不同红曲菌菌株耐硒能力和富硒能力的初步研究_龙鹏程.pdf

1 生物工程食 品 科 技FOOD SCIENCE AND TECHNOLOGY2023年 第48卷 第04期收稿日期：2022-11-15 *通信作者 基金项目：国家自然科学基金项目(32072188，32060526，31701590)。作者简介：龙鹏程(1996)，女，湖南娄底人，硕士研究生，研究方向为富硒微生物资源利用与开发。龙鹏程1，朱利沙1,2，赖华发1,2，王丽玲3，高 超1，王璋倩1，程水源1*，何 毅1,2*(1.武汉轻工大学硒科学与工程现代产业学院，国家富硒农产品加工技术研发专业中心，湖北省绿色富硒农产品精深加工工程技术研究中心，湖北 武汉 430023；2.武汉轻工大学食品科学与工程学院，湖北 武汉 430023；3.塔里木大学生命科学学院，新疆 阿拉尔 843300)摘要：为比较不同红曲菌菌株的耐硒能力和富硒能力，以5株红曲菌菌株为研究对象，通过接种于亚硒酸钠浓度为0、10、20、50、100、200 g/mL的PDA培养基中培养，测量其生长曲线和菌丝体中硒含量和总硒产量。结果显示：不同亚硒酸钠浓度对红曲菌菌株生长的影响与硒的富集均存在差异，其中耐硒能力最强的菌株为紫色红曲菌CICC 5046，其在亚硒酸钠浓度为50 g/mL的PDA培养基平板上培养15 d后菌落直径可达(53.81.5)mm；富硒能力最强的菌株为红色红曲菌M7，其在亚硒酸钠浓度为50 g/mL的PDA培养基平板(25 mL培养基)上培养15 d后总硒产量达到最高，为(124.432.01)g；而当PDA培养基中亚硒酸钠浓度为200 g/mL时，红色红曲菌M7菌丝体中的硒含量达到最高，为(3120.59193.63)g/g。因此，不同红曲菌对亚硒酸钠的耐受能力和富集能力均不同，这种差异性可能与菌株的基因型或其抗氧化能力有关。关键词：红曲菌；亚硒酸钠；耐硒能力；富硒能力中图分类号：TS 201.3 文献标志码：A 文章编号：1005-9989(2023)04-0001-07Preliminary Study on Selenium Tolerance and Selenium Enrichment Ability of Different Monascus StrainsLONG Pengcheng1,ZHU Lisha1,2,LAI Huafa1,2,WANG Liling3,GAO Chao1,WANG Zhangqian1,CHENG Shuiyuan1*,HE Yi1,2*(1.College of Modern Industry of Selenium Science and Engineering,National Selenium-Rich Agricultural Products Processing Technology Research and Development Center,Hubei Province Green Selenium-Rich Agricultural Products Deep Processing Engineering and Technical Research Center,Wuhan Polytechnic University,Wuhan 430023,China;2.College of Food Science and Engineering,Wuhan Polytechnic University,Wuhan 430023,China;3.College of Life Science,Tarim University,Alar 843300,China)不同红曲菌菌株耐硒能力和富硒能力的初步研究DOI:10.13684/ki.spkj.2023.04.024 2 食 品 科 技FOOD SCIENCE AND TECHNOLOGY生物工程2023年 第48卷 第04期0 引言硒元素作为人体必需的微量元素1，在人体生理代谢中发挥着重要作用2，硒元素缺乏和过量都会引发人体多种疾病。然而，硒在自然界中分布不均匀，具有显著的地理差异。中国是一个缺硒国家，表土硒的平均含量为0.29 mg/kg3，其中72%的土地被归类为缺硒区，覆盖了中国的主要粮食产区4。目前，硒的功能已经从抗氧化、抗癌、维持正常代谢和调节免疫力5扩展到细胞内信号传导和基因调控6。