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鸡蛋卵白蛋白酶解物抗氧化肽研究 摘要鸡蛋是人类摄取营养物质的一种重要来源，几乎包含了胚胎发育所需 的所有蛋白质、脂质、维生素、矿物质和生长因子。鸡蛋中的蛋白质主要存在于 蛋清和蛋黄中，其中蛋清蛋白的种类和含量最为丰富。卵白蛋白是蛋清中的主要 蛋白质，占蛋清蛋白质的54%,是获得生物活性肽的很好资源。本文以鸡蛋卵白蛋 白为对象，采用生物酶解、抗氧化试验、离子色谱、反相高效液相色谱、电喷雾 质谱等方法，系统研究了酶水解各主要参数，酶解物抗氧化活性，抗氧化肽的分 离纯化和结构表征，为开发鸡蛋抗氧化肽产品提供理论基础.主要结果如下：1.获得了简便、快速、高纯度的鸡蛋卵白蛋白提取工艺路线。采用Q-Seph a ros e F户阴离子色谱法对鸡蛋卵白蛋白进行分离.通过对蛋清上样量、缓冲液pH值、缓冲液浓度和洗脱液离子强度等优化试验，获得的工艺条件为：鸡蛋蛋清用2倍 的水稀释，将其pH调至69沉淀去除卵粘蛋白，40mLQ-Seph a ros e FF阴离子柱分 离，蛋清上样量140mL,用0.15mol/LpH8.0的Na CI水溶液洗脱，可获得1058mg 卵白蛋白，卵白蛋白的得率为55%,经反相高效液相色谱检测纯度为92%。2.以羟自由基清除率为指标，研究了胃蛋白酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶水 解鸡蛋卵白蛋白所得醉解物的抗氧化活性.研究表明胃蛋白麻的醉解物羟自由基 清除率最高.3.确定了酶解物羟自由基清除率240%的酶解条件,采用响应曲面分析法对 底物浓度S、胃蛋白酶添加量E、酶解时间进行分析，建立了回归模型，确定了 酶解条件，即底物浓度2.22%.3.76%、酶添加量8738.24u/g-I1176.63u/g、水解时 间 4.05-7.77h.4.首次采用多种抗氧化活性试验，全面研究了鸡蛋卵白蛋白酶解物的抗氧化 活性。体外试验结果表明：酶解物对碱性邻苯三酚自氧化产生的超氧阴离子、Fenton 反应产生的羟基自由基、亚油酸氧化体系中亚油酸的氧化均有明显的抑制作用，且呈现一定的量效关系。5mg/mL的鸡蛋卵白蛋白酶解物，对超氧阴离子的抑制率 为45%,对羟基自由基清除率为56%,对亚油酸辄化的抑制能力相当于0.2mg/mLVE 的抑制能力，均显著高于同浓度的卵白蛋白的抑制能力(p0,05).D-半乳糖复 制衰老小鼠模型的体内抗氧化试验的研究结果表明：高、中剂量的鸡蛋卵白蛋白 酶解物能极显著抑制衰老小鼠血清和肝脏中SOD、GSH-P x、CAT和TA0C活性的 下降(p0.01)；同时能极显著降低衰老小鼠血清和肝脏MDA的水平(p0,05.探讨了不同分子量的鸡蛋卵白蛋白酶解物的抗氧化活性.酶解物用三种不 同的超滤膜(MWCO 10,5a nd3k Da)分成四个组分。各个组分显示出不同的抗氧 化活性，其中分子量小于3 k Da的组分最强.6.用离子交换色谱和反相高效液相色谱分离获得了三种鸡蛋卵白蛋白抗氧化 肽.采用Q-Seph a ros cFF离子交换层析法对低分子量酶解物进行分离，分级等度洗 脱，共获得5个组分(OP Ql,OP Q2,OP Q3,OP QOP Q5)。再将抗氧化能力最强的 OP Q3组份用反相高效液相色谱分离纯化，获得了四个肽，其中OP Q3-1、OP Q3-2 和OP Q34具有较强的抗氧化能力，对羟自由基的清除率分别达到78.6%、81.8%和 82.3%.7.采用ES1-MS/MS,对反相高效液相色谱分离纯化获得的3个抗氧化能力较 强的鸡蛋卵白蛋白抗氧化肽的氨基酸序列进行了测定。OP Q3-1的分子量为408.14 Da,由3个旗基酸残基按序列P ro-Gh i-Ty r组成：OP Q3-2的分子量为473.19Da,由4 个矍基酸残基按序列Leu-P ro-As p-Glu组成；OP Q3-4的分子量为433.18Da,由3个氨 基酸残基按序列Trp-Va l-Glu组成。这三个肽分别来源于鸡蛋卵白蛋白第115117、245248和148/50氨基酸残基，均属首次从卵白蛋白中分离获得的抗氧化肽.