载体：外源体：外源体：外源体：外源DNADNA克隆到克隆到克隆到克隆到 分子上，使噬菌体的某种生分子上，使噬菌体的某种生分子上，使噬菌体的某种生分子上，使噬菌体的某种生物功能物功能物功能物功能丧丧失效力，即插入失活效失效力，即插入失活效失效力，即插入失活效失效力，即插入失活效应应 取代型取代型取代型取代型载载体（替体（替体（替体（替换换型型型型载载体）：提高了克隆外源体）：提高了克隆外源体）：提高了克隆外源体）：提高了克隆外源DNADNA的能力的能力的能力的能力3232.M13噬菌体噬菌体(M13 phage)1.只只只只感感感感染染染染有有有有F F性性性性菌菌菌菌毛毛毛毛的的的的大大大大肠肠杆菌噬菌体杆菌噬菌体杆菌噬菌体杆菌噬菌体2.基基基基 因因因因 组组 DNADNA全全全全 长长6.5kb6.5kb（单链单链）3.感感感感染染染染后后后后，可可可可复复复复制制制制成成成成双双双双链链DNADNA（RFRF，DNADNA）4.RFRF只只只只有有有有（+）链链复复复复制制制制，相当于相当于相当于相当于质质粒粒粒粒载载体体体体3333.M13噬菌体噬菌体载体体优点：点：既可以提供既可以提供单链DNA，也可以提供，也可以提供双双链的的DNA。缺点：插入大的缺点：插入大的DNA片段后表片段后表现不不稳定，定，在噬菌体增殖在噬菌体增殖过程中容易程中容易发生缺失。所以生缺失。所以一般克隆的片段在一般克隆的片段在1kb之内，克隆之内，克隆300-400bp的片段十分的片段十分稳定。定。3434.粘尾粘尾质粒粒(cosmid)1.1.由由由由 DNADNA的两端粘性末端区域的两端粘性末端区域的两端粘性末端区域的两端粘性末端区域(COS(COS区区区区)与与与与质质粒构建的粒构建的粒构建的粒构建的环环状双状双状双状双链链DNADNA2.2.特点特点特点特点:含含含含质质粒的抗性粒的抗性粒的抗性粒的抗性标记标记如如如如AmpAmp ，TetTet 带带COSCOS区，可区，可区，可区，可进进行体外包装行体外包装行体外包装行体外包装一个或多个一个或多个一个或多个一个或多个酶酶切位点切位点切位点切位点加入特异性启加入特异性启加入特异性启加入特异性启动动子利于双向子利于双向子利于双向子利于双向转录转录分子量小，容量大分子量小，容量大分子量小，容量大分子量小，容量大 /筛选筛选APAP平板平板平板平板粘性粘性粘性粘性 DNADNA质质粒接上能在真核粒接上能在真核粒接上能在真核粒接上能在真核细细胞生活的元件胞生活的元件胞生活的元件胞生活的元件则则能能能能在真核中在真核中在真核中在真核中转转染及染及染及染及筛选筛选3535.3636.大容量大容量载体体细菌人工染色体菌人工染色体(BACs):E.coli F质粒，供粒，供体体DNA300kb,用于大基因用于大基因组分析分析P1人工染色体人工染色体(PACs)：噬菌体噬菌体P1，需要体，需要体外包装盒外包装盒转导，供体，供体DNA约100kb,用于大用于大基因基因组分析分析酵母人工染色体酵母人工染色体(YACs)：酿酒酵母着酒酵母着丝粒、粒、端粒和自主复制序列，供体端粒和自主复制序列，供体DNA2000kb,用于大基因用于大基因组分析和分析和YAC转基因基因动物物3737.质粒的构建策略粒的构建策略质粒粒载体必需的三个部分体必需的三个部分1.复制区：含有复制起点；复制区：含有复制起点；2.选择标记：抗性基因；：抗性基因；3.克隆位点：便于外源克隆位点：便于外源DNA的的插入插入 3838.质粒的构建策略粒的构建策略1.缩短短载体体长度，度，扩充充载体容体容纳能力能力2.合理增加合理增加酶切位点数目，形成多克隆位切位点数目，形成多克隆位点点3.引入多用途引入多用途辅助序列，提供助序列，提供质粒新特粒新特4.设计具有特殊具有特殊选择标记，最好是能，最好是能够赋予宿主易于予宿主易于检测的表型的表型3939.穿梭穿梭载体体(shuttle vector)能在两种不同的生物中复制的能在两种不同的生物中复制的能在两种不同的生物中复制的能在两种不同的生物中复制的载载体体体体 1.