巨噬细胞移动抑制因子抑制剂对蛛网膜下腔出血大鼠脑损伤的保护作用.pdf

13 心脑血管病防治 2024 年 1 月第 24 卷第 1 期 Cardio-Cerebrovasc Dis Prev Treat,January 2024,Vol.24,No.1基础研究巨噬细胞移动抑制因子抑制剂对蛛网膜 下腔出血大鼠脑损伤的保护作用申屠华松.程振宇.陈亦华.傅斌DOI:10.3969/j.issn.1009-816x.2024.01.004基金项目：浙江省金华市科技计划项目（2021-4-063）作者单位：321000 浙江省金华市人民医院神经外科通信作者：申屠华松，Email：【摘要】目的 探讨巨噬细胞移动抑制因子（MIF）抑制剂对蛛网膜下腔出血（SAH）大鼠脑损伤的保护作用。方法 将120只12月龄健康雄性大鼠按照随机数字表法分为假手术组、SAH组、小剂量、中剂量和大剂量抑制剂组，每组 24 只。采用枕大池二次注血法制作大鼠 SAH 动物模型，小剂量、中剂量和大剂量抑制剂组分别给予 10 mg/kg、20 mg/kg 和 40 mg/kg 剂量 MIF 抑制剂注射大鼠腹腔，测定五组大鼠炎症因子、神经细胞凋亡、脑含水量、血脑屏障通透性和神经功能情况。结果 大鼠脑组织白介素-1、肿瘤坏死因子-及白介素-6 蛋白表达、神经细胞凋亡指数、脑水肿指数、伊文氏蓝含量及神经行为学评分五组间比较，差异均有统计学意义（F=76.406、62.664、64.106、40.211、24.869、60.229、43.664，均 P 0.01），与假手术组比较，SAH 组白介素-1、肿瘤坏死因子-及白介素-6 蛋白表达、神经细胞凋亡指数、脑水肿指数和伊文氏蓝含量增高，神经行为学评分下降，差异均有统计学意义（P 0.01），MIF 抑制剂腹腔注射可逆转上述作用，且呈剂量-疗效依赖关系（P 0.05）。结论 MIF 抑制剂对 SAH 大鼠脑损伤具有明显的保护作用，且呈量效关系。【关键词】巨噬细胞移动抑制因子；大鼠；蛛网膜下腔出血；脑损伤；量效关系Protective effects of macrophage migration inhibitory factor inhibitor on brain injury in rats with subarachnoid hemorrhage Shentu Huasong,Cheng Zhenyu,Chen Yihua,Fu Bin.Department of Neurosurgery,Jinhua Peoples Hospital,Jinhua 321000,ChinaCorresponding author:Shentu Huasong,Email:【Abstract】Objective To investigate the protective effects of macrophage migration inhibitory factor(MIF)inhibitor on brain injury in rats with subarachnoid hemorrhage(SAH).Methods A total of 120 12-month-old healthy male rats were randomly divided into Sham surgery group,SAH group,low-dose,medium-dose and high-dose inhibitor groups according to the random number table method,with 24 rats in each group.The SAH rat animal models were created via double autologous blood injection into the cisterna magna.Rats in the low-dose,medium-dose and high-dose inhibitor groups were injected intraperitoneally with MIF inhibitor at dosages of 10 mg/kg,20 mg/kg and 40 mg/kg,respectively.Inflammatory factors,neuronal cell apoptosis,brain water content,blood-brain barrier permeability and neurologic function were determined in the five groups of rats.Results The expressions of interleukin-1,tumor necrosis factor-,and interleukin-6 in the brain tissues of rats,percentage of apoptotic neuronal cells,brain edema index,Evans blue content,and neurobehavioral scores of rats were compared among