关键词 鸡蛋卵白蛋白 醐解 抗氧化肽 分离纯化 抗氧化活性ii血n Antioxdation Peptides of Hydrolysates from Hen Egg Ovalbumin Abstrac t:Th e h en egg is a n importa nt s ou rce of dieta ry nu trients for h u ma n beings,conta ining a ll of th e proteins,lipids,vita mins,minera ls a nd grow th fa ctors req u ired by th e developing embry o.Th e ma jority of proteins exis t in egg y olk a nd egg w h ite,a nd th e s pecies a nd contents of egg w h ite proteins a re th e mos t a bu nda nt.Ova lbu min is th e ma jor protein,ma k es u p 54%of th e tota l egg proteins,a nd is a s ou rce of bioa ctivity peptides.In th is s tu dy,ou r objective w a s to inves tiga te h y droly s is pa ra meter of ova lbu min,a ntioxida tive a ctivity of h y droly s a tes,a nd th e s epa ra tion a nd a na ly s is of a nrioxida tive peptides u s ing enzy me h y droly s is,a ntioxda tive a ctivity a s s a y,ion-exch a ng ch roma togra ph y,RP-HP LC a nd ESI-MS/MS.Ou r res u lts la id a th eoretica l fou nda tion fbr th e development a nd u tiliza tion of egg a ntioxida tive peptides.1.A s imple ra pid procedu re of prepa ra tion fbr h igh ly pu rified ova lbu min from h eg egg w h ite w a s obta ined.Q-Seph a ros e FF ion-exch a ngc ch roma togra ph y w a s u s ed to s epa ra te a nd pu rify ova lbu min.Th e res u lts s h ow ed th a t ovomu cin cou ld be precipita ted to remove firom egg w h ite w ith th e condition of egg w h itc/w a ter 1/2(v/v),pH 6.0.Th e s epa ra tion tech nologies of ova lbu min by 40mL Q-Seph a ros e FF colu mn w ere loa ding volu me 140mL of egg w h ite,elu tion w ith Na C1(0.15 mol/L,pH 8.0)a nd 1058mg of ova lbu min w a s extra cted,w ith 55%of recovery ra te a nd 92%of.pu rity ra te.2.Th e a ntioxida tion effects of ova lbu min h y droly s a tes obta ined by peps in,try ps in a nd ch y motry ps in w ere s tu died w ith h y droxy l ra dica