松瘤小蠹线粒体基因组测序及分析.pdf

194-199引文格式：李兴艳，梁文凯，泽桑梓松瘤小蠹线粒体基因组测序及分析 J.西南林业大学学报（自然科学），2 0 2 4,44(1)：Jan.2024JOURNAL OF SOUTHWEST FORESTRY UNIVERSITY2024年1月Vol.44No.1南西第44卷报业第1期大学学林D0I:10.11929/j.swfu.202206033松瘤小蠹线粒体基因组测序及分析李兴艳梁文凯泽桑梓2 赵宁1朱家颖1.3（1.西南林业大学云南省森林灾害预警与控制重点实验室，云南昆明6 50 2 33；2.云南省林业和草原有害生物防治检疫局，云南昆明650051；3.西南林业大学西南山地资源保育与利用教育部重点实验室，云南昆明6 50 2 33）摘要：松瘤小囊广泛分布于欧亚大陆多国以及我国危害松科植物，但尚缺乏其分子鉴定和种群遗传结构方面的研究。鉴于此，本研究基于高通量测序技术测定了该害虫的线粒体基因组序列，使用GetOrganelle 软件组装得到了其完整线粒体基因组。结果表明：松瘤小囊的线粒体基因组长17 451bp，包含13个蛋白编码基因，2 2 个tRNA和2 个rRNA，A、T、C、G 所占的比例分别为37.4%、33.45%、18.40%和10.7 5%。基于松瘤小囊以及其他象甲科物种线粒体基因组序列构建系统发育树分析发现，松瘤小囊与边瘤小囊的亲缘关系较近，处于同一分支上，与传统的形态学分类相一致。该研究结果为今后筛选线粒体分子标记来开展松瘤小囊分子鉴定和种群遗传结构研究奠定了基础。关键词：松瘤小囊；象甲科；线粒体基因组；系统发育中图分类号：S476文献标志码：A文章编号：2 0 95-1914(2 0 2 4)0 1-0 194-0 6Sequencing and Analysis of the Mitochondrial Genome ofOrthotomicus erosusLi Xingyan,Liang Wenkai,Ze Sangzi2,Zhao Ning,Zhu Jiaying1,3(1.Key Laboratory of Forest Disaster Warning and Control of Yunnan Province,Southwest Forestry University,Kunming Yunnan 650233,China;2.Bureau of Forestry and Grassland Pest Control and Quarantine of Yunnan Province,Kunming Yunnan 650051,China;3.Key Laboratory ofMinistry of Education for Forest Resources Conservation and Utilization in the Southwest Mountains of China Southwest Forestry University,Kunming Yunnan 650233,China)Abstract:Orthotomicus erosus(Coleoptera:Curculionidae)is widely distributed in Eurasia and China.It is apest that damages pine trees.But the studies on the molecular identification and population genetic structure ofthis pest are still lacking.In view of this,the genomic sequences of this pest were sequenced with high-through-put sequencing technology,which leads to assemble its complete mitochondrial genome using GetOrganelle soft-ware.The results confirm that its mitogenome is 17 451 bp in length,containing 13 protein-coding genes,22tRNA and 2 rRNA genes.Nucleotide compositions of its whole mitogenome are 37.4%for A,33.45%for T,18.4%for C,and 10.75%for G.Phylogenetic tree analysis using the sequences of the mitochondrial genomes ofO.erosus and other Curculionidae species showed that O.erosus is closely related to O.laricis.These 2 speciesare grouped on the same branch,which is in