具有具有具有具有细细菌菌菌菌质质粒的复制原点及粒的复制原点及粒的复制原点及粒的复制原点及选择标记选择标记基因基因基因基因2.有真核生物的自主复制序列有真核生物的自主复制序列有真核生物的自主复制序列有真核生物的自主复制序列(ARS)(ARS)以及以及以及以及选择标选择标记记性状性状性状性状3.具有多克隆位点具有多克隆位点具有多克隆位点具有多克隆位点4.在在在在细细菌中用于菌中用于菌中用于菌中用于扩扩增克隆的基因增克隆的基因增克隆的基因增克隆的基因5.在真核生物中用于基因表达分析在真核生物中用于基因表达分析在真核生物中用于基因表达分析在真核生物中用于基因表达分析 4040.穿梭穿梭载体体(shuttle vector)4141.表达表达载体体（Expression vectors）4242.4343.真核真核细胞胞载体体n n哺乳哺乳动物物细胞的病毒胞的病毒载体体1.含有原核基因序列即：复制子和抗性基因含有原核基因序列即：复制子和抗性基因含有原核基因序列即：复制子和抗性基因含有原核基因序列即：复制子和抗性基因2.含有哺乳含有哺乳含有哺乳含有哺乳动动物物物物细细胞启胞启胞启胞启动动子和增子和增子和增子和增强强元件使外源基元件使外源基元件使外源基元件使外源基因有效因有效因有效因有效转录转录3.转录终转录终止信号和止信号和止信号和止信号和poly(A)poly(A)信号信号信号信号4.含有可含有可含有可含有可选择选择的剪切信号的剪切信号的剪切信号的剪切信号5.含有一个以上的限制性含有一个以上的限制性含有一个以上的限制性含有一个以上的限制性酶酶切位点切位点切位点切位点4444.真核真核细胞胞载体体n n酵母酵母载体体组组成成成成遗传标记遗传标记；调调控序列（控序列（控序列（控序列（ARSARS、环环状状状状质质粒粒粒粒DNADNA、启、启、启、启动动子）；由子）；由子）；由子）；由质质粒粒粒粒DNADNA与酵母与酵母与酵母与酵母DNADNA重重重重组组的穿梭的穿梭的穿梭的穿梭质质粒粒粒粒n n杆状病毒杆状病毒载体体昆虫昆虫细胞多角病毒胞多角病毒载体体具有蛋白修具有蛋白修具有蛋白修具有蛋白修饰饰、加工和、加工和、加工和、加工和转转运体系运体系运体系运体系产产物可溶性表达物可溶性表达物可溶性表达物可溶性表达适于克隆大片外源适于克隆大片外源适于克隆大片外源适于克隆大片外源DNADNA不侵染脊椎不侵染脊椎不侵染脊椎不侵染脊椎动动物物物物4545.（二）重组体外重组技术的建立是建立在一系列可以在体外应用的DNA限制性内切酶和DNA连接酶，以及PCR技术的推广。目的基因和载体DNA分子的体外重组关键在于：选择合适的重组位点、剪切位点；以及剪切后适当的条件将目的基因和载体DNA分子连接获得重组分子。4646.酶酶功功功功 能能能能限制性核酸内限制性核酸内限制性核酸内限制性核酸内切切切切酶酶识别识别特异序列，切割特异序列，切割特异序列，切割特异序列，切割DNADNADNADNA连连接接接接酶酶使使使使DNADNA切口封合或使两个切口封合或使两个切口封合或使两个切口封合或使两个DNADNA分子或片段分子或片段分子或片段分子或片段连连接接接接DNADNA聚合聚合聚合聚合酶酶 1 1）合成双）合成双）合成双）合成双链链cDNAcDNA的第二条的第二条的第二条的第二条链链；2 2）缺口平移）缺口平移）缺口平移）缺口平移制作高比活探制作高比活探制作高比活探制作高比活探针针 3 3）DNADNA序列分析序列分析序列分析序列分析 4 4）填）填）填）填补补33末端末端末端末端反反反反转录酶转录酶1 1）合成）合成）合成）合成cDNA 2cDNA 2）替代）替代）替代）替代DNADNA聚合聚合聚合聚合酶酶I I进进行填行填行填行填补补、标记标记或或或或DNADNA序列分析序列分析序列分析序列分析多聚核苷酸激多聚核苷酸激多聚核苷酸激多聚核苷酸激酶酶催化多聚核苷酸催化多聚核苷酸催化多聚核苷酸催化多聚核苷酸55羟羟基末端磷酸化、或基末端磷酸化、或基末端磷酸化、或基末端磷酸化、或标记标记探探探探针针末端末端末端末端转转移移移移酶酶在在在在33羟羟基末端基末端基末端基末端进进行同行同行同行同质质多聚物加尾多聚物加尾多聚物加尾多聚物加尾碱性磷酸碱性磷酸碱性磷酸碱性磷酸酶酶切除末端磷酸基切除末端磷酸基切除末端磷酸基切除末端磷酸基基因工程相关基因工程相关酶学学4747.