无机硒受制于其毒性大、生物活性低、吸收效果不理想的缺陷，而有机形式的硒因其低毒性和高生物相容性成为有前途的替代品。近年来，利用微生物作为载体将无机硒(亚硒酸盐或硒酸盐)转化为有机硒或纳米硒的研究已经陆续开展1。目前，酵母菌7-8和乳酸菌9是富硒微生物研究的主要对象。然而，硒在丝状真菌中的富集能力还有待进一步研究。红曲菌(Monascus spp.)是我国传统、特色的药食兼用丝状腐生真菌，其在大米等淀粉基质上进行固态发酵即可得到红曲。红曲在我国及东南亚地区已有近2000年应用历史10。研究表明，红曲菌可以产生丰富的有益次级代谢产物，包括具有着色功能的红曲色素，具有降血脂功效的他汀类物质，具有抗氧化活性的物质Dimerumic acid和具有降血压功能的-氨基丁酸(-Aminobutyric acid)(GABA)11-12等。目前，我国工业化生产的红曲产品主要有色素红曲、酿造用红曲以及用于医药和健康食品的功能性红曲三大类，应用非常广泛13。有实验表明，红曲菌可以将亚硒酸钠转化为纳米硒14，富硒驯化后的红曲菌对无机硒的利用率可达99%15。然而，对红曲菌的硒富集能力、硒耐受能力的比较和硒生物强化在红曲中应用的研究较少。本实验选取5株红曲菌进行生物转化法富集硒，通过在不同亚硒酸钠浓度下进行培养，测定其生长曲线和发酵末期的硒含量及总硒产量，确定5株红曲菌菌株中耐硒能力和富硒能力最强的菌株，分析红曲菌在富硒环境生长过程中的变化，为探究亚硒酸钠对真菌生长的影响和富硒红曲菌的开发提供参考。1 材料与方法1.1 材料1.1.1 菌株 红色红曲菌(Monascus ruber)M7：华中农业大学食品生物技术与安全实验室；红色红曲菌(M.ruber)HY1：本课题组筛选并保藏；红色红曲菌(M.ruber)CICC 41649、紫色红曲菌(M.purpureus)CICC 41601、CICC 5046：中国工业微生物菌种保藏管理中心(China Center of Industrial Culture Collection，CICC)。1.1.2 培养基 马铃薯葡萄糖固体培养基(Potato Dextrose Agar，PDA)：取去皮马铃薯200 g，切成1 cm3小块，加蒸馏水600 mL左右，待沸腾之后继续煮30 min，用8层纱布过滤收集滤液，加入20 g葡萄糖和15 g琼脂粉，加蒸馏水定容至1000 mL，自然pH值；培养基灭菌条件为121，20 min。富硒PDA培养基：配制初始浓度为5 mg/mL的亚硒酸钠溶液母液(过滤除菌)，加入至上述灭好菌的PDA培养基(处于液态，未凝固)中，使PDA培养基中亚硒酸钠最终浓度分别为0(CK)、10、Abstract:In order to compare the selenium tolerance and selenium enrichment ability of different strains of Monascus,five Monascus strains were inoculated in PDA medium with sodium selenite concentration of 0,10,20,50,100,200 g/mL,and then the growth curve,selenium content and total selenium yield were measured.The results showed that the effects of different sodium selenite concentrations on the growth of Monascus strains and the enrichment of selenium were different.The strain with the strongest selenium tolerance ability was Monascus purpureus CICC 5046,and its colony diameter could reach(53.81.5)mm after cultured on PDA plates containing 50 g/mL sodium selenite for 15 days.The strain with the strongest selenium-enriched ability