l(HO*)s ca venging a ctivity a s th e criterion a nd th e res u lts s h ow ed th a t th e peps in h y droly s a te pres ented ra th er more s ca venging a ctivity a ga ins t h y droxy l ra dica l(HO*)th a n th e oth er tw o enzy ma tic h y droly s a tes.3.Wh en h y droxy l ra dica l s ca venging a ctivity of h y droly s a tes w a s more th en 40%,th e optimu m tech nologies of h y droly s is w ere s et u p w ith res pons e s u rfa ce meth odology(RSM)a nd th ey w ere s u bs tra te concentra tion 2.22%3.76%,enzy me concentra tion 8738.24U-11176.63U/g*pro,h y droiy xing time 4.05-7.77 h.4.Mu lti-meth ods of a ntioxida tion tria ls w ere firs tly u s ed to a s s a y th e a ntioxida tion a ctivity of h en egg ova lbu min h y droly s a tes.Th e tes t res u lts in vitro indica ted th a t h y droly s a tes h a d a dis tinctly inh ibitory a ction to s u peroxide a nion(O;)ma de u-a lk a line py roga llic a cid.HO-produ ced by Fenton rea ction,th e oxida tion of linoleic a cid in linoleic a cid a u toxida tion s y s tem,a nd pres ented a pos itive correla tion.Th e inh ibiton ca pa city of h y droly s a tes a ga ins t Oj a nd HO w ere more th a n 45%a nd 56%repectively a t th e concentra tion more th a n 5 mg/mL.Th e a ntioxida tion tes ts in vivo s h ow ed th a t h igh a nd middle concentra tion of h en egg ova lbu min h y droly s a tes cou ld s ignifica ntly(P 0.01)prevented th e a ctivities of SOD,GSH-P x,CAT a nd T-AOC a ga ins t redu cing a nd a ll th ree concentra tion cou ld s ignifica ntly(P 66磷酯歌乙醉胺(ph os ph a tidy lch oline,P C)24 脑磷脂(ph os ph a tidy leth a nola mine,P E)2.8 溶血卵磷脂(ly s oph os ph a h dy lch oline,LP C)0.6 鞘临磷脂(s ph ingomy elin)0.6胆固醒(ch oles terol)5.0 其他(oth ers)1.0碳水合化物(ca rboh y dniies)0.27.0灰分(a s h)1.12表1-2 蛋白中蛋白质的种类及性质Ta ble!