限制性核酸内切限制性核酸内切酶 具有具有具有具有识别识别双双双双链链DNADNA分子中的某种特定核苷酸序列，分子中的某种特定核苷酸序列，分子中的某种特定核苷酸序列，分子中的某种特定核苷酸序列，并由此切割并由此切割并由此切割并由此切割DNADNA双双双双链结链结构的核酸内切构的核酸内切构的核酸内切构的核酸内切酶酶 型：修型：修型：修型：修饰酶饰酶活性和依活性和依活性和依活性和依赖赖于于于于ATPATP的限制性内切的限制性内切的限制性内切的限制性内切酶酶活性活性活性活性 型：型：型：型：内切内切内切内切酶酶活性和修活性和修活性和修活性和修饰酶饰酶活性，活性，活性，活性，专专一性一性一性一性强强。既具有切割。既具有切割。既具有切割。既具有切割位点的位点的位点的位点的专专一性一性一性一性,也具有也具有也具有也具有识别识别位点的位点的位点的位点的专专一性一性一性一性,一般在一般在一般在一般在识别识别序列内切割序列内切割序列内切割序列内切割 型：作用方式同型：作用方式同型：作用方式同型：作用方式同型型型型4848.命名方式命名方式4949.型限制性核酸内切型限制性核酸内切酶1.1.基本特性基本特性基本特性基本特性识别识别ds-DNAds-DNA中含中含中含中含-8-8个相个相个相个相连连的碱基的碱基的碱基的碱基对组对组成成成成的特定回文序列的特定回文序列的特定回文序列的特定回文序列断裂后形成的断裂后形成的断裂后形成的断裂后形成的DNADNA片片片片段具有互段具有互段具有互段具有互补补碱基的碱基的碱基的碱基的单单链链延伸末端（粘性末延伸末端（粘性末延伸末端（粘性末延伸末端（粘性末端）或平末端端）或平末端端）或平末端端）或平末端5050.5 C T G C A G 33 G A C G T C 55 G G A T C C 33 C C T A G G 55 G A T C 33 C T A G 55 G G 3 C CC C 3G G 55 G G C C 33 C C G G 5HaeMboBamHPst5 3 C T A G 55 G A T C 3 55 G3 C C T A G 55 G A T C C 3G 55 C T G C A 33 GG 33 A C G T C 5II型限制性内切核酸型限制性内切核酸酶5151.几种几种II型限制性核酸内切型限制性核酸内切酶的的酶切位点切位点5252.2.同裂同裂酶(isoschizomer)来源不同来源不同,识别和切割位点相同和切割位点相同3.3.同尾同尾同尾同尾酶酶(isoaudamersisoaudamers)来源、来源、来源、来源、识别识别序列和切割方式均不相同，序列和切割方式均不相同，序列和切割方式均不相同，序列和切割方式均不相同，但但但但产产生的限制性片段却是相同的粘性末端生的限制性片段却是相同的粘性末端生的限制性片段却是相同的粘性末端生的限制性片段却是相同的粘性末端5353.4.4.限制性内切限制性内切限制性内切限制性内切酶对酶对DNADNA的消化作用及其片段化的消化作用及其片段化的消化作用及其片段化的消化作用及其片段化消化作用消化作用消化作用消化作用以同型二聚体形式与靶以同型二聚体形式与靶以同型二聚体形式与靶以同型二聚体形式与靶DNADNA序列作用，所序列作用，所序列作用，所序列作用，所识别识别的靶序列大小决定着的靶序列大小决定着的靶序列大小决定着的靶序列大小决定着DNADNA片段的大小片段的大小片段的大小片段的大小片段化片段化片段化片段化:单酶单酶切、双切、双切、双切、双酶酶切、一部分切、一部分切、一部分切、一部分酶酶切切切切5.5.