实验课-生物学-仪器设备及操作简介.pdf

实验一规仪器设备及操作简介实验一分子生物学实验常规仪器设备 及操作简介实验一规仪器设备及操作简介修的为，的和使学实、必程 养外题度拟物学理 化 科课培验问态课生物整强 专续力实析作验子生、步、后能学分工实分子集 本为和理、的学握分收进 业上识生察真物掌握和，专能知的观认生，掌果验 类技授典；肃子习和结实 物验传经力严分学悉验性 生实融授能、此的熟实合 校和，讲的风因验.，录综 院上想了识作。实作纪或 等论思除知是养学操、察 高理学课取求培物本察观 是在。教验获事和生基观时 将础、实的实练子的握同 验它基育学生的训分备掌。目 实，的教物学究的典设；法项 学课要代生对研神经、术方验 物础必现子重学精对器技的实 生基下应分注科作过仪本据个 子业打适，别.，协通的基数多 分专习了体特力结生验的验过 的学为一还能团学实验实通实验一规仪器设备及操作简介【实验目的】(1)了解分子生物学实验的仪器、设备、耗材。(2)掌握分子生物学实验常用仪器的功能和使用方法。【实验内容】-1.分子生物学实验课的要求 1.1实验前(1)了解本次实验的目的、要求，充分理解本次实验的原理、熟悉实验项目、操作步骤和程序，了解实验的注意事项。(2)结合实验阅读相关理论知识，必要时还需要查阅一定的 资料，做到充分理解实验原理与方法，力求提高实验课的效果。(3)预测本次实验结果，对预测的结果尽可能地做出合理的 解释。(4)估计本次实验可能发生的问题，并思考解决问题的应急实验一规仪器设备及操作简介-1.2实验时(1)遵守实验室规则。(2)爱惜实验器械和样本；节约药品、水、电，确保实验完 成。(3)按程序正确操作仪器和器械，按实验步骤进行实验。(4)认真观察和纪录实验结果，并加上必要的标记、文字说 明；实验过程中还要思考出现了什么样的结果？为什么会有这 些结果？这些结果有何意义？若出现非预期结果，还应分析其 原因，尽可能地及时解决。(5)实验中要有耐心，必须等前一项实验基本恢复正常后，才能进行下一项实验，注意观察实验的全过程。1.3实验后(1)实验完成后要及时关闭仪器和设备的电源；按规定整理 实验器具和处理废弃物。(2)及时整理实验纪录，分析实验结果，做出实验结论。实验一规仪器设备及操作简介-2、分子生物学实验常规仪器、设备和耗材实验一规仪器设备及操作简介 加样器（枪）实验一规仪器设备及操作简介凝胶成像仪7实验一规仪器设备及操作简介 紫外透射仪实验一规仪器设备及操作简介 手提紫外分析仪实验一规仪器设备及操作简介 电泳槽和电泳仪实验一 操作简介实验一规仪器设备及操作简介 超低温冰箱实验一规仪器设备及操作简介 冰箱实验一规仪器设备及操作简介冷臧柜?(Ivan*Ur实验一规仪器设备及操作简介 高压灭菌锅实验一规仪器设备及操作简介 离心机实验一规仪器设备及操作简介 冷冻离心机实验一规仪器设备及操作简介 微型离心机实验一规仪器设备及操作简介 恒温摇床实验一规仪器设备及操作简介 全温恒温摇床实验一规仪器设备及操作简介 脱色摇床实验一规仪器设备及操作简介 水浴锅实验一规仪器设备及操作简介 低温恒温槽实验一规仪器设备及操作简介 生化培养箱实验一规仪器设备及操作简介PCR犷增仪实验一规仪器设备及操作简介制冰机 三三一若三五一二=JW.3V-一实验一规仪器设备及操作简介 涡旋仪实验一规仪器设备及操作简介 液氮罐实验一规仪器设备及操作简介 真空泵实验一规仪器设备及操作简介 超纯水仪实验一规仪器设备及操作简介 磁力搅拌器实验一规仪器设备及操作简介PH计实验一规仪器设备及操作简介 天平(1/10000)实验一规仪器设备及操作简介荧光分光光度计名林赞光分光光度讣负责人，生金样 n，八6-5301 PC58 4-一 