-2 Biologica l Aclivilies oEgg Wh ite P roteins成分含最%P I分子量生物学性质45000免疫调节，降血压，血管卵白蛋白(ova lbu min)54 694.5 4.8紧张素抑制功能卵铁传递蛋白(ovotra ns femn)95.8 6.080000抗菌、抗病毒、真由.免 疫调节卵类粘蛋白(ovomu coid)113.9 4.328000丝氨酸蛋白葩抑制剂，免 疫谢节卵粘蛋白(ovomu cin)2-2.94.55.15.5 8.3*1()6抗病毒的血凝集作用卵抑制物 Ovoinh ibitor0.1 1.55.1 5.249000抑制蛋白酶，包括胰蛋白 酶和糜蛋白酪无花果蛋白的抑抑制剂0.055.11270014300-17000抑制蛋白陶，包括木瓜蛋 白陶和无花果蛋白酹 抗的、抗微生物、病毒功溶南海(ly s ozy me)3.4 3.510.5-11能，消炎，免疫调节和免 疫增强，抗癌Globu lins G?4.05.536000Globu lins Gj4.05.845000抗生物素蛋白(a vidin)卯巨球蛋白(ovoma croglobu lin)0.059.5 10.068300结合生物素丝氨酸、半胱氨酸蛋白解0.054.5 4.7900000抑制剂，抗菌，促进伤口 愈合卵糖蛋白0.5 1.03.924400黄素蛋白0.83.9 4.132000 36000结合核黄素1.L2.1卵白蛋白卵白蛋白占蛋清中蛋白质的一半以上，是一种磷酸糖蛋白【叫为电泳性质稍有 不同的三组分Ai、A2和Aj的混合物。Ai含两个磷酸基，A?含一个磷酸基，A3不 含磷酸基,它们之间的比例为85：12：3不支 卵白蛋白是由385个氨基酸组成的 单一肽链，每一个分子有一根糖链，卜端和C-端的氨基酸分别为乙酰甘氨酸和脯 甄酸，有1个双硫键和4个疏基,分子量为45k Da,等电点pH为4.5。在贮藏期 间，卵白蛋白转变成S-卵白蛋白，它是一种耐热蛋白质。从功能上讲，卵白蛋白 具有胶凝作用、起泡作用和乳化特性叫但是卵白蛋白在鸡蛋中的生物学地位至今 不清楚，有学者建议，卵白蛋臼可以作为胚胎发育中氨基酸的一种来源.卵白蛋白具有某些免疫调节的特性，在一定剂量和被修饰的条件下被发 减少肿瘤坏死因子TNF a的释放函。LL2.2溶菌前蛋清中含有丰富的溶菌酶，每个鸡蛋中大约含有0.30.4g。鸡蛋清溶菌施是 等电点为P H10.51L0的碱性蛋白质，在蛋清中也部分地与卵粘蛋白、卵铁传递蛋 白及卵白蛋白结合而存在。蛋清溶菌酶的一级结构是包含有129个氨基酸的多肽 链，分子量为14.4k Da.其中有四对半胱氨酸分别为Cy s-6和Cy s-127、Cy s-30和 Cy s-115、Cy s-64和Cy s80及Cy s76和Cy s-94之间形成共价的横桥。溶菌酶分子构象 中存在着螺旋和折迭。溶菌酶(EC 3.2.I.17)是一种N-乙酰胞壁粘肽水解酶，它可以水解细菌细胞壁 肽聚糖中N乙酰胞壁酸和N-葡萄糖胺之间的B(l-4)糖音键UI抑制G.菌。溶菌萌 在与其他物质如尼辛(Nis in)和EDTA结合的前提下具有抗其他腐败微生物和病源 微生物的特性c叫对溶菌悔化学结构的修饰可以增强其抑制G.菌的活性，Ibra h im 通过晶酰化在溶菌酗分子上添加疏水性基团株耦酸或者在溶菌醐段基端插入一疏 水性多肽增强了溶菌防抗埃希氏杆菌的活性“3。Na k a mu ra在溶菌醐分子中连接 半乳甘露聚精的溶菌酶多糖复合也能增强抗G一菌的活性出2叫目前，溶菌酶已作为食品天然防腐剂在食品加工及贮藏中广泛应用物。另 外，溶菌酶还用于口腔保健与治疗，如添加至牙膏、洗口药和口香糖来预防口腔 细菌引起的牙周炎和预防粘膜感染因川。溶菌酶在某些领域还表现有抗病毒特性，在口腔生物表皮的应用发现其具有预防和控制病毒性皮肤感染的功能，如单纯性 疱疹和鸡疳等因L Lee-Hu a ng的研究表明鸡蛋溶菌酣也有抗HAV(人类免疫缺陷 病毒)型的特性口叫溶菌前还可以作为免疫调节和免疫刺激因子，增强免疫球蛋 白活性，对免疫低下的病人进行调节和恢复免疫应答；作为一种抗癌因子，在有 些实验中能抑制肿瘤的生长，并对肿槽的治疔起到辅助增强的作用.1.123卵铁传递蛋白卵铁传递蛋白家族是一种铁结合蛋白，广泛分布在生物的体液中，具有可逆 性结合铁离子的能力12”鸡蛋中的卵铁传递蛋白是近似于血清传递蛋白的蛋白质，每个分子的2个配位中心可与铁、铜或锌等金属圈子结合，由686个氨基酸残基 构成，分子量为7078k Da,等电点pH为6.7。