具有粘性末端具有粘性末端具有粘性末端具有粘性末端DNADNA片段的片段的片段的片段的连连接接接接不同的不同的不同的不同的DNADNA片段通片段通片段通片段通过过互互互互补补的粘性末端配的粘性末端配的粘性末端配的粘性末端配对连对连接接接接分子分子分子分子间连间连接接接接同一片段的两个互同一片段的两个互同一片段的两个互同一片段的两个互补补末端之末端之末端之末端之间间碱基配碱基配碱基配碱基配对对形成形成形成形成环环形分子形分子形分子形分子内内内内连连接接接接5454.载体与目的片段体与目的片段连接接5555.5656.6.6.影响限制性内切影响限制性内切影响限制性内切影响限制性内切酶酶活性活性活性活性的因素的因素的因素的因素DNADNA的的的的纯纯度度度度DNADNA甲基化程度甲基化程度甲基化程度甲基化程度底物底物底物底物DNADNA的分子构型的分子构型的分子构型的分子构型反反反反应应温度温度温度温度反反反反应应系系系系统组统组成成成成酶酶量、反量、反量、反量、反应应体体体体积积、酶酶切切切切时间时间7.7.限制限制限制限制酶酶的用途的用途的用途的用途 DNADNA重重重重组组与构建新基与构建新基与构建新基与构建新基因因因因组组文文文文库库组组建建建建DNADNA物理物理物理物理图谱图谱DNA DNA 分子分子分子分子杂杂交交交交制制制制备备DNADNA放射性探放射性探放射性探放射性探针针DNADNA序列分析序列分析序列分析序列分析5757.DNA连接接酶 封封封封闭闭DNADNA链链上缺口上缺口上缺口上缺口酶酶，借助能量催化，借助能量催化，借助能量催化，借助能量催化DNADNA链链的的的的5 5-POPO4 4与另一与另一与另一与另一DNADNA链链的的的的3 3-OH-OH生成磷酸二生成磷酸二生成磷酸二生成磷酸二酯键酯键。用于用于用于用于DNADNA重重重重组组和和和和质质粒的构建粒的构建粒的构建粒的构建 1.大大大大肠肠杆菌杆菌杆菌杆菌DNADNA连连接接接接酶酶：只能只能只能只能连连接具粘性末端接具粘性末端接具粘性末端接具粘性末端DNADNA分分分分子，以子，以子，以子，以NADNAD作作作作辅辅助因子助因子助因子助因子2.T4 DNAT4 DNA连连接接接接酶酶：连连接粘性末端，高接粘性末端，高接粘性末端，高接粘性末端，高浓浓度可度可度可度可连连接平末接平末接平末接平末端，要求端，要求端，要求端，要求3 3-OH-OH和和和和5 5-PO4-PO4。催化。催化。催化。催化过过程需要程需要程需要程需要ATPATP和和和和MgMg5858.聚合聚合酶以以以以DNA(RNA)DNA(RNA)为为模板，催化模板，催化模板，催化模板，催化DNA(RNA)DNA(RNA)的体外合成的体外合成的体外合成的体外合成特点：特点：特点：特点：以脱氧核苷酸三磷酸以脱氧核苷酸三磷酸以脱氧核苷酸三磷酸以脱氧核苷酸三磷酸(dNTP)(dNTP)为为前体催化合成前体催化合成前体催化合成前体催化合成DNADNA需要模板和引物的存在需要模板和引物的存在需要模板和引物的存在需要模板和引物的存在不能起始合成新的不能起始合成新的不能起始合成新的不能起始合成新的DNADNA链链催化催化催化催化dNTPdNTP加到生加到生加到生加到生长长中的中的中的中的DNADNA链链的的的的3-OH3-OH末端末端末端末端催化催化催化催化DNADNA合成的方向是合成的方向是合成的方向是合成的方向是53 53 5959.聚合聚合酶的分的分类及特点及特点1.大大大大肠肠杆菌杆菌杆菌杆菌DNADNA聚合聚合聚合聚合酶酶：5 5 33 的聚合作用的聚合作用的聚合作用的聚合作用3 3 5 5 的外切的外切的外切的外切酶酶活性活性活性活性5 5 33 外切外切外切外切酶酶活性活性活性活性2.Klenow Klenow 聚合聚合聚合聚合酶酶：5 5 33 聚合聚合聚合聚合酶酶活性活性活性活性3 3 5 5 外切外切外切外切酶酶活性活性活性活性1.