脂多糖诱导黑龙江林蛙炎症损伤中抗氧化机制的研究.pdf

中国预防兽医学报Chinese Journal of Preventive Veterinary Medicine第45卷 第7期2023年7月Vol.45，No.7Jul.2023doi院10.3969/j.issn.1008-0589.202212020脂多糖诱导黑龙江林蛙炎症损伤中抗氧化机制的研究刘依铭，许冬梅，楼柏丹*，刘玉芬，刘鹏，赵文阁(哈尔滨师范大学 生命科学与技术学院，黑龙江 哈尔滨150025)摘要：为探究在细菌脂多糖(LPS)诱导下，黑龙江林蛙()抗氧化酶活性的变化，以及铁蛋白重链亚基基因(Ferritin-H，Fer-H)参与林蛙机体抗氧化反应的作用机制，本研究以1 mL/只LPS溶液(1 mg/mL)腹腔注射黑龙江林蛙，构建LPS诱导的黑龙江林蛙炎症模型，诱导后各时间点(6 h、24 h、48 h、72 h和120 h)采集组织样品，采用HE染色法观察各组织病变，结果显示，LPS诱导下黑龙江林蛙的肝脏、皮肤以及肌肉组织均出现了损伤，LPS诱导的林蛙炎症模型可以用于后续实验。利用相应的活性测定试剂盒对采集LPS诱导后各时间点林蛙各组织中的超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)以及谷胱甘肽过氧化物酶(GSH)等抗氧化酶活性检测，同时采用荧光定量PCR检测黑龙江林蛙各组织中Fer-H基因转录水平的变化。抗氧化酶活性检测结果显示，和未加LPS的对照组相比，LPS诱导后黑龙江林蛙各组织中SOD、CAT的活性均极显著升高(0.01)，而GSH活性极显著下降(0.01)；荧光定量PCR检测结果显示，和对照组相比，在LPS诱导后黑龙江林蛙各组织中的Fer-H基因转录水平均极显著上调(0.01)。综上所述，各组织Fer-H基因会通过上调其转录水平参与林蛙的抗氧化应激反应。本研究首次验证了LPS诱导下黑龙江林蛙各组织会出现氧化损伤，并为探究Fer-H基因与两栖类动物抗氧化反应之间的关系奠定了基础。关键词：黑龙江林蛙；脂多糖；氧化应激；铁蛋白H亚基基因中图分类号：S852.4文献标识码：A文章编号：1008-0589(2023)07-0744-06Study on the antioxidant effect ofinducedby LPS in inflammatory damageLIU Yi-ming,XU Dong-mei,LOU Bai-dan*,LIU Yu-fen,LIU Peng,ZHAO Wen-ge(Life Science and Technology,Harbin Normal University,Harbin 150025,China)Abstract:In order to explore the mechanism of the Ferritin heavy chain subunit gene(Fer-H)ofparticipatingin the bodys antioxidant response under the induction of lipopolysaccharide(LPS),LPS-induced inflammation model ofwas established.1 mL LPS solution(1 mg/mL)was intraperitoneally injected into Heilongjiang wood frogs.After 6 hours,24 hours,48 hours,72 hours,and 120 hours of induction,samples were collected and HE staining was performed to observe thetissue lesions.The results showed that the liver,skin and muscle tissues of Heilongjiang forest frog were damaged underLPS-induced treatment,thus the LPS-induced forest frog inflammation model was proved feasible.The activities of antioxidantenzymes such as superoxide dismutase(SOD),catalase(CAT)and glutathione peroxidase(GSH)in tissues was measured,thechanges of transcription level of Fer-H gene in different organs were detected by fluorescence quantitative PCR.Compared with收稿日期：2022-12-17基金项目：黑龙江省自然科学基金联合引导项目(LH2021C053)作者简介：刘依铭(1998-)，女，黑龙江哈尔滨人，硕士研究生，主要从事脊椎动物学研究.