卵铁传递蛋白的功能是防止铁被微生物利用.并作为铁的运输工具RI。卵铁 传递蛋白具有广谱抗菌作用，包括假单胞杆菌、大肠杆菌、链球菌、金黄色前萄 球菌、肠沙门氏杆菌等因7叫它通过进入细菌的内膜引起离子的选择性渗透和逸 散作用进行抗菌田】。1.1.2.4抗生物素蛋白抗生物素蛋白是具有结合水溶性维生素能力的蛋白质，是一四聚体糖蛋白 4它不含a-螺旋，由128个氨基酸残基组成，分子量为68.3k Da,等电点pH为9.5 lO.Oo它能抑制生物素细菌和酵母菌的生长卬3%抗生物素蛋白已经被用于癌症的 治疗中，对癌细胞的定位和映像都有重要作用，因为抗生物素蛋白能与生物素紧 密结合，与其他免疫疗法的生物素标志药物相比，具有持久性也有学者发现 放射性标记的抗生物素蛋白限制在癌细胞表而，能准确、快速地定位各种肿瘤，减少放射性对其他器官的伤害1叫r.1.2.5卵粘蛋白卵粘蛋白占鸡蛋蛋清蛋白2%2.9%。它是呈纤维状的一种蛋白质，在溶液中 显示较高的粘性，具有维持浓厚蛋白组织,防止微生物扩散的作用【支卵粘蛋白还具有抗病毒特性，如新城疫病毒、牛轮状病毒和人类感冒病毒等 3支卵粘蛋白也可以作为一种免疫调节剂，刺激巨噬细胞活性，抑制胆固醇的吸收,减少血清胆固醇的含量，有降低小鼠血液中胆固爵的功能.1.1.2.6卵类粘蛋白卵类粘蛋白是一种糖蛋白，由186个氨基酸组成，分子量为28k Da,有三个结 构域组成，通过二硫键连接,卵类粘蛋白对加热及消化酶处理具有相对抗性，是 蛋清中的一个过敏原，由于这种过敏原特性，使得其在生物学和医学上的应用有 限。卵类粘蛋白也是四种蛋白酶抑制剂之一，属于丝氨酸蛋白酶抑制剂范畴，即 抑制胰蛋白酶、胰凝乳蛋白腋和弹性蛋白酶的活性样-叼.L1.2.7胱蛋白酶抑制剂胱蛋白酶抑制剂是胱蛋白酶抑制剂大家族的一部分，属于2型胱蛋白酶抑制 剂因L能抑制大部分半胱氨酸蛋白酶的活性，包括无花果蛋白酶、木瓜蛋白醉和 组织蛋白酶B、C、H和胱蛋白酶抑制剂在自然资源中含量较少，从而限制 了它的应用心纥胱蛋白酶抑制剂具有抗菌功能，如链球菌、伤寒沙门菌等1346】.一些蛋白 曲，包括半胱氨酸蛋白酶,在肿瘤的生长和代谢中是必须的，半胱氨酸蛋白酸的 水平升高，胱蛋白酶抑制剂的含最下降,就有可能导致各种癌症的发生，因此胱 蛋白酶抑制剂有抑制肿瘤细胞入侵的作用，并且相比于现在临床应用的其他合成 蛋白酶抑制剂，胱蛋白酶抑制剂的副作用较小。1.1.2.8卵抑制剂卵抑制剂是分子量为49k Da的糖蛋白，如同卵类粘蛋白，是一种丝氨酸蛋白 前的抑制剂，抑制胰蛋白胸、胰凝乳蛋白酶、弹性蛋白酶等萌类，还有各种细菌 和真菌蛋白酶心上1.L2.9卵巨球蛋白5卵巨球蛋白是蛋清中分子量较大的一种蛋白质，分子量为800k Da,属于糖蛋 白，略其球型，由四个亚单位通过二硫键连接而成，能抑制多种蛋白酶的活性，包括丝氨酸蛋白酶、半胱氮酸蛋白酶等R8.49。由于卵巨球蛋白的蛋白酶抑制功能，它具有抗菌效果。在体内外实验均已证 明卵巨球蛋白抑制粘质沙雷氏杆菌、绿浓杆菌的生长设”刈；在角膜炎模型动物上,能减少角膜的损伤区对。在小鼠实验中通过加快纤维细胞的生长、胶原的沉积和 组织中毛细血管的形成来加快牙周的伤口愈合性：61。1.2鸡蛋清生物活性肽研究1.2.1 抗菌肽溶菌酶经酶解可以增强其抗菌活性及生产抗菌肽网。P ellegrini和Mine解解 溶菌酶获得第98112,98108和1521的残基片断具有抑大肠杆菌和金黄色 葡萄球菌的活性像的.人工合成的溶菌酶抗菌肽不仅能破坏大肠杆菌的外膜，而 且能抑制DNA和RNA的合成四%卵铁传递蛋白多肽（OTA-92）能破坏胞质膜，具有杀死G.菌的作用伯为 同时 也具有抗鸡胚胎成纤维细胞MDV特性和抗真菌特性【回。