was Monascus ruber M7,which reached the highest total selenium yield of(124.432.01)g after cultured on PDA plate(25 mL medium)containing 50 g/mL sodium selenite for 15 days.When the concentration of sodium selenite in PDA medium was 200 g/mL,the selenium content in Monascus ruber M7 mycelium reached the highest,which was(3120.59193.63)g/g.Therefore,different Monascus strains have different tolerance and enrichment ability to sodium selenite,which may be related to the genotype of the strain or its antioxidant system.Key words:Monascus spp.;sodium selenite;selenium tolerance ability;selenium enrichment ability 3 生物工程食 品 科 技FOOD SCIENCE AND TECHNOLOGY2023年 第48卷 第04期20、50、100、200 g/mL。1.1.3 试剂与仪器 盐酸、硝酸、氢氧化钠、硼氢化钾：优级纯，武汉欣申试有限公司；亚硒酸钠：分析纯，国药集团化学试剂有限公司；1000 g/mL硒标准溶液：国家标准物质。ZEALWAY-G154DS高压灭菌锅：美国致微仪器公司；HP 250 MJ霉菌培养箱：武汉瑞华仪器设备有限责任公司；HDL超净工作台：北京东联哈尔仪器有限公司；ANTO NPAAR-MONOWAVE 300微波消解仪：上海商贸有限公司；G-400智能控温电加热器赶酸仪：上海屹尧仪器科技发展有限公司；海光液相原子荧光联用仪：北京海光仪器公司；真空冷冻干燥机：北京博励行仪器有限公司。1.2 方法1.2.1 菌株活化 将实验室保藏和购买的红曲菌菌株活化，将其均匀涂布接种于PDA平板上，28 恒温培养7 d，观察5株菌株的生长情况，多次传代，待其遗传稳定，进行下一步实验。1.2.2 亚硒酸钠浓度对红曲菌生长曲线的影响 制备含25 mL PDA培养基的培养平板，并使PDA培养基中亚硒酸钠最终浓度分别为0(CK)、10、20、50、100、200 g/mL。用接种铲接种大小均一的菌丝块置于铺有玻璃纸的平板中心点。28 静置培养，分别在菌株培养的第3、6、9、12、15天观察菌落生长状况，用十字交叉法测量菌落直径，绘制红曲菌菌株的生长曲线，表示菌株的耐硒能力。在第15天时收集菌丝体，用真空冷冻干燥机干燥72 h，称重，即得红曲菌菌丝体生物量。1.2.3 富硒红曲菌硒含量的测定 通过测定菌丝体中硒含量来评价硒对红曲菌硒转化的影响。采用GB 5009.932017中氢化物原子荧光光谱法稍作修改测定红曲菌菌丝体的硒含量。称取红曲菌冻干菌丝体，加入7 mL硝酸预消解后进行微波消解。微波消解推荐条件：(1)温度爬坡至120，耗时5 min，温度保持1 min；(2)温度爬坡至150，耗时3 min，温度保持5 min；(3)温度爬坡至200，耗时5 min，温度保持10 min；(4)最后冷却至55，20 min。待消解结束后，将消解罐转移至赶酸仪中赶酸，200 继续加热至溶液变为大约1 mL时结束。待消解罐冷却至室温后，再加5 mL盐酸溶液(6 mol/L)，轻轻晃动至盐酸和消化液充分混合，再次放入赶酸仪中180 赶至1 mL左右，待还原结束并冷却至室温后，转移至容量瓶中定容后，原子荧光光度仪待测。仪器条件：光电倍增管负高压为295 V；硒空心阴极灯电流：80 mA；原子化器高度：8.0 mm；氩气流速：载气300 mL/min，屏蔽气800 mL/min；读数延迟时间：8.0 s；读数时间：12.0 s；清洗时间：15.0 s。以10%盐酸为载流，2%硼氢化钾和0.5%氢氧化钠溶液为还原剂，测定0、2、4、6、8、10 g/L硒标准品溶液的荧光强度，以硒含量为横坐标、荧光强度为纵坐标绘制标准曲线。