*通信作者：E-mail：*Corresponding authorthe control group,the activities of SOD and CAT in the treatment group increased significantly(0.01),while the activities ofGSH decreased significantly(0.01).The results of fluorescence quantitative PCR showed that the transcription level of Fer-Hgene was significantly up-regulated after LPS induction(0.01).In summary,LPS-induced oxidative damage occurred in,and the Fer-H gene would participate in the antioxidant stress response by up-regulating its transcription level.This studylays a foundation for exploring the relationship between Fer-H gene and amphibian antioxidant response.Key words:;LPS;oxidative stress;ferritin H subunit gene目前分布在世界各地的林蛙大约有30种，黑龙江省见报道的有中国林蛙、黑龙江林蛙()和东北林蛙等，其中黑龙江林蛙是黑龙江省的优势两栖物种1。其不仅具经济价值，还对林区生态系统具有调控作用。近年来国家大力发展对林蛙的保护工作，支持对林蛙人工养殖，但养殖过程中出现传染性疾病，常对个体经营者造成了严重损失。脂多糖(Lipopolysaccharides，LPS)也称内毒素，是所有革兰氏阴性细菌细胞外膜的重要组成部分；LPS不仅可以在细菌周围形成屏障以利于自身的增殖，还可以诱导宿主细胞释放细胞因子，导致免疫级联反应发生2。并且LPS可以用于研究药物等对机体的氧化应激、炎症反应和肝损伤保护作用等的实验模型中3-5。铁蛋白(Ferritin，Fer)是细胞维持铁稳态最常见的分子，普遍存在于动植物以及细菌中6。多数真核生物均具有两种铁蛋白基因，分别编码铁蛋白的重链(Ferritin heavy chain，Fer-H)和轻链(Fer-ritin light chain，Fer-L)亚基，其中H亚基能主动氧化和隔离铁，与机体的抗氧化应激相关并可以作为急性期反应蛋白参与机体的免疫应答，而L亚基铁存储功能较强7。由于铁是微生物生长和维持其致病性的必要元素，当病原体感染宿主并粘附在细胞表面时，宿主细胞会通过调控铁蛋白的表达调节铁离子的浓度，抑制病原体的增殖8；另外也有研究指出，在脊椎动物中，铁蛋白的合成也会受到促炎细胞因子或LPS的调控，例如鱼类被细菌感染后，铁蛋白的H亚基会表达上调等9-10。为了研究LPS诱导后黑龙江林蛙铁蛋白的表达及其在黑龙江林蛙机体抗氧化机制中的作用，本研究首先利用LPS诱导黑龙江林蛙建立炎症反应模型，对其肝脏等组织进行病理学观察；分析LPS诱导后黑龙江林蛙组织中3种抗氧化酶活性变化以及Fer-H基因转录水平的变化，为探究该基因参与抗氧化反应的机制提供参考依据。1材料与方法1.1实验动物及主要实验材料30只黑龙江林蛙(16依2 g)购自人工养殖场，在实验室适应一周后在遵循动物实验伦理学要求下进行相应操作(哈尔滨师范大学动物实验伦理批准书：No.HNUARIA2021002)。