accordance with the traditional morphological classification.The res-ults of this study lay a foundation for screening molecular markers of mitochondrion for molecular identificationand genetic structure research in O.erosus.Key words:Orthotomicus erosus;Curculionidae;mitogenome;phylogeny收稿日期：2 0 2 2-0 6-16；修回日期：2 0 2 2-10-2 1基金项目：云南省高层次人才培养支持计划“青年拔尖人才”专项（YNWR-QNBJ-2018-393）资助。第1作者：李兴艳（1997），女，硕士研究生。研究方向：有害生物综合防控。Email:。通信作者：朱家颖（198 4一），男，博士，教授，博士生导师。研究方向：害虫生物防治。Email:。195第1期李兴艳等：松瘤小蠹线粒体基因组测序及分析松瘤小蠹（Orthotomicuserosus）隶属于鞘翅目（Coleoptera）象甲科（Curculionidae）小蠹亚科（Scolytinae）瘤小蠹属（Orthotomicus），主要危害地中海白松（Pinus halepensis）、马尾松（P.massoniana）、油松（P.tabulaeformis）、云南松（P.y u n n a n e n s i s）、思茅松（P.kesiya）等松科（Pi n a c e a e）植物)。该害虫原产于地中海地区的国家，广泛分布于欧亚大陆等的2 3个国家-3。在我国，松瘤小蠹广泛分布在云南、福建、广西、陕西、江西、河南、江苏、山东、湖南、四川、重庆、广东、浙江、贵州、安徽、青海等15个省1个直辖市，对我国林业生产造成了严重影响 1.4。其中，云南作为松瘤小蠹的主要危害区域，分布在西双版纳、思茅、丽江、景谷、镇沅、江城、玉溪等地。此外，松瘤小蠹以幼虫和成虫隐藏在树皮及树干内部危害而难以发现，且外形特征上较难与其他小蠹类蛀干害虫尤其是瘤小蠹属害虫区分 2.5。利用分子标记技术有助于快速鉴定和区分不同的瘤小蠹属害虫，但就目前国内记载的5种瘤小蠹属物种而言，据作者所知仅边瘤小蠹（O.laricis）有完整的线粒体基因组序列以及近瘤小蠹（O.suturalis）和北方瘤小蠹（O.g o l o v j a n k o i）有coxl和cox2基因的部分序列有报道。同时，目前尚缺乏有关松瘤小蠹分子鉴定和种群遗传结构方面的研究，也缺乏对该害虫与其他象甲科物种亲缘关系的了解。昆虫线粒体基因组因具有较低的分子质量，结构较为简单、能够母系遗传等属性 6-7 ，来源于线粒体的分子标记被广泛应用于昆虫的分子鉴定和种系遗传研究 8 。本研究测定并分析了松瘤小线粒体基因组，在研究其线粒体基因组特点的同时，基于测定的线粒体基因组探讨了其在象甲科中的分类地位以及与其他瘤小蠹属物种间的亲缘关系。研究结果对后续开展松瘤小蠹的分子鉴定、分子生态学、种群遗传学以及象甲科的分子系统发育研究具有重要意义。1材料与方法1.1供试昆虫2020年夏季，于云南省玉溪市峨山县玉白顶自然保护区，从被松瘤小蠹危害的云南松树干中采集其成虫。样本浸泡在无水乙醇中，带回实验室后-8 0 条件下保存备用。1.2线粒体基因组组装取40 头松瘤小成虫，用酒精清洗干净，使用DneasyBlood&TissueKit试剂盒提取其基因组DNA，并采用分光光度计和1%琼脂糖凝胶电泳检测其纯度和质量。将检测合格的基因组DNA送至北京诺禾致源科技股份有限公司（天津），采用Novaseq6000进行高通量测序。测序原始数据经过质控得到cleandata后，利用软件GetOr-ganellev1.6.4（参数：-F animal_mt-R15-k127)对松瘤小蠹线粒体基因进行组装 91.3线粒体基因组注释及分析松瘤小蠹线粒体基因组中的蛋白质编码基因（PCG）、核糖体RNA（r R NA）以及转运RNA（t R NA）均使用MITOS WebServer（h t t p:/mi t o s 2.bioinf.uni-leipzig.de/index.py）在线软件进行注释 10 ,同时参考已报道的近缘种边瘤小蠹和十二齿小蠹（Ip s s e x d e n t a t u s）的线粒体基因组对注释结果进行校正。线粒体基因组碱基组成偏向性的计算方法l见式（1）（2）。利用Proksee（h t t p s:/p r o k s e e.ca/projects/new）对松瘤小蠹的线粒体基因组结构进行绘制。AT-skeW=(A-T)/(A+T)(1)GC-skew=(G-C)/(G+C)（(2)式中：A为完整的线粒体基因组中腺嘌呤的个数；T为完整的线粒体基因组中胸腺嘧啶的个数；C为完整的线粒体基因组中胞嘧啶的个数；G为完整的线粒体基因组中鸟嘌呤的个数。