the five groups,and showed statistically significant differences(F=76.406,62.664,64.106,40.211,24.869,60.229,43.664;all P 0.01).Compared with the Sham surgery group,the expressions of interleukin-1,tumor necrosis factor-,and interleukin-6,percentage of apoptotic neuronal cells,brain edema index,and Evans blue content in the SAH group were significantly elevated,while the neurobehavioral scores were substantially decreased(P 0.01).Intraperitoneal injection of MIF inhibitor significantly reversed the aforementioned effects and demonstrated a dose-dependent relationship(all P 0.05).Conclusion The MIF inhibitor displays an obvious protective effect on brain injury in 14 心脑血管病防治 2024 年 1 月第 24 卷第 1 期 Cardio-Cerebrovasc Dis Prev Treat,January 2024,Vol.24,No.1SAH rats and exhibits a dose-response relationship.【Key words】Macrophage migration inhibitory factor;Rats;Subarachnoid hemorrhage;Brain injury;Dose-response relationship脑炎症反应是蛛网膜下腔出血（subarachnoid hemorrhage,SAH）后脑损伤发生发展的重要病理生理机制之一。脑炎症反应可以直接损害神经细胞而造成细胞凋亡，也可以增加血脑屏障的通透性，诱发脑水肿，增加神经细胞凋亡，加重脑损伤1。巨噬细胞移动抑制因子（macrophage migration inhibitory factor,MIF）是一种可以在中枢神经系统由胶质细胞分泌的炎症因子2-5。4，5-二氢-3-（4-羟基苯基）-5-异恶唑乙酸甲酯 4,5-Dihydro-3-（4-hydroxyphenyl）-5-isoxazoleacetic acid methyl ester,ISO-1 可选择性结合 MIF 的互变异构酶活性位点，从而一定程度上抑制 MIF 的促炎活性6。ISO-1 可以显著抑制脑卒中和颅脑创伤大鼠脑炎症反应，减少神经细胞凋亡7-9。本研究使用 ISO-1 腹腔注射作为干预手段，观察其对 SAH 大鼠脑损伤的保护作用，为 SAH 治疗提供新思路。1 材料与方法1.1 材料 健康 SD 大鼠（雄性，清洁级，12 月龄，体重 350400 g，西安交通大学实验动物中心提供，动物合格证号为 SCXK（陕）2012-003，生产许可证号为 SCXK（陕）2017-003；ISO-1（美国 Sigma公司，规格：5 mg/支）；伊文氏蓝（上海烜雅生物科技有限公司，规格：5 g/支）；4，6-二脒基-2-苯基吲哚二盐酸盐（上海懋康生物科技有限公司，规格：1 mg/支）；ApoAlert 细胞凋亡检测试剂盒（美国Biosciences Clontech公司，规格：100T/盒）；白介素-1（interleukin-1beta,IL-1）、白介素-6（interleukin-6,IL-6）和 肿 瘤 坏 死 因 子-（tumor necrosis factor-,TNF-）酶 联 免 疫 分 析（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）试剂盒（武汉艾美捷科技有限公司，规格：96 孔/kit）；酶免疫分析仪（美国 Biorad 公司，型号：iMark）；生物倒置显微镜（中国奥林巴斯有限公司，型号：IX-71）；电子天平（北京赛多利斯仪器系统有限公司，型号：CPA）；紫外分光光度仪（上海屹谱仪器制造有限公司，型号：U-T6）。1.2 方法1.2.1 动物分组及处理 本动物实验经金华市食品药品检验检测研究院实验动物伦理委员会审核批准（AL-JSYJ202153），按照随机数字表法将120只大鼠分成五组，即假手术（Sham）组、SAH 组、小剂量、中剂量和大剂量 ISO-1 组，每组 24 只。大鼠接受戊巴比妥钠针 50 mg/kg腹腔注射麻醉，采用枕大池二次注血法制作 SAH 动物模型10，且SAH 程度评分不少于9分则为造模成功11。Sham 组大鼠二次均经枕大池注入等量 0.9%氯化钠注射液。在模型形成前半小时，ISO-1三个剂量组大鼠分别给予 10 mg/kg、20 mg/kg 和 40 mg/kg ISO-1 经腹腔注射，另外两组大鼠经腹腔注射等量 0.9%氯化钠注射液。