9实验一规仪器设备及操作简介 核酸蛋白仪（紫外可见分光光度计）实验一咻松F作简介实验一规仪器设备及操作简介 部分收集器实验一规仪泌备及操作简介实验一 H1W操作简介实验一规*剧0及操作简介实验一规仪器设备及操作简介气相色谱实验一规仪器设备及操作简介 基因枪实验一规仪器设备及操作简介 酶标仪实验一矗笳鞭作简介实验一规仪器设备及操作简介超速冷冻离心机搦跟N实验一规仪器设备及操作简介 激光共聚焦显微镜实验一规仪器设备及操作简介 培养皿实验一规及操作简介实验一规仪器设备及操作简介 冻存盒实验一规仪器设备及操作简介 酶标板实验一规仪器设备及操作简介TUBE管架实验一规仪器设备及操作简介 Tip盒实验一规仪器设备及操作简介 试管架实验一规仪器设备及操作简介PCR管/板ltlzlx1K4107)均有较好的分离效果。TRIZOL试剂操作上的简单性 允许同时处理多个的样品。所有的操作可以在一小时内完成。TRIZOL抽提的总RNA能够避免DNA和蛋白的污染。故而能 够作RNA印迹分析、斑点杂交、poly(A)+选择、体外翻译、RNA酶保护分析和分子克隆。如果是用于PCR,当两条引物 位于单一外显子内时，建议用DNase I来处理抽提的总RNA。TRIZOL试剂能抽提不同种属不同分子量大小的多种RNA。例如，从大鼠肝脏抽提的RNA琼脂糖凝胶电泳并用澳化乙碇 染色，可见许多介于7 kb和15 kb之间不连续的高分子量条 带(mRNA和hnRNA成分)，两条优势核糖体RNA条带位于 5 kb(285)和2 kb(18S),低分子量RNA介于0,1和0.3 kb之间(tRNA,5S)O当抽提的RNA用TE稀释时其A260/A280 比值2L8 o实验三总RNA抽提与鉴定【实验器具】水平电泳装置，电泳仪、微波炉、紫外透射仪、微量移液器、一次性手套、离心管、离心管架、Tip头、高压灭菌锅、恒温摇床、台式冷冻高速 离心机、研碎、液氨罐、医用剪刀、吸水纸、微量移液器、分光光度计等。【试剂】TRIzoL DEPC（焦碳酸二乙酯）、氯仿、异丙醇、无水乙醇、75%乙醇、TE缓冲液、TBE电泳缓 冲液（5义）、EB、上样缓冲液、琼脂糖等实验三总RNA抽提与鉴定【操作步骤】1、组织匀浆化：用g2ss-Teflon或强力匀浆器(Polytron,或 Tekmars TISSUMIZER 或equivalent)搅匀组织样品，每50100 mg组织加1ml的TRIZOL。匀浆化时组织样品 容积不能超过TRIZOL容积的10%。(备选方案：当样品 富含蛋白质，脂肪，多糖或是细胞外物质例如肌肉，脂肪 组织和植物的块茎部分时可能需要一额外的分离步骤。匀 浆化后在28。C的条件下以12,000Xg的离心力离心10 分钟，移除匀浆中不溶解的物质，余下的沉淀中包含有细 胞外膜，多糖，以及高分子量DNA,而上层的超浮游物含 有RNA。在来自于脂肪组织的样品中，大量的脂肪漂在最 上层因而应该除掉。在每一个个案中，将清亮的匀浆溶液 转移到一干净的试管中加入氯仿并继续进行下述的分离步 骤。)实验三总RNA抽提与鉴定 2、分离阶段：将匀浆样品在1530 C条件下 孵育5分钟以使核蛋白体完全分解。每1ml 丁阳201_加0.2 011氯仿。盖紧样品管盖，用手用 力剧烈摇晃试管15秒并将其在30 C下孵育2 3分钟。在28 C下以不超过12,000Xg的离 心力高速冷冻离心15分钟。离心后混合物分成 三层：下层红色的苯酚一氯仿层，中间层，上层 无色的水样层。RNA无一例外地存在于水样层 当中。水样层的容量大约为所加TRIZOL容量的 60%o实验三总RNA抽提与鉴定 3、RNA的沉淀：将水样层转移到一干净的试管 中，如果希望分离DNA和蛋白，有机层同样要 予以保留。