1.4系统发育分析从NCBI的GeneBank中下载隶属于象甲科的小蠹亚科（Scolytinae）、孢喙象亚科（Cyclom-inae）、魔喙象亚科（Molytinae）、象虫亚科（Cur-culioninae）、隐喙象亚科（Cryptorhynchinae）、粗喙象亚科（Entiminae）、隐额象亚科（Dryoph-thorinae）等7 亚科的2 2 个物种的线粒体基因组全序列，选取金龟科（Scarabaeidae）的白星花金龟（Pr o t a e t ia b r e v it a r s is）和拟步甲科（Tenebrioni-dae）的赤拟谷盗（Triboliumcastaneum）作为外群，使用MEGA10.1.812中的MUSCLE对这些物种以及松瘤小蠹的线粒体基因组进行多序列比对，在MEGA中利用最大似然法中的p-distance模型和1000次自举运算次数进行系统发育树的构建。2结果与分析2.1线粒体基因组结构基于二代高通量测序数据，组装得到的松瘤小蠹线粒体基因组长度为17 451bp（登录号：ON720305）。从松瘤小蠹的线粒体基因组中鉴定196西南林业大学学报第44卷到2 个rRNA、2 2 个tRNA和13个蛋白编码基因（图1）。松瘤小蠹线粒体基因组编码基因的37个基因排列次序见表1，它们之间的间隔共27处，共计2 7 7 0 bp。其中，间隔最长的一处位于rrnS和trnl之间，长度为1416 bp；重叠区共5处，共计6 6 bp。WunMunCDSnad2tRNAOunTRNAtrnTULI16kbp2kbptrnL2SUL14kbpCOx24kbp-trnKtrnLtrnDatp6-12kbp6kbptrnS2Cox310kbp8kbptrnGnad4nadstrnAtrnn宜nHtrnE图1松瘤小蠹线粒体基因组结构Fig.1Structure of the mitochondrial genome ofO.erosus2.2线粒体基因组碱基组成松瘤小蠹线粒体基因组中的A、T、C、G 的组成分别为37.4%、33.45%、18.4%和10.7 5%，其中A的含量最高，而G的含量最低。A+T的含量为7 0.8 5%，明显高于G+C的含量，呈现明显的AT碱基偏向性，且AT的偏度为0.0 6，GC的偏度为-0.2 6，表明整个基因组更偏好于A碱基和C碱基的使用2.3蛋白质编码基因、tRNA和rRNA基因分析松瘤小蠹线粒体基因组中的蛋白编码基因序列有10 7 19bp，占基因组的6 1.42%。所有蛋白编码基因均使用通用密码子ATN作为起始密码子（表1）。其中，coxl、a t p 8、n a d 6 等3个基因以ATA为起始密码子，nad2、n a d 3、n a d 5、n a d l等4个基因以ATT为起始密码子，cOx2、Co x 3、atp6、n a d 4、n a d 4l、c o b 等6 个基因以ATG作为起始密码子。它们的终止密码子为典型的线粒体终止密码子TGA和TAA。松瘤小蠹线粒体基因组中的tRNA长度在657 1b p（表1）。其中，trnK的长度最长，为71bp；t r n N的长度最短，为6 5bp。2 个rRNA基因分别为rrnL和rrnS，被trnV分割开（表1）。rrnL的长度为136 1bp，A+T 的含量为7 7.0 5%；rrnS的长度为7 8 6 bp，A+T 的含量为7 3.6 6%2.4系统发育分析系统发育分析表明，小蠹亚科与象虫亚科、魔喙象亚科、隐喙象亚科的节点支持率为10 0，同时这4个亚科聚为同一支又与孢喙象亚科、粗喙象亚科聚在一起，且节点支持率为98，表明象甲科内各亚科之间能有效区分。从系统发育树图中可以看出，松瘤小蠹与边瘤小蠹、十二齿小蠹等隶属于小蠹亚科的物种聚在一支，且与边瘤小蠹互为姐妹分支，节点支持率为10 0（图2）。松瘤小蠹和边瘤小蠹与十二齿小蠹构成姐妹群，节点支持率为10 0。表1松瘤小蠹线粒体基因组注释结果Table1Annotation results of the mitochondrial genome of O.erosus基因起始位置/bp结束位置/bp长度/bp编码链起始密码子终止密码子反密码子基因间的间隔/bptrng31938870TTG45trnM43450168+CAT18nad25201509894+ATTTAA19trnW1529159668+TCA19trnc1616168166一GCA30trnY1712177766GTA46一cox/182433681521+ATATAA-5trnL23364343067+TAA-45co.x233864114639+ATATAA7trnK4122419271+CTT12trnD4205427268+GTC9atp842824443168+ATATAG-7atp644375120672+ATGTAA4197第1期李兴艳等：松瘤小蠹线粒体基因组测序及分析续表1基因起始位置/bp结束位置/bp长度/bp编码链起始密码子终止密码子反密码子基因间的间隔/bpcox351255919792+ATGTAA37trnG5957602266+TCC0nad360236376333+ATTTAG42trnA6424649168+TGC10trnR6502656766+TCG73trnN6641670565+GTT0trnsI6706677267+TCT0trnE6773683967+TTC24trnF6932686469GAA0nad5864269331635ATTTAA15trnH8.722865865一GTG62nad41013187851275一ATGTAA-7nad4l1041210125291一ATGTAG17trnT104301049667+TGT0trnP105641049768一TGG17nad61058211088501+ATATAA8cob11097122361095+ATGTAA24trnS2122611232868+TGA18nad113 