大鼠死亡后则补充同一批次体重相当成活大鼠，以保证每亚组6 只大鼠。1.2.2 动物神经功能及病理生理指标的检测 在造模后 24 h，取每组 6 只大鼠，处死后取脑组织用于神经细胞凋亡检测和炎症指标测定；另每组每次取 6 只大鼠分别用于检测脑含水量（脑水肿指数）、血脑屏障通透性和神经功能。将脑组织称重，匀浆，脑匀浆液以 3 000 r/min离心 20 min，取上清液，采用ELISA法测定 IL-1、TNF-和 IL-6 水平。将脑组织用 4%多聚甲醛固定、脱水、透明、浸蜡、包埋、切片、烤片和脱蜡等工序，然后采用荧光染色原位末端标记法（terminal-deoxynucleoitidyl transferase mediated nick end labeling,TUNEL）检测凋亡神经细胞，在荧光显微镜下观察采集图像，计算凋亡神经细胞比例。称取左、右侧大脑半球脑组织湿重和在 80下干燥 24 h 后的干重，通过公式：（湿重干重）/湿重 100%计算脑含水量。经股静脉注射伊文氏蓝，处死大鼠，将切取的颞底组织称重后与 50%三氯乙酸溶液混匀后离心，取上清液，应用紫外分光光度仪进行比色，计算伊文氏蓝含量来确定大鼠血脑屏障的渗透性。采用Kaoutzanis 等12的方法对大鼠进行运动反应、睁眼反应和进食三部分内容的神经行为学测定，总分311分，分数越低神经功能越差。1.3 统计学处理 采用 SPSS 22.0 版统计软件，计量数据以 xs 表示，多组间比较采用方差分析，组间两两比较采用最小显著差异法，P 0.05 为差异有统计学意义。2 结果2.1 大鼠 SAH 模型的制作及大体观 采用枕大池二次注血法制作 SAH 大鼠模型，模型形成后，大体观可见基底池及脑表面明显积血，见图1。2.2 ISO-1 对 SAH 大鼠脑炎症反应、脑水肿和血脑屏障通透性的影响 各指标五组间比较，差异均具有统计学意义（均P 0.01）。与Sham 组比较，SAH组 15 心脑血管病防治 2024 年 1 月第 24 卷第 1 期 Cardio-Cerebrovasc Dis Prev Treat,January 2024,Vol.24,No.1大鼠脑组织 IL-1、TNF-和 IL-6 表达水平、血脑屏障通透性和脑水肿指数均升高，差异具有统计学意义（P 0.01），而 ISO-1 三个剂量组大鼠脑组织 IL-1、TNF-和IL-6表达水平、血脑屏障通透性和脑水肿指数均较SAH组下降，差异具有统计学意义（P 0.05），存在量效关系（P 0.05），见表1。2.3 ISO-1 对 SAH 大鼠脑组织神经细胞凋亡的影响 神经细胞凋亡指数五组间比较，差异具有统计学意义（P 0.01）。与 Sham 组比较，SAH 组大鼠脑组织神经细胞凋亡指数升高差异具有统计学意义（P 0.01），而 ISO-1 三个剂量组大鼠脑组织神经细胞凋亡指数均较 SAH 组下降，差异具有统计学意义（P 0.05），存在量效关系（P 0.05），见表 1 和图 2。2.4 ISO-1 对 SAH 大鼠神经功能的影响 神经行为学评分：Sham组（11.00.0）分，SAH 组（6.70.8）分，小 剂 量 ISO-1 组（7.50.6）分，中 剂 量 ISO-1 组（8.50.8）分，大剂量 ISO-1 组（9.30.5）分，五组间比较差异有统计学意义（F=43.664，P 0.01）。与Sham 组比较，SAH 组大鼠神经行为学评分降低差异具有统计学意义（P 0.01），而 ISO-1 三个剂量组大鼠神经行为学评分均较 SAH 组升高（P 0.05），存在量效关系（P 0.05）。3 讨论SAH 可以破坏神经细胞，导致神经细胞凋亡，同时激活胶质细胞释放炎症因子，从而破坏血脑屏障，引起脑水肿，进而使得神经细胞凋亡，最终造成脑损伤，影响神经功能。IL-1、TNF-和 IL-6 是脑损伤后脑炎症反应中重要的炎症因子，其表达水平的变化可以反映脑炎症反应程度1。本研究发现 SAH 大鼠较 Sham 组大鼠脑组织 IL-1、TNF-和 IL-6 表达水平增加，脑水肿加重及血脑屏障渗透性增加，细胞凋亡加剧，神经功能恶化。因此，抑制脑炎症反应可能是 SAH 治疗的重要途径之一。MIF 是一种炎症因子，在体内来源广泛，在外周神经系统主要由巨噬细胞和单核细胞产生，在中枢神经系统可由垂体、皮质、海马、下丘脑、小脑、脑桥和脊髓等部位的胶质细胞产生，低氧、内毒素、炎症因子等均可诱导其表达。MIF 参与了脑血管疾病、抑郁症、痴呆、胶质瘤、多发性硬化、肌萎缩侧索硬化等神经系统疾病的发生与发展13-18。ISO-1 是 MIF 特异性的拮抗剂6。