通过将水样层和异丙醇混合来沉淀 RNA o最初均化时的每1 ml TRIZOL对应0.5 ml 异丙醇的加入量。将混合的样品在1530 C 条件下孵育10分钟，并在28 C下以不超过 12,000义g的离心力高速冷冻离心10分钟。RNA沉淀在离心前通常不可见，离心后形成一 胶状片状沉淀附着于试管壁和管底。实验三总RNA抽提与鉴定 4、RNA的洗脱：移去上层悬液。用乃的乙醇 洗涤RNA沉淀一次，每1ml的TRIZOL至少加1 ml的75%乙醇。旋涡振荡混合样品并在2 8 C下以不超过7,500Xg的离心力高速冷冻离 心5分钟。5、RNA的再溶解：在操作的最后，简单干燥 RNA沉淀（空气干燥或真空干燥510分钟），不要在真空管里离心干燥RNA。尤为重要的是,不能让RNA沉淀完全干燥那样会极大地降低它 的可溶性。用无RNA酶的水或0.5%SDS溶液来 溶解RNA,可在5560 C下孵育10分钟，RNA还能用100%去离子甲酰胺溶解，-70 C实验三总RNA抽提与鉴定 6、甲醛变性琼脂糖凝胶电泳分析总RNA配制L2%变性琼脂糖凝胶(40 mL)称取048 g,加入DEPC水25.2 mL,5 X电泳缓冲液4 mL,加热使溶解,稍冷却加入甲醛34 mL,混匀，室温凝固0.5-1 h.RNA电泳检测样品制备RNA 2 pl 甲醛 2.5 pl 甲酰胺 7.5 pl10X MOPS 2 pl RNA Loading Buffer2 pl 灭菌的DEPC 水4 pl 混合液轻轻混匀并离心，放于65下温育5 min后，置于冰上。电泳检测将L2%变性琼脂糖凝胶放入水平电泳槽中，力口 1XMOPS电泳缓冲 液，覆盖凝胶约1mm。将RNA样品加到凝胶点样孔中，在5 V/cm 条件下电泳30 min,然后在EB中染色15-20 min,在紫外灯下观 察提取的RNA的质量。实验三总RNA抽提与鉴定7、核酸蛋白定量仪测定总RNA的纯度和含量：在超净工 作台上吸取95ul无菌水到EP管中，加入53总RNA溶液，充 分混匀，在核酸蛋白定量仪上测定待测样品液在260rlm、280nm、230nm的OD值。然后计算RNA的浓度，并分析 其纯度。计算浓度：对于ssRNA,1.0 OD260=40 ug/mlo 测定纯度：纯的RNA溶液其OD260/OD280的比值应介于1.8至20 OD260/OD230的比值应大于2.0。RNA样品OD260/OD280的比值太小，说明有蛋白或苯酚污染。比 值大于2.0,则可能被异硫富酸月瓜污染。OD260/OD230的比值小于2.0时表明有小分子及盐存在。纯的 DNA溶液其OD260/OD280应为 1.8,OD260/OD230应大于20。OD260/OD280大于L9时，表明有RNA污染，小于L6时表明有蛋 白质或酚污染。OD260/OD230小于20时，表明溶液中有残存的盐和小分子杂质，如核甘酸、氨基酸、酚等。实验四 第一链cDNA合成实验四第一链CDNA合成实验四 第一链cDNA合成【实验目的】1、掌握第一链CDNA合成的原理。2、掌握第一链cDNA合成的方法【实验原理】所有合成CDNA第一链的方法都要用依赖于RNA的DNA聚合酶(反转录 酶)来催化反应。目前商品化反转录酶有从禽类成髓细胞瘤病毒纯化 到的禽类成髓细胞病毒(AMV)逆转录酶和丛表达克隆化的Moloney鼠 白血病病毒反转录酶基因的大肠杆菌中分离到的鼠白血病病毒(MLV)反转录酶。AMV反转录酶包括两个具有若干种酶活性的多肽亚基，这 些活性包括依赖于RNA的DNA合成,依赖于DNA的DNA合成以及对 DNA:RNA杂交体的RNA部分进行内切降解(RNA酶H活性)。