27312347903ATTTAA18trnL11335913 29268TAG38rrnL14.70013398136136trnV148011473765TAC-2rrns15585148007861416trnl170021706867+GAT70148NC_036293.1Anisandrusdispar72NC_036295.1Cyclorhipidion bodoanus100100NC_036280.1 Xylosandrus germanusNC_036283.1Xylosandrus morigerus100-NC_036284.1Xylosandruscrassiusculus89NC_036287.1Dryocoetesautographus100NC_036281.1IpssexdentatusScolytinae100ON720305 Orthotomicus erosus98-NC_036291.1Orthotomicus laricis100-NC 036294.1 Gnathotrichus materiarius9489NC_036288.1Pityophthorus pubescens-NC_036285.1Trypophloeusasperatus100-NC_036286.1 Trypodendron domesticum100100-NC_036292.1Trypodendron signatum100-NC_036290.1HylastesattenuatusNC_036262.1Hylastes brunneus98100-NC_026719.1 Eucryptorrhynchus chinensisICryptorhynchinae47-NC_034293.1CurculiodavidiICurculioninaeNC_022680.1HylobitelusxiaoiIMolytinae100-NC_027577.1Aegorhinus superciliosusICyclominae-NC_018354.1Naupactus xanthographusIEntiminae98KT428893.1 Rhynchophorus ferrugineusIDryophthorinae100AJ312413.2 Tribolium castaneumITenebrionidaeNC023453.1ProtaetiabrevitarsisScarabaeidae1.0小鑫亚科：Anisandrusdispar，Cy c l o r h i p i d i o n b o d o a n u s，光滑足距小蠹（Xylosandrusgermanus），X.mo r i g e r u s，北方材小（Xcrassiusculus），肾点毛小蠹（Dryocoetes autographu），十二齿小蠹（Ips sexdentatus），松瘤小蠹（Orthotomicus erosus），边瘤小（O.l a r i c i s），缝锤小蠹（Gnathotrichus materiarius），细小（Pityophthorus pubescens），T r y p o p h l o e u s a s p e r a t u s，家木小（T r y p o d e n d r o n d o me s t i c u m），条木小（T.signatum），H y l a s t e s a t t e n u a t u s，H.b r u n n e u s；隐喙象亚科：沟眶象（Eucryptor-rhynchus chinensis）；象虫亚科：栗实象甲（Curculiodavidi）；魔喙象亚科：萧氏松茎象（Hylobitelusxiaoi）；孢喙象亚科：覆盆子象甲（Aegorhinus superciliosus）；粗喙象亚科：南美果树象甲（Naupactus xanthographus）；隐顿象亚科：红棕象甲（Rhyncho-phorusferrugineus）；金龟科：白星花金龟（Protaetia brevitarsis）；拟步甲科：赤拟谷盗（Triboliumcastaneum）。图2 松瘤小囊与其他象甲科物种的系统发育关系Fig.2 Phylogenetic relationship of O.erosus and other species belonging to Curculionidae198西南林业大学学报第44卷3结论与讨论测定的松瘤小蠹的线粒体基因组大小，介于已知的鞘翅目线粒体基因组大小之间 13-15。