LPS购自索莱 宝(Solarbio)(北 京)科技 有限 公司；TRIzol试剂盒、反转录试剂盒、胶回收试剂盒、DNA聚合酶、DL2000 DNA Marker、PCR Buffer和dNTPMix，RNAisolaterTotalRNAExtractionReagent、HiScriptQRTSuperMixforqPCR(+gDNA wiper)和ChamQ Universal SYBR qPCR Mas-ter Mix，均购自南京诺唯赞(Vazyme)生物科技有限公司；总蛋白浓度(TP)、超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)以及谷胱甘肽过氧化物酶(GSH)活性测定试剂盒，均购自南京建成科技有限公司。1.2实验分组与设计取黑龙江林蛙30只，随机均分为实验组和对照组。根据预实验以及参照文献11-12，实验组以1 mL/只(1 mg/mL)对黑龙江林蛙腹腔注射LPS溶液，对照组黑龙江林蛙注射等量LB液体培养基。分别在诱导后6 h、24 h、48 h、72 h和120 h无菌采集两组黑龙江林蛙的肝脏、脾脏、肾脏、皮肤和肌肉组织样品，每个时间点各取3只，用于后续试验。1.3黑龙江林蛙LPS炎症模型的建立参考文献13方法，将采集注射LPS 6 h和24 h后各组黑龙江林蛙的肝脏、皮肤和肌肉组织置于中性甲醛缓冲液中固定，经75%乙醇脱水后石蜡包埋、切片、脱蜡复水、梯度脱水和透明后HE染色，中性树胶封片，经显微镜观察各组织病变情况，确认黑龙江林蛙LPS炎症模型是否可行。1.4LPS诱导后黑龙江林蛙各组织抗氧化酶活性测定取1.2中各时间点采集的各组黑龙江林蛙肝脏、皮肤和肌肉组织样品，分别加入9倍生理盐水组织刘依铭，等.脂多糖诱导黑龙江林蛙炎症损伤中抗氧化机制的研究第7期745匀浆后，3 500 r/min离心15min，取上清液，加入等体积生理盐水备用。利用相应试剂盒检测各组林蛙各组织样品中TP、SOD、CAT以及GSH活性，试验设置3次重复。1.5各组 林蛙各 组 织 中 Fer-H 基 因 转 录 水 平 的qPCR测定参考GenBank中登录的黑龙江林蛙Fer-H基因序列(ON815294)，通过Primer Premier 5.0软件设计qPCR引物Fer-H-q-F：5-TTCCTCCACGCTGGTTCT-3/Fer-H-q-R：5-CAATCGGCAGGTCAATCT-3。内参茁-actin基因采用文献14中相应引物。利用TRIzol试剂分别提取1.2中各时间点各组黑龙江林蛙的各组织总RNA，反转录为cDNA后作为模板，采用引物Fer-H-q-F/R，通过qPCR检测Fer-H基因转录水平。反应 程 序 按 照ChamQ Univer-sal SYBR qPCR MasterMix说明书进行，试验设置3次重复，通过2-驻驻CT法计算Fer-H基因相对茁-actin基因的转录水平。1.6数据的统计与分析实验数据均以平均值依标准差(依)形式表示。采用SPSS 26.0处理各组实验数据，通过单因素方差分析法(One-way ANOVA)比较两组各试验数据间的差异，统计学意义为0.01或0.05。利用GraphPad Prism 8软件作图。2结果2.1黑龙江林蛙LPS炎症模型的建立对黑龙江林蛙肝脏、皮肤和肌肉组织切片经显微镜观察可见，与对照组相比，实验组林蛙3种组织均发生了明显的病理改变。注射6 h和24 h后，实验组肝脏组织出现明显的细胞空泡性样变、细胞间隙增大、黑色素巨噬细胞以及血窦分布均增多的病变(图1A图1C)；在皮肤组织中，实验组林蛙出现了细胞间界限不清，皮肤整体结构松散的病变，腺泡腔内充满大量红细胞(图1D图1F)；肌肉组织中实验组林蛙可观察到组织的肌间隙变宽，肌纤维纹理紊乱、变形和崩裂的现象(图1G图1I)。表明LPS诱导的黑龙江林蛙炎症模型成功建立，可用于后续试验。A：对照组肝脏组织；B：LPS组6 h肝脏组织；C：LPS组24 h肝脏组织；D：对照组皮肤组织；E：LPS组6 h皮肤组织；F：LPS组24 h皮肤组织；G：对照组肌肉组织；H：LPS组6 h肌肉组织；I：LPS组24 h肌肉组织*：肝血窦；上箭头：巨噬细胞；右箭头：红细胞A:Liver tissue in control group;B:Liver tissue after 6h induction in LPS group;C:Liver tissue after 24h induction in LPS group;D:Skin tissue of control group;E:Skin tissue after 6h induction in LPS group;F:Skin tissue after 24h induction in LPS group;G:Muscle