MLV反转录 酶只有单个多肽亚基，兼备依赖于RNA和依赖于DNA的DNA合成活性，但降解RNA:DNA杂交体中的RNA的能力较弱，且对热的稳定性较AMV 反转录酶差。MLV反转录酶能合成较长的cDNA(如大于2-3kb)。AMV 反转录酶和MLV反转录酶利用RNA模板合成cDNA时的最适pH值，最适 盐浓度和最适温室各不相同，所以合成第一链时相应调整条件是非常重要。AMV反转录酶和MLV反转录酶都必须有引物来起始DNA的合成。cDNA 合成最常用的引物是与真核细胞mRNA分子3端poly(A)结合的12-18核 昔酸长的oligoU。以RNA分子为模板，合成出一条DNA链。形成的 DNA是与RNA模板互补的，因而反转录产生的DNA分子称之为cDNA。实验四 第一链cDNA合成【实验器具】离心机、冰盒、口罩、手套、EP管架、超净工 作台、移液器、DEPC处理过的枪头、EP管等。【试剂】-5XM-MLVRTBuffen 2.5mM dNTP mix RNase抑缶U剂(30U/|jL)、M-MLV Reverse Transcriptase Oligo(dT)18 primer DEPC处 理过的水等。实验四 第一链cDNA合成【实验步骤】1.在DEPC处理过的EP管中加入约02的总 RNA和 13 0.5|jg/|jl的 Oligo(dT)18jDrimer,力口 DEPC水至112川，小心混匀，70风5分钟(使 总RNA变性，去除大部分的二级结构)，立即浸 入冰水中(使mRNA与Oligo(dT)退火)。2.按次序分别加入下列试剂：4|jl5 XM-MLVRT Buffer2|jl dNTP mix(lOmM)RNase抑制剂(20 U/|jL)lpl M-MLV Reverse Transcriptase(20 0 U/|jL)3.小心混匀，室温离心5秒，将所有溶液收集到 管底，42保温1小时。4.70处理5分钟，冰上冷却(使酶变性，)。实验五基因扩增与产物检测实验五基因扩增与产物检 测实验五基因扩增与产物检测【实验目的】掌握PCR原理，学习PCR操作过程【实验原理】PCR是一种选择性体外扩增DNA或RNA的方法,它包 括三个基本步骤：(1)变性(Denature):目的双链 DNA片段在9496。下解链；(2)退火(A nneal):两 种寡核甘酸引物在适当温度(5060左右)下与模 板上的目的序列通过氢键配对;(3)延伸(Extension):在Taq DNA聚合酶合成DNA的最适温度下，以目的 DNA为模板进行合成,由这三个基本步骤组成一轮 循环，理论上每一轮循环将使目的DNA扩增一倍(下图)，这些经合成产生的DNA又可作为下一轮 循环的模板,所以经2535轮循环就可使DNA扩增达 倍。O Incubate target DNA at 94 for 1 minute to separate the strands.0 Add primers,nucleotides(deoxynucleotides),and DNA polymerase.1Target DNA“Primer-ITTP-clGTPdCTP 3.一 dATPUxxxO Primers attach to single-stranded DNA during incubation at 60 for 1 minute.O Incubate at 720C for 1 minute;during this time,two copies of target DNA are formed.3 Q A Q P U O 0 Q SRepeat the cycle of heating and cooling to make two more copies of target DNA.G DNA polymerase舄 lllliiiiiiiiiininnnii1111：11 i 11 k I 口 111Copyright 2004 Pearecn Education Ire,ptibshing as Benamin CummingsHmi实验五 基因扩增与产物检测-【实验器具】DNA扩增仪、PCR管、水平电泳设备、台式高 速离心机、微量移液器、一次性手套、Tip头、记号笔等。