AT-skew、G C-s k e w 和A+T含量通常被用来评估线粒体基因组的核苷酸组成上的差异 16 。通过分析松瘤小蠹的线粒体基因组碱基组成，发现不论是其碱基组成还是rRNA基因都具有典型的A+T偏向性，这种偏向性产生的原因可能是在基因复制以及转录时受到的选择压力和突变方向不一致所导致 17-18 。通过对松瘤小全基因组的AT偏斜和GC偏斜的计算，A和C基因是较多的，而这符合一般的后生动物在碱基组成上偏向A和C碱基的规律 16 。对松瘤小蠹的线粒体基因组进行注释，发现 rrnS和 trnl基因之间存在一段1416bp的较长间隔，类似情况在其他鞘翅目物种的线粒体基因组中也存在。例如，花斑皮蠹（T r o g o d e r m a v a r i a b i l e）线粒体基因组trnH和nad5基因之间有段长为345bp的间隔19，窗萤（Pyro-coelia rufa）线粒体基因组的nad2和trnW基因之间存在长度为17 2 4bp的间隔区 14，但产生这些间隔区的原因也尚待揭示。此外，通过比对分析发现松瘤小蠹线粒体基因组编码基因的排列顺序和基因组成与已经测定的其他鞘翅目昆虫线粒体基因组相似，表明它们的线粒体基因组编码基因的排列顺序和基因组成很少发生变化，较适合用于物种间的系统发育关系推断 13本研究基于线粒体基因组利用最大似然法构建了2 2 个象甲科物种的系统发育树发现，松瘤小蠹与其他小蠹科物种聚为一个独立的分支，其他各亚科物种也单独聚为一支，而且各亚科之间的节点均有较高的支持率，表明可以基于系统发育树来分析各亚科之间的进化关系。此外，除足距小蠹属的光滑足距小蠹、X.crassiusculus和Xmorigerus未聚在一起外，其他来自同属的物种均聚在同一分支。陈英等 5 基于上述3种足距小蠹属物种线粒体基因组所构建的系统发育树结果与此类似，它们也未聚在同一进化分支，光滑足距小蠹和X.morigerus聚在一起，而X.crassiuscu-lus与其他属物种的亲缘关系表现得更近。通过系统发育树可知，松瘤小蠹先与边瘤小蠹聚在一支，然后与十二齿小蠹又聚在一支，这与已知的系统发育学分类研究结果相符 5，表明它们之间存在较近的亲缘关系。松瘤小蠹线粒体全基因组序列的获得，丰富了象甲科的线粒体基因组数据信息，不仅为研究象甲科的分子系统发育关系以及象甲科不同属之间的进化关系提供了基础数据，而且为筛选分子标记来鉴定松瘤小蠹以及研究其种群遗传结果奠定了基础。参考文献1刘凌，张知晓，倪应才，等.松瘤小蠹分布新记录及其防治策略 .中国森林病虫，2 0 2 1,40(5):9-15.2殷惠芬，黄复生，李兆麟.中国经济昆虫志：第2 9册翅目小蠹科 M.北京：科学出版社，198 4:8 44.3云南省林业厅中国科学院动物研究所.云南森林昆虫 M.昆明：云南科技出版社，198 7.4蒋裕平，黄中许,黄旭昌.松瘤小蠹虫研究 J.浙江师大学报（自然科学版），1992，15(3)：7 9-8 1.5陈英，罗朝兵，李沅秋，等.象甲科线粒体基因组特征及系统发育分析 J.环境昆虫学报，2 0 19,41(6)：1297-1310.6Boore J L.Animal mitochondrial genomes J.NucleicAcids Research,1999,27(8):1767-1780.7Curole J P.Mitogenomics:digging deeper with com-plete mitochondrial genomes JJ.Trends in Ecology&Evolution,1999,14(10):394-398.8Cameron S L.Insect mitochondrial genomics:implica-tions for evolution and phylogeny J.Annual Reviewof Entomology,2014,59:95-117.9Jin J J,Yu W B,Yang J B,et al.GetOrganelle:a fastand versatile toolkit for accurate de novo assembly oforganelle genomes J.Genome Biology,2020,21(1):241.10Bernt M.MITOS:improved de novo metazoan mito-chondrial genome annotation J.Molecular Phylogen-etics and Evolution,2013,69(2):313-319.11Perna N T,Kocher T D.Patterns of nucleotide compos-ition at fourfold degenerate sites of animal mitochon-drial genomes J.Journal of Molecular Evolution,1995,41(3):353-358.12Kumar S,Stecher G,Li 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