样品(稀释需用10%盐酸)和空白测定方法同上，将样品和空白的荧光强度代入标准曲线中，计算样品硒含量，计算公式如下所示。X=(0).V/(m1000)式中：X为试样中硒含量，g/g或g/mL；为试样溶液中硒的质量浓度，g/L；0为空白溶液中硒的质量浓度，g/L；V为试样消化液总体积，mL；m为试样称样量或移取体积，g或mL。1.2.4 富硒红曲菌总硒产量的测定 总硒产量即为25 mL PDA固体平板培养基培养下菌丝体生物量与硒含量的乘积，计算公式如下所示。Y=M.X式中：Y为试样中硒含量，g；M为菌丝体生物量，g；X为试样中硒含量，g/g。1.2.5 数据处理与统计分析 实验数据结果均采用平均值标准差表示，各项指标采用IBM SPSS Statistics 27统计分析软件进行单因素方差分析(ANOVE，P0.05)，用Origin 2018 64 Bit软件进行绘图。实验数据均重复3次。2 结果与分析2.1 不同红曲菌菌株的耐硒能力分析不同亚硒酸钠浓度下5株红曲菌菌株(M7、HY1、41649、41601、5046)的生长情况随时间变化曲线见图1，可以看出，不同红曲菌菌株在不同亚硒酸钠浓度培养基下长势差异较大。对5046、HY1、41649菌株来说，相比于对照组，加入低浓度亚硒酸钠反而有促进菌丝体生长的现象。由5046菌株生长曲线(图1E)可知，培养基中亚硒酸钠浓度为10、20 g/mL时对菌落生长有明显的促进作用，此时HY1菌株基本上与空白对照平齐生长(图1B)，而41649菌株的菌落直径只有在培养基中亚硒酸钠浓度为10 g/mL时略高于 4 食 品 科 技FOOD SCIENCE AND TECHNOLOGY生物工程2023年 第48卷 第04期空白对照(图1C)。对于菌株M7和41601来说，未加入亚硒酸钠溶液的空白对照组生长较快，其中M7菌株空白组形成的菌落直径最大为(65.70.5)mm。随着亚硒酸钠浓度的增加，菌落生长明显减慢，说明高浓度的亚硒酸钠对菌株生长有一定的抑制作用，菌丝体蔓延生长时受到外界环境的阻碍。当培养基中亚硒酸钠浓度增加到50 g/mL时，5046菌株生长前期的菌落直径与不加硒的空白对照组基本保持一致且在第12天达到(50.83.8)mm，在培养15 d时菌落直径(53.81.5)mm)仅比不加硒的空白对照组小5.6 mm，说明5046菌株在该浓度下的耐硒能力最强。培养基中亚硒酸钠浓度为50 g/mL时，耐硒能力其次的菌株为M7，因为M7菌株在前9 d的菌落直径与空白对照保持平行生长趋势，达到(35.50.9)mm，在第15天时(40.51.9)mm)低于空白组25.2 mm。此浓度下耐硒能力最差的菌株是HY1。综合考虑，5046菌株在富硒平板培养基中长势最好，其菌落直径大，且生长较快、菌丝浓密，在5株菌株中的耐硒能力最强；M7菌株次之，HY1菌株耐硒能力最差。低浓度亚硒酸钠对红曲菌菌株生长影响不大甚至有促进作用，这与文献中M.purpureus M12菌株未富硒驯化结果相似15。因为随着时间的延长，菌株适应低浓度亚硒酸钠环境后便会继续生长。但对于高浓度亚硒酸钠，红曲菌的生长受到显著抑制，影响到菌丝体形态，造成菌丝延展受限，极大抑制菌落生长。超高亚硒酸钠浓度(100 g/mL)下的5株红曲菌株的生长受限甚至未见菌落生长。可能的原因是亚硒酸钠浓度的增加会导致毒性的增加，并通过产生活性氧、脂质过氧化和硫代谢降低来改变生物体的生长16-17，不同浓度的硒对红曲菌生长的抑制可能与菌株的种类和抗氧化能力有关18。2.2 亚硒酸钠对红曲菌生物量的影响生物量是反映红曲菌菌株生长状况的重要指标。由5株菌的生物量(表1)可知，不同菌株在相同亚硒酸钠浓度下菌丝体生物量均不同，且同一种菌株在不同亚硒酸钠浓度下菌丝体生物量也不一致。