-【试剂】TaqDNA聚合酶、10XPCR反应缓冲液、4种 dNTP混合物、模板DNA、特异性引物、超纯水、琼脂糖、Tris、HCL硼酸、EDTA、上样缓冲 液(6X)、Gold View 染色液实验五 基因扩增与产物检测实验五 基因扩增与产物检测-【操作步骤】标记试管 加入各种试剂、混匀、离心沉降（最后加酶）设立PCR循环程序，进行扩增-琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果实验五 基因扩增与产物检测 1、标记PCR反应管实验五 基因扩增与产物检测2、依次混匀下列试剂(25川体系)ddH2O 17.5|jl 10义PCR反应缓冲液 2.5|J|25mmol/L MgCI2 2pl lOmmol/L dNTP 0.5|jl 25umol/L上游引物和下游引物 各0.5|jl 模板DNA(cDNA)lpl 5U/uL DNA聚合酶 0.53(2.5U)实验五 基因扩增与产物检测实验五 基因扩增与产物检测Verification of PCR product on agarose or separide gelladder PCR fragments实验六DNA胶回收实验六DNA胶回收实验六DNA胶回收【实验目的】1、了解多种纯化、回收DNA的方法和技术 2、掌握柱式DNA胶回收的方法和技术【实验原理】在电泳过程中不同大小的片段分离处于不同的位置，切下并 回收含目的片段的琼脂糖凝胶，将琼脂糖凝胶溶于碘盐溶液(Nai)中，加硅基质结合DNA片段。结合物”NA复合物很 容易与系统中其余部分分开，用水洗脱复合物，使DNA得到 分离。【实验器具】水平电泳装置，电泳仪、微波炉、紫外透射仪、微量移液器、一次性手套、离心管、离心管架、Tip头、台式离心机、水 平电泳仪、-20。(：冰箱、电热恒温水溶箱等。【试剂】琼脂糖、UNIQ-10柱离心式DNA胶回收试剂盒等实验六DNA胶回收【操作步骤】1、取20pl PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳。2、在紫外投射仪下判断DNA片段的位置，然 后用干净的手术刀割下含有所要DNA的琼脂块,放入L5ml离心管中。3、按每lOOmg琼脂糖凝胶力口入400川Binding Buffer,置于5060水浴中10分钟，使胶彻 底融化。加热融胶时，每2分钟混匀一次。4、将UNIQ-10柱放入2m收集管中，将融化的 胶溶液转移到UNIQ-10柱中，室温放置2分钟。室温8 OOOrpm离心1分钟。实验六DNA胶回收-5、取下UNIQ-10柱，倒掉收集管中的废液，将 UNIQ-10柱放入原收集管中，加入450|jlWash Solution,室温8 OOOrpm离心1分钟。-6、取下UNIQ-10柱，倒掉收集管中的废液，将 UNIQ-10柱放入原收集管中，让离心管盖开着，室温高速12 OOOrpm离心1分钟。7、将UNIQ-1O柱放入一根新的L5ml离心管中，在柱膜中央加30口1日ution Buffer或水（pH 7.0）,室温或37 C放置2分钟。8、12 OOOrpm高速离心1分钟，离心管中的液体 即含有回收的DNA片段，可立即使用或保存于-20备用。