从卵白蛋白胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶的醯解物中还分高得到了第3640、3642、111119、143148、159165氨基酸片段的五种抗菌肽回,可抑制枯 草杆菌、大肠杆菌、博尔德氏杆菌等微生物&卵粘蛋白经过锥霉蛋白酶处理的卵粘蛋白肽链,溶解性比原来增加，并且继 续保持结合病毒的特性，具有抗病毒特性，如新城疫病毒、牛轮状病毒和人类感 害病毒等；这种施解的产物糖肽在小鼠的试验中被证明有抗肿瘤的作用，这种现 象表明了卵粘蛋白有抗血管生成的功效，从而抑制肿瘤的生长87叫-1.2.2 免疫肽卵白蛋白在胃蛋白酶和糜蛋白醐水解后，其消化产物OA7784和OA126 134,可以增加巨噬细胞的吞噬活性侬L同时，卵白蛋臼多肽可以增强癌症免疫疗 法的免疫应答反应.一网口蒲万震等人研究表明卵白蛋白用酵母发酵后的活化卵白 蛋白对兔红细胞免疫功能有增强作用出纥合成卵类粘蛋白肽链也被证实具有免疫 调节活性，引导细胞活素的T细胞分泌1现。1.2.3 降压肽,有研究报道蛋清中的某些肽类具有预防高血压的功能Fu jita将卵白蛋白用 胃蛋白醒水解3小时，用RP-HP LC分离出具有血管舒张活性的物质OA358365网，在胰凝乳蛋白酶酶解物中也分离出Ovok inin（27）和OA359364,这二种肽对自发 性高血压大鼠具有降压作用亿根据Ovok ininQ7）设计合成的衍生物具有M 6的降血压作用047叽通过胃蛋白酌和胰蛋白酶的消化，分离到两种ACE(血管紧 张素转化酶)抑制肽OA183184和OA200218股，7711.2.4 抗氧化肽Da va los研究发现卵白蛋白醉解物存在有强抗氧化活性的多肽。降压肽 Ty r-Ala-G!u-Glu-Arg-Ty r-P ro-ne-Leu,显示出较强的清除自由基的能力。2人体的氧化伤害和防御自由基是人体生命活动过程中生物化学反应的中间产物。在正常情况下，体 内自由基的产生和清除处于动态平衡之中，但当机体处于不良环境状态下，以及 随着年龄的增长，体内的自由基将会产生过多或清除过慢，给机体造成损伤。如造 成DNA、蛋自质、及碳水化合物、脂类、核酸等大分子的损伤，可加快机体的衰老 过程，并可诱发糖尿病、癌症、心血管等诸多疾病。自由基清除剂也称为抗氧化 剂,可清除体内多余的自由基，减轻它们对机体的损伤。2.1 人体内自由基产生的机制自由基系指外层轨道含有一个或一个以上未配对电子的物质，包括分子、原 子、原子团或离子0用,由氧诱发的自由基称为活性氧(rea ctive oxy gen s pecies,ROS),是含氧且有高度化学活性的几种分子的总称，主要包括超氧阴离子(s u peroxide ra dica l a nion,Oj)；羟自由基(h y droxy l ra dica l,OH)；过氧化氢(4&卜 单线态氧(。)以及脂质过钝化物的中间产物烷氧自由基(L0)：烷过氧自由基(L00)等，这些不成对的电子使ROS具有不稳定性和高反应性口支机体内自由基的产生有两方面：一是体内各种代谢反应产生的内源性自由基。内源性自由基是机体自由基的主要来源,其产生的主要途径是由线粒体呼吸链电 子泄漏产生和经过氧化物体的多功能氧化呼CMixed-Fu nction Oxy gena s e,MFO)等 催化底物羟化产生.此外，机体血红蛋白、肌红蛋白中还可通过非醐促反应产生 自由基。二是环境中的高温、螭射、光解、化学物质等引起的外源性自由基除 正常情况外，一些化学物质如腐败、酸败和霉变等变质的食物以及抗菌素、杀虫 剂、农药和麻醉剂等，污染的空气，香烟的烟雾和焦油，翻射、紫外光，空气污 染物以及运动、心理压力等也都会激发活性氧和自由基的产生.在机体内部，当 发生炎症、缺血、心肌梗塞和脑血栓以及体内部分组织血液停止流动到再开始流 动的这一瞬间，都会爆发性地产生大量的自由基.2.2 自由基造成的氧化损伤人体每个细胞每天会受到10,IO,次自由基的攻击口叫当机体内的氧化增班 系统与抗氧化系统之间的平衡向氧化措强方向转变时，就会造成氧化胁迫(初 7氧化应激）。机体如果处于乳应激状态，产生的自由基超出清除系统的能力所及 时，过量的自由基会给机体造成不可逆转的氧化损伤，使构成细胞组织的各种物 质如脂质、糖类、蛋白质、DNA等所有大分子物质发生各种氧化反应，引起变性、交联、断裂等氧化伤害，进而导致细胞结构和功能的破坏，以及机体组织的损伤 和器官的病变，从而引发各种疾病、癌变、老化等。