对于红曲菌HY1、41649、41601和5046来图1 不同亚硒酸钠浓度下红曲菌M7(A)、HY1(B)、41649(C)、41601(D)和5046(E)的生长曲线036912151801020304050607080菌落直径/mm时间/d036912151801020304050607080时间/d036912151801020304050607080时间/d036912151801020304050607080时间/d036912151801020304050607080时间/d 0 g/mL 10 g/mL 20 g/mL 50 g/mL 100 g/mL 200 g/mLABCDE 0 g/mL 10 g/mL 20 g/mL 50 g/mL 100 g/mL 200 g/mL 0 g/mL 10 g/mL 20 g/mL 50 g/mL 100 g/mL 200 g/mL 0 g/mL 10 g/mL 20 g/mL 50 g/mL 100 g/mL 200 g/mL 0 g/mL 10 g/mL 20 g/mL 50 g/mL 100 g/mL 200 g/mL菌落直径/mm菌落直径/mm菌落直径/mm菌落直径/mm 5 生物工程食 品 科 技FOOD SCIENCE AND TECHNOLOGY2023年 第48卷 第04期说，加入不同浓度亚硒酸钠均会使菌丝体生物量减少，说明亚硒酸钠对菌株生长的抑制作用较强，抑制菌丝体生长而导致菌丝体生物量减少。对于M7菌株来说，加入10 g/mL亚硒酸钠反而有促进菌丝体生物量增加的趋势，达到0.164 g，比对照组增加了9.33%，表明M7菌株对无机硒可能具有一定的耐受性且强于其他4株红曲菌。总的来说，低浓度亚硒酸钠对菌丝体生物量影响不大；随着培养基中亚硒酸钠浓度的增加，所有菌株菌丝体生物量均开始下降，当培养基中亚硒酸钠浓度为50 g/mL时，所有菌株的生物量均受到显著抑制(P0.01)。硒是细胞内过氧化氢酶等氧化酶活性中心的组成成分，高浓度的亚硒酸钠会抑制菌丝体细胞内部分酶的活性19，从而抑制了菌株的生长。2.3 硒标准曲线的绘制以硒含量(x)为横坐标、荧光强度值(y)为纵坐标绘制硒标准曲线，结果见图2。硒产量。硒含量反映红曲菌对硒的吸收能力，5株富硒红曲菌株硒含量测定结果如图3A所示，不同菌株受硒的影响有明显差别，菌丝体的硒含量随培养基中添加的亚硒酸钠浓度增加而升高。由增长趋势可以判断出M7菌株的增长趋势最为显著，在培养基亚硒酸钠浓度为100 g/mL和200 g/mL时，M7菌株的硒含量分别达到了(2679.7157.93)g/g和(3120.59193.63)g/g，分别比10 g/mL亚硒酸钠浓度时的硒含量高出6.62倍和7.67倍，显著高于其他菌株(P0.01)，说明M7菌株的富硒能力很强，对硒的利用和转化率很高。综合考量得出M7菌株能够在保持较大生物量的基础上实现较高的富硒量，是1株富硒能力较强的优势菌株。有文图2 硒标准曲线图3 不同亚硒酸钠浓度下五株红曲菌的硒含量和总硒产量y=197.7x+12.395R2=0.999905001000150020002500024681012荧光强度值硒含量/(g/g)01020501002000500100015002000250030003500edcbbdcccbbbcbdaaabcdcbaa硒含量/(g/g)亚硒酸钠浓度/(g/mL)a0102050100200020406080100120140160ccbbbabbaccbbaabbaabcbba总硒产量/gaB A M7 HY1 41649 41601 5046亚硒酸钠浓度/(g/mL)M7 HY1 41649 41601 5046表1 不同亚硒酸钠浓度对不同红曲菌菌株生物量的影响亚硒酸钠浓度/(g/mL)M7HY14164941601504600.1500.014aC0.1510.005aBC0.1660.007aAB0.1960.018aA0.1510.017aBC100.1640.007aAB0.1410.024aC0.1440.026abB0.1830.011abA0.1130.009bC200.1500.011aAB0.1340.012aB0.1330.025bB0.1760.007bA0.1230.023bB500.1100.011bA0.0640.000bB0.1100.038bA0.1220.002cA0.0880.013cAB1000.0250.009cBC0.0260.001cBC0.0440.018cB0.1160.016cA0.0180.002dD2000.0190.002cB0.0120.002cC0.0200.002cB0.0850.003dA0.0110.002dC注：同行中大写字母表示同一浓度不同菌株之间的显著性差异(P0.05)，同列中小写字母表示相同菌株不同浓度之间的显著性差异(P0.05)。由图2可知，硒标准曲线的回归方程为y=197.7x+12.395，相关系数R2为0.9999，表明二者线性关系良好。