没有没有没有没有5 5 33 外切外切外切外切酶酶活性活性活性活性用于填用于填用于填用于填补补DNADNA单链单链末端成末端成末端成末端成为为双双双双链链 6060.聚合聚合酶的分的分类及特点及特点3.T4-DNAT4-DNA聚合聚合聚合聚合酶酶 ：无：无：无：无5 5 33 外切外切外切外切酶酶活性活性活性活性 、需要一、需要一、需要一、需要一条有引物的条有引物的条有引物的条有引物的单链单链DNADNA作模板作模板作模板作模板 、3 3 5 5 外切外切外切外切酶酶活活活活性性性性4.Taq DNA Taq DNA 聚合聚合聚合聚合酶酶：5 5 33 聚合聚合聚合聚合酶酶活性活性活性活性 5 5 33 外切外切外切外切酶酶活性，有活性，有活性，有活性，有链链置置置置换换合成能力合成能力合成能力合成能力不具有不具有不具有不具有3 3 5 5 外切外切外切外切酶酶活性，没有校正功能活性，没有校正功能活性，没有校正功能活性，没有校正功能良好的良好的良好的良好的热稳热稳定性定性定性定性用于用于用于用于DNADNA序列分析和序列分析和序列分析和序列分析和PCRPCR反反反反应应6161.逆逆转录酶（reversetranscriptase）两两两两类类：禽：禽：禽：禽类类成骨成骨成骨成骨细细胞性白血病病毒逆胞性白血病病毒逆胞性白血病病毒逆胞性白血病病毒逆转录酶转录酶(AMV)(AMV)moloney moloney小鼠白血病病毒逆小鼠白血病病毒逆小鼠白血病病毒逆小鼠白血病病毒逆转录酶转录酶(MMLV)(MMLV)作用：作用：作用：作用：1.以以以以RNARNA为为模板合成模板合成模板合成模板合成DNA,DNA,构建构建构建构建cDNAcDNA文文文文库库 2.RT-PCRRT-PCR3.制制制制备杂备杂交探交探交探交探针针以以以以RNARNA为为模板合成模板合成模板合成模板合成DNADNA的的的的酶酶(RNA(RNA指指指指导导的的的的DNADNA聚合聚合聚合聚合酶酶)6262.1.碱性磷酸碱性磷酸碱性磷酸碱性磷酸酶酶（alkaline phosphatasealkaline phosphatase）：）：）：）：去除去除去除去除DNA/RNA 5DNA/RNA 5-P-P，制，制，制，制备载备载体体体体时时可防止可防止可防止可防止载载体自身体自身体自身体自身连连接，接，接，接，提高重提高重提高重提高重组组效率效率效率效率2.末端脱氧核苷末端脱氧核苷末端脱氧核苷末端脱氧核苷酰转酰转移移移移酶酶：在在在在DNADNA的的的的3 3-OH-OH上，加上上，加上上，加上上，加上 dNTPdNTPDNA和和RNA的修的修饰酶6363.载体体DNA与目的基因的与目的基因的连接接1.1.1.1.粘性末端粘性末端粘性末端粘性末端连连接接接接2.2.2.2.平末端平末端平末端平末端连连接接接接3.3.3.3.同聚物接尾同聚物接尾同聚物接尾同聚物接尾连连接接接接4.4.4.4.接接接接头连头连接法接法接法接法6464.宿主系宿主系统用于基因转移的受体菌或细胞 受体细胞应具备的条件 各种基因工程受体的特性 实验室常用的基因工程受体6565.受体细胞应具备的条件限制性缺陷型 外切酶和内切酶活性缺陷（recB-，recC-，hsdR-）重组整合缺陷型 用于基因扩增或高效表达的受体细胞（recA-）具有较高的转化效率具有与载体选择标记互补的表型感染寄生缺陷型 防止重组细菌扩散污染，生物武器除6666.对于表达用宿主细胞还应该有：有较好的翻译后加工机制 蛋白水解酶基因缺陷或表达水平低，以减少外源蛋白的降解实现高效表达6767.各种基因工程受体的特性大肠杆菌遗传背景清楚，载体受体系统完备，生长迅速，培养简单，重组子产结构复杂、种类繁多的内毒素适用于外源DNA的扩增和克隆、原核生物基因的高效表达、基因文库的构建，是DNA重组实验和基因工程的主要受体菌6868.各种基因工程受体的特性枯草杆菌遗传背景清楚，蛋白质分泌机制健全，生长迅速，培养