221对脂类的伤害所有生物膜都含有各种脂类和蛋白质，包括磷脂和多种不饱和脂肪酸，由于 多不饱和脂肪酸分子中含有多个双键会减弱邻近碳原子上笳丙基氢原子的键能，因而在此弱速处容易引起自由基的连锁反应，脱去烯丙基氢成为脂类自由基（L），再与氧作用成为脂类过氧化自由基（LOO,）.LOO 进一步夺取LH上的氢成 为过氧化脂类（LOOH）,同时形成新的脂类自由基（L-），成为连续氧化反应,最终形成醛、酮、醉、碳氢化合物、环氧化合物以及酸等低分子物质,其中最典 型的产物是丙二醛（MDA）.丙二醛可与蛋白质和核酸结构上的氨基、毓基等发 生交联作用，破坏蛋白质和核酸的正常结构，使之丧失原有功能，一些依赖于氨 基、疏基以维持活性的酶也会受到抑制或失活。核酸与丙二醛交联可导致突变，引发肿瘤等。细胞内线粒体膜中的脂质受损后可导致能量生成受阻，微粒体上多 聚核蛋白体解聚、脱落、抑制蛋白质合成细胞内溶酶体膜受损可释放出其中的 水解酶类，导致细胞内物质的水解、细胞自溶和组织坏死，最终导致各种组织伤 害，引发疾病。2.2.2 对蛋白质的损害自由基直接作用于蛋白质,或通过与脂质过氧化形成的产物作用，可使蛋白 质中具有各种生物活性的肽键断裂，或使蛋白质发生交联聚合作用，改变蛋白质 的结构，进而使细胞的功能发生变化。2.2.3 时核酸的伤害在一定条件下-0H与DNA碱基杂环的双键加成，在嗤碇碱基的Cs和C6位加成，分别生成Cs-OH和C6-OH化合物自由基。生成的喀院和嗦吟自由基可互相结合，或再通过与氧气、超氧阴离子自山基、氢离子等反应生成过氧化物伊-0H还能 从核酸的戊糖部分夺取氢，使DNA的脱氧核糖遭到破坏，磷酸二酯犍的断裂或碱基 的破坏或脱落。这些变化可造成碱基改变、破坏或脱落网L从而产生遗传突变、受损的DNA永久损伤、染色体的破坏和细胞死亡等严重后果。2.2.4 对糖类的伤害自由基可使核糖、脱氧核桶形成脱氢自由基，使DNA的主链断裂或碱基破坏.还可使细胞膜中低聚糖类中糖分子上的羟基氧化生成皴基或聚合物，从而破坏”胞膜上的糖类结构,影响细胞的免疫功能。82.3 机体自由基的清除正常情况下机体拥有一套完整的由抗氧化的和抗氧化剂组成的防御体系，可 以清除自由基，防止脂质过氧化，维持生物体内自由基代谢平衡，使生物机体免 受自由基的伤害.23.1体内抗氧化酶体内的抗氧化悔，主要有超氧化物歧化醐(Su peroxide dis mu ta s e,SOD),过氧 化氢醐(CAT),谷胱甘肽过氧化物酶(Glu ta th ioneperoxide,GSH-P x)等。2.3.L1超氧化物歧化酶(SOD)SOD存在于包括细菌、真菌、高等植物、高等动物和人体在内的几乎所有需 氧生物体内，是一类含金属的梅。按其所含金属辅基不同可分为含铜锌SOD(Cu Zn-SOD).含镒SOD(Mn-SOD)和含铁SOD(Fe-SOD)。SOD 可将超氧阴离 子0；催化歧化生成HzO?和07+0，+2H+-W 必川。2故SOD又称为清除超氧阴离子自由基的特异曲。SOD对自由基有强烈的清除 作用，可以保护脂质不被氧自由基氧化，帮助人体抵抗衰老。2.3.1.2过氧化氮醒(CAT)CAT存在于细胞的过氧化体内，细胞器如线粒体产生的比。2可透过细胞器膜进 入胞浆，再进入过某化体，最终被过氧化氢酶清除。2H2。2 C 2.0+02CAT可将SOD歧化反应产生的大量H2O2及时消除，同时也避免了H2O2与在铁 络合物作用下生成0H的反应。231.3谷胱甘肽过氧化物酶(GSHP x)GSH-P x是一种含硒的陶，广泛存在于动物的肝、肾、心、肺等器官的线粒体 和细胞质中，能清除正常代谢中所产生的活性氧自由基它在催化谷胱甘肽氧化 成氧化型的谷胱甘肽(GSSG)的反应中，消耗H2O2和ROOHH 2O2+2GSH 一坐生 GSSG+2H 20ROOH+2GSH gh-Px R0H+GSSG+H20232体内抗氧化剂根据溶解性不同，清除自由基的非酶促系统可分为两类：一类为水溶性抗氧 化剂，如抗坏血酸(V。、谷胱甘肽(Glu ta th ione,GSH)、半胱鼠酸，白蛋白、金属结 合蛋白等：另一类为脂溶性抗氧化剂，如Ve、类胡萝卜素、胆红素等,它们能提 供电子使自由基还原，故有重要的防护作用阈1。许继平等报道Ve能还原超氧那看 子、单线态僦、过氧化脂质自由基等：抗坏血酸具有相同作用而且能协助Veg 9其具有活性的还原状态理叫类胡萝卜素能够有效清除单线态氧井能抑制脂质过氧 化。