tissue of control group;H:Muscle tissue after 6h induction in LPS group;I:Muscle tissue after 24h induction in LPS group*:Liver sinusoids;Up arrow:Macrophages;Right Arrow:Red blood cells图1LPS诱导后黑龙江林蛙组织病变观察2.2LPS诱导后黑龙江林蛙组织抗氧化酶活性的检测结果LPS诱导后黑龙江林蛙各组织抗氧化酶活性检测结果显示，相较于对照组，实验组林蛙的肝脏、皮肤和肌肉组织的SOD活性基本呈现先升高后降低的趋势(图2A)。肝脏组织中SOD活性在LPS诱导6 h后达峰值，显著高于对照组37.51%(0.01)，其后一直降低，至72 h时最低，显著低于对照组5.66%(0.01)；皮肤组织中SOD活性虽然也是先升高后降低，但在诱导120 h后才达峰值，显著高于对照组144.38%(0.01)；肌肉组织SOD活性在诱导72 h后达峰值，显著高于对照组17.87%(0.01)，在48 h最低，是对照组的90.62%(0.01)。实验组林蛙肝脏组织中CAT各活性变化趋势与SOD相似(图2B)，在诱导6 h后极显著高于对照组85.97%(0.01)，至120 h时仍极显著高于对照组15.91%(0.01)；皮肤组织在LPS诱导48 h后CAT活中 国 预 防 兽 医 学 报2023年746ABCDEFGHI刘依铭，等.脂多糖诱导黑龙江林蛙炎症损伤中抗氧化机制的研究第7期747图3LPS诱导后黑龙江林蛙各组织中Fer-H转录水平变化*:0.05;*:0.01.The same as below.图2黑龙江林蛙肝脏、皮肤和肌肉组织抗氧化酶活性Time(hour)ABCDE性达峰值，是对照组的144.02%，随后活性降低，至72 h时趋于稳定，120 h时活性最低，是对照组的79.13%(0.01)；肌肉组织CAT活性虽然在LPS诱导24 h内呈现先升高后降低的趋势，但在48 h后又出现了小范围上调，因此肌肉组织中的CAT活性在LPS诱导24 h时最低，72 h时最高，分别为对照组的116.06%(0.05)和220.81%(0.01)。实验组GSH活性的变化完全不同于SOD与CAT，各组织GSH活性在各时间点均低于对照组(图2C)。其中肝脏组织在诱导120 h后GSH活性最低，极显著低于对照组31.17%(0.01)；皮肤组织在诱导72 h时最低，低于对照组71.64%(0.01)；肌肉组织则在诱导48 h后，GSH活性降到最低值，低于对照组61.89%(0.01)，至72 h有短暂升高，至120 h又回落至与48 h持平，但仍低于对照组60.39%(0.01)。结合2.1结果及上述结果表明，LPS诱导后造成黑龙江林蛙组织氧化损伤，从而启动机体抗氧化防御系统(Active oxygen species，AOS)防止、中和并清除体内的有害毒物，其中首先通过上调该系统中SOD活性来应对机体的炎症损伤。2.3LPS诱导后黑龙江林蛙各组织中Fer-H基因转录水平检测结果LPS诱导后黑龙江林蛙Fer-H基因在肝脏、脾脏、肾脏、皮肤以及肌肉组织中转录水平均上调。肝脏中Fer-H基因从诱导6 h后开始升高，至72 h达到峰值，为对照组的13.43倍(0.01)，随后降低，120 h时仍高于对照组6.26倍(0.01)(图3A)；脾脏中Fer-H基因在诱导后6 h即达到峰值，为对照组的19.01倍，随后开始下降，至48 h略有回升，高于对照组15.36倍，其后一直下降，至120 h时为对照组的8.19倍(0.01)(图3B)；在肾脏中，Fer-H基因的转录趋势呈现先升高后降低，在诱导后48 h达到最高值，高于对照组13.31倍，120 h时下降到对照的9.79倍(0.01)(图3C)；皮肤和肌肉组织中Fer-H基因转录水平在LPS诱导6 h120 h均呈现持续下降的趋势，但仍显著高于对照组，且其在两种组织中均于诱导6 h后达到峰值，皮肤组织为对照组的26.00倍(0.01)，肌肉组织则为对照组的15.42倍(0.01)(图3D、图3E)。上述结果表明，LPS诱导黑龙江林蛙氧化应激过程中，机体通过调控Fer-H基因转录防止过量的活性氧对机体造成损伤。