ISO-1 可以显著抑制脑梗死及颅脑创伤大鼠脑胶质细胞激活及脑炎症反应，同时改善脑梗死大鼠血脑屏障通透性，表现出了极强的脑炎症抑图 1 大鼠蛛网膜下腔出血模型的大体观（A：假手术模型；B：蛛网膜下腔出血模型）表 1 ISO-1 对 SAH 大鼠神经病理生理指标的影响（xs）组别只数脑水肿指数（%）伊文氏蓝含量（g/g）神经细胞凋亡指数（%）IL-1（pg/mg）TNF-（pg/mg）IL-6（ng/mg）Sham 组676.20.510.61.34.31.819.82.36.00.70.40.1SAH 组682.61.7a25.32.5a25.95.0a45.12.8a40.48.4a2.70.3a小剂量 ISO-1 组680.91.7ab18.41.6ab20.01.6ab33.53.4ab22.12.5ab1.70.2ab中剂量 ISO-1 组679.40.7abc16.21.5abc16.02.5abc27.72.7abc16.72.0abc1.40.2abc大剂量 ISO-1 组677.81.2abcd13.81.6abcd12.13.6abcd23.92.3abcd11.61.4abcd1.10.3abcdF 值24.86960.22940.21176.40662.66464.106P 值0.010.010.010.010.010.01 注：ISO-1：4，5-二氢-3-（4-羟基苯基）-5-异恶唑乙酸甲酯；IL-1：白介素-1；TNF-：肿瘤坏死因子-；IL-6：白介素-6；Sham：假手术；SAH：蛛网膜下腔出血；与 Sham 组比较aP 0.01，与 SAH 组比较bP 0.05，与小剂量 ISO-1 组比较cP 0.05，与中剂量 ISO-1 组比较dP 0.05图 2 ISO-1 对 SAH 大鼠脑组织神经细胞凋亡的影响（Sham、SAH、ISO-1 注解见表 1；DAPI：4，6-二脒基-2-苯基吲哚二盐酸盐；TUNEL：荧光染色原位末端标记法；Merge：合并）16 心脑血管病防治 2024 年 1 月第 24 卷第 1 期 Cardio-Cerebrovasc Dis Prev Treat,January 2024,Vol.24,No.1制作用7-9。在脑损伤模型中，ISO-1的用药途径有经脑室8、皮下7和腹腔注射9，用药剂量依次是1 mg/kg、3 mg/kg 和 10 mg/kg，用药时间依次是模型形成前半小时、模型形成后 3 h 和模型形成后半小时，均获得了阳性结果7-9。本研究按照 10 mg/kg、20 mg/kg 和40 mg/kg 剂量在模型形成前半小时腹腔注射 ISO-1 治疗 SAH 大鼠。ISO-1 显著地抑制脑组织IL-1、TNF-和 IL-6 表达，减轻脑水肿，改善血脑屏障通透性，抑制神经细胞凋亡，改善大鼠神经功能，同时存在量效关系。ISO-1 的这种作用可能与其抑制胶质细胞的炎症反应有关。最近也有研究提示，ISO-1 对神经细胞功能的直接影响也是 ISO-1 脑保护作用的重要机制之一19。因此，ISO-1 对 SAH 后脑损伤可能有保护作用，而它的具体作用机制有待于进一步研究。虽然本研究显示 ISO-1 在给药剂量 10 mg/kg、20 mg/kg 和 40 mg/kg 时，各项指标随着上述剂量提高干预效果越好，但是 ISO-1 最佳有效给药剂量尚不明确，有待进一步研究。颈内动脉穿刺法、枕大池二次注血法和交叉前池注血法是目前常用的三种 SAH 的动物模型制作方法，由于枕大池二次注血法操作相对简单，本研究参照该方法制作模型20。本研究发现 ISO-1 对SAH大鼠脑损伤具有明显的保护作用，且呈量效关系，但这只能作为初步研究结果。本研究采用造模后 24 h取样，但造模后神经损伤最为严重的时间多为 72 h，这个是今后研究需要补充的内容。参考文献1 Geraghty JR,Davis JL,Testai FD.Neuroinflammation and microvascular dysfunction after experimental subarachnoid hemorrhage:emerging components of early brain injury related to outcomeJ.Neurocrit Care,2019,31(2):373-389.2 De Nardo TFS,Bertolo PHL,Bernardes PA,et al.Contribution of astrocytes and macrophage migration inhibitory factor to immune-mediated canine encephalitis caused by the distemper virusJ.Vet Immunol Immunopathol,2020,221:110010.3 Zhu Z,Hu Y,Zhou Y,et al.Macrophage migration inhibitory factor promotes chemotaxis of astrocytes through regulation of cholesterol 25-Hydroxylase following rat spinal cord injuryJ.Neuroscience,2019,408:349-360.4 Zhou Y,Guo W,Zhu Z,et al.Macrophage migration inhibitory factor facilitates production of CCL5 in astrocytes following rat spinal 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