2.4 不同红曲菌菌株的富硒能力分析研究不同亚硒酸钠浓度对红曲菌菌株富硒能力的影响，测定冻干后菌丝体硒含量并计算出总 6 食 品 科 技FOOD SCIENCE AND TECHNOLOGY生物工程2023年 第48卷 第04期献表明，M.purpureus M12在不同亚硒酸钠浓度(1090 g/mL)下硒含量为14002000 g/g15，低于相同亚硒酸钠浓度下M7菌株的硒含量。图3B结果表明，5株红曲菌总硒产量随培养基中亚硒酸钠浓度的增加呈现先上升后下降的趋势，当培养基中硒含量为50 g/mL时，所有红曲菌的总硒产量均达到最高点，此时M7菌株的总硒产量达到(124.432.01)g，显著高于其他4株菌株的总硒产量(P0.01)。不同亚硒酸钠浓度下M7菌株的总硒产量均高于其他菌株，因此，M7菌株是富硒能力最强的菌株。总硒产量随着培养基中亚硒酸钠浓度的增加呈现先上升后下降的趋势，其原因是随着亚硒酸钠浓度的增加，红曲菌菌株M7对硒的富集增加，但超过50 g/mL浓度时，高亚硒酸钠浓度造成环境毒性增加，且内部某些酶活降低20，导致菌丝体生物量下降(表1)，使得总硒产量下降。有研究者得出，M.purpureus M12的最适亚硒酸钠生长浓度为10 g/mL15，而本研究得出总硒产量最高的亚硒酸钠浓度为50 g/mL，可能是由于所用的红曲菌菌株种类以及菌株活性的不同所导致。另外，本研究在亚硒酸钠的无菌处理上采用的是无菌滤膜过滤，而其他研究者采用的是高压灭菌，这也有可能是得出不同研究结果的原因20。本实验室优化发酵条件后的葡萄有孢汉逊酵母富硒培养的最佳硒添加量能达到630 g/mL，总硒产量达到了1778.61 g/100 mL培养基7。葡萄有孢汉逊酵母比本实验红曲菌的耐硒能力、生物量和富硒能力都要高，原因可能是该酵母菌由富硒土壤中筛选，对硒的耐受能力强，而且酵母菌将亚硒酸钠转化成纳米硒的速度会更快。3 结论由于自然界中细菌、真菌和其他微生物在好养和厌氧条件下都可以进行还原合成反应21，当微生物生长环境中无机硒浓度较高时，它不仅会在胞内转化成有机硒，而且有一部分会被还原成单质硒，且红曲菌可以将亚硒酸钠转化成纳米硒22。目前，对富硒酵母和植物的关注较多，而对传统食用丝状真菌的关注较少。本研究通过红曲菌菌株种类、亚硒酸钠浓度和菌落直径3个方面，从5株红曲菌中筛选出耐硒能力和富硒能力最强的菌株，得出如下结论：亚硒酸钠对5株红曲菌(M7、HY1、41649、41601和5046)的生长、菌丝体生物量、硒含量和总硒产量均有一定程度的影响。就红曲菌生长和菌丝体生物量来说，低硒对其生长和菌丝体生物量的影响不大，随着时间的延长，菌株适应低浓度亚硒酸钠环境后便会继续生长。但高硒环境影响菌丝体形态，极大抑制了菌落生长，导致其菌丝体生物量减少，这是因为高浓度亚硒酸钠的毒害作用破坏了菌丝体结构的完整性，从而导致收缩和破裂现象23。最终筛选出的耐硒能力最强的菌株为紫色红曲菌CICC 5046。硒会随着亚硒酸钠浓度的增高而富集在菌丝体内，但由于菌丝体生物量减少，总硒产量会呈现先升高再降低的趋势，最终筛选出富硒能力最强的菌株为红色红曲菌M7。研究表明，红曲菌对亚硒酸钠具有一定的硒富集作用，使其成为良好的有机硒载体，进一步提高了红曲菌的应用价值。参考文献：1殷娴,邵蕾娜,廖永红,等.微生物富集有机硒研究进展J.食品与发酵工业,2021,47(5):259-226.2ALEHAGEN U,AASETH J,ALEXANDER J,et al.Supplemental selenium and coenzyme Q10 reduce glycation along with cardiovascular mortality in an elderly population with low selenium status-a four-year,prospective,randomised,double-blind placebo-controlled trialJ.Journal of Trace Elements in Medicine and Biology:Organ of the Society for Minerals and Trace 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