Time(hour)Time(hour)Time(hour)Time(hour)Time(hour)Time(hour)Time(hour)302010040302010050403020100LiverSkinMusscle120724824601207248246012072482460201510542012072482461207248246120724824612072482461207248246ControlLPS252015101052102015105420201510521030201021012343讨论本实验为了研究LPS诱导后黑龙江林蛙铁蛋白基因的表达及其在机体抗氧化机制中的作用，需要建立LPS诱导的黑龙江林蛙炎症模型。LPS作为革兰氏阴性菌细胞壁的主要成分，本研究将LPS诱导黑龙江林蛙后使其肝脏组织发生了明显的空泡化现象，还出现了大量黑色素巨噬细胞，推测肝组织发生明显的炎症应答。有研究表明，肝功能在细菌感染的免疫应答中发挥重要作用，可以作为宿主健康状况的一种新的生物标志物15。同时黑龙江林蛙还出现了皮肤组织结构松散，肌纤维变形、断裂等现象。研究发现大鲵蛙病毒(CGSRV)感染也会导致大鲵多组织器官损伤,其中肝、皮肤和肌肉病变严重,是损伤的主要靶器官16。本研究组织病变观察结果和上述病毒攻击两栖类物种造成的组织损伤现象基本一致，从组织病理学角度印证了LPS能够对黑龙江林蛙造成炎症损伤，证明LPS诱导的黑龙江林蛙炎症模型构建成功，可以用于后续实验。机体在氧化反应中会产生活性氧(Reactive oxy-gen species，ROS)，为了免受ROS的负面影响，机体会利用其AOS阻止、中和并清除体内的有害毒物17-18。AOS由SOD、CAT以及GSH等组成，是传统的氧化应激标记物19。研究表明，SOD是应对抗氧化应激的第一道防线，CAT的作用则是保护细胞免受过氧化氢引起的氧化应激20。本研究结果显示LPS诱导的林蛙各组织SOD与对照组相比均显著升高，这与鲶鱼感染嗜水气单胞菌后鳃、肝、肠和肾组织SOD活性均升高的研究结果一致21；类似的鲤鱼在感染嗜水气单胞菌后，肠道组织SOD活性也显著升高22。研究发现两栖类与鱼类相比，两栖类动物对环境中化学物质的敏感性更强，尤其是北方两栖类物种23。本实验中LPS造成了黑龙江林蛙各组织的氧化损伤，且黑龙江林蛙首先通过上调SOD活性来应对这种损伤。本实验中CAT活性变化趋势与SOD接近，这与钝口鲷和南亚野鲮鱼遭到细菌侵染后CAT活性均显著升高的研究结果基本一致24-25。表明LPS对黑龙江林蛙造成了一定的氧化损伤，使其产生了过量的ROS，因此机体通过提高CAT的活性来应对这种氧化应激。GSH是体现脊椎动物抗氧化能力的重要指标，其可以降解H2O2，对维持细胞膜结构和功能的完整性有重要作用26。Shi等对牛乳腺上皮细胞进行LPS诱导后发现其GSH活性显著降低27，这与上述研究结果基本一致。有研究显示，氧化应激和炎症反应均可以促进铁蛋白基因的转录28。此外，ROS的产生是机体对抗感染的关键反应，但过量的ROS也会对机体造成损伤，铁蛋白可以通过H亚基结合游离的Fe2+，使其不能大量催化芬顿反应产生ROS，进而缓解机体的氧化应激反应，因此Fer-H基因转录的变化是感染过程中的重要指标29-30。本实验中Fer-H基因的转录水平在LPS诱导后的黑龙江林蛙5种组织中均显著上调(0.01)，但达到峰值的时间有所差别，这与杂交鲫鱼遭受细菌侵染后Fer-H基因发生在在肝、肾和脾脏组织中的变化一致31。研究发现，将病毒感染凡纳滨对虾后，向其注入重组铁蛋白，然后测定病毒载量，发现处理组凡纳滨对虾病毒载量低于对照组32。推测黑龙江林蛙与鱼类以及虾科动物相似，在遭受到外界致病因素侵袭后，均会通过提高Fer-H基因转录水平对抗炎症反应，缓解氧化应激，对抗氧化损伤。另有研究表明，LPS可以诱导铁蛋白表达，从而降低游离铁含量，平衡氧化应激反应33。在本实验中抗氧化酶活性与Fer-H基因转录水平在LPS诱导后均发生了变化，但二者间的作用机制以及Fer-H基因在两栖动物机体抗氧化损伤时发挥作用的具体机制还需进一步探究。本研究采用LPS腹腔注射黑龙江林蛙构建了黑龙江林蛙炎症模型，首次证实LPS可引发机体抗氧化反应，使抗氧化酶活性与Fer-H基因的转录水平均发生了改变，该结果为深入探究Fer-H基因与抗氧化反应之间的关系和作用机制提供了参考。参考文献：马逸清，程继臻.黑龙江省动物地理分布J.林业勘查设计，1995，(4)：28-33.邢波建，景一明，王权锜，等.LPS诱导下鹅TLR15及相关免疫因子的表达分析J.中国预防兽医学报，2020，42(7)：701-705.ABDEL-MAGEID 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