胞浆中的GSH与还原型辅酶II在某些薛如GSH-P x.CAT等协同作用下，能还 原H2O2、过氧化脂质、二硫化物等俨L它们有自己独特的功能，同时互相协同共 同承担体液内抗氧化的货任。在体内抗氧化剂中，Ve,Vc最为重要。2.4外源性抗氧化剂及其对自由基代谢的影响正常情况下，由于生物机体自身体内存有内源性抗氧化系统，因此，自由基 的产生与清除处于一个动态平衡中。当机体年老、或受到环境毒物等的影响时，机体内的自由基代谢出现紊乱,打破机体的自由基与抗氧化剂之间的平衡，引起 自由基过量对机体产生明显的毒性作用，此时，可以通过适当补充外源性抗氧化 剂来提高机体抗氧化水平，维持生物体的氧化还原平衡，抵御自由基的损害，帮 助机体抵御疾病网8叫外源性抗氧化剂是指生物体通过膳食、医药摄取的抗氧化剂。常见的外源性 抗氧化剂包括维生素类、植物提取物类抗氧化剂、微量元素类抗氧化剂和蛋白质 类抗氧化剂。2.4.1 维生素类抗氧化剂维生素类抗氧化剂主要是指维生素C、维生素E、6 胡萝卜素等.2.4.1.1 维生素C维生素C又称为抗坏血酸a在自然界中存在还原型抗坏血酸和氧化型脱氢抗 坏血酸两形式，抗坏血酸通过逐级供给电子而转变成半脱氢抗坏血酸和脱氢抗坏 血酸，在转化过程中达到清除、O；-0H、R00 等自由基的作用。维生素c具有 强抗氧化活性，能增强免疫功能、阻断亚硝胺生成、增强肝脏中细胞色素P-450前 体系的解毒功能.人体血液中的维生素C含最水平与肺炎、心肌梗塞等疾病密切相 关【89.90)2.4.1.2 维生素E维生素E又称为生育酚，是强有效的自由基清除剂。它经过一个自由基的中间 体氧化生成生育能,从而将R00 转化为化学性质不活泼的R00H,中断了脂类过氧 化的连锁反应,有效地抑制了脂类的过氧化作用D支vE vEa由基_R四_R0h 生育(维生素E可清除自由基,防止油脂氧化和阻断亚硝胺的生成,故在提高免疫能 力,预防癌症等方面有重要作用。.2.4.1.3 胡萝卜素广泛存在于水果和蔬菜中，经机体代谢可转化为维生素A。B-胡萝卜素具4 较强的抗氧化作用，能通过提供电子抑制活性氧的生成,从而达到防止白由基产生 的目的17,许多试验表明，P-胡萝卜素能增强人体的免疫功能，防止吞噬细胞发 生自动氧化，增强巨噬细胞、细胞毒性T细胞、天然杀伤细胞对肿瘤细胞的杀灭能 力投工在多种食品中，B-胡萝卜素与不饱和脂肪酸的稳定性密切相关L 2.4.2植物提取物类抗氧化剂在自由基研究领域，植物提取物类抗氧化剂以它独特的功效受到大家的关注。就目前资料报道情况看，有消除自由基作用的植物已达50多种。植物来源抗氧化 剂主要有黄用类化合物、酚羟基化合物、皂鼠类化合物、生物碱类化合物以及植 酸等。2.4.2.1黄酮类化合物黄酮类化合物广泛分布于植物界，泛指两个苯环通过中央三碟链相互联结而 成的一系列C6-C3-C6化合物。根据昔原的基本结构可以分为黄酮、黄酮素、黄 烷酮、黄烷酮醇、异黄酮、查耳酮、花色素等十多种类型.黄酮化合物具有清除 自由基和抗氧化能力，其作用机理是与0*结合阻止自由基的引发，与金属离子螫合阻止-0H的生成，与脂质过氧化基R00 反应阻断脂质过氧化19%黄酮类化合物是很多常用中草药的活性成分，其提取物芸香瓜、橙皮成、黄苓 底、棚皮素等均己应用于临床伊)。以黄酮类化合物为主要成分的银杏叶提取物(EGB)已被广泛应用于医药和保健食品行业由L研究表明，银杏提取物(Gink goBiloba extra ct,EGB)在治疗心血管疾病，调节血脂水平,治疗脑供血不足和早期神经退行 性病变等方面有良好的疗效13网。242.2茶多酚茶多酚是茶叶中富含的一类多羟基酚类物质。是一类以儿茶素为主体的多酚 类,此外还含有黄烷醵、黄烷酮、酚酸和花色音等成分四匕茶多酚对氧自由基有强 效的清除作用。试验表明，茶多酚中的儿茶素类化合物对0-0H的清除率达 98%，对活细胞(P MN)产生的氧自由基的综合清除效果优于维生素E和维生素CL 2.4.23皂或类化合物人参皂成有清除。仁-0H自由基，抑制脂质过氧化作用。人参叶总皂或、人参果总电成可减少老年大鼠脑、心肌中阖脂质的生成并提高血液中CAT活性.纹 股蓝皂成具有类人参皂成作用，不仅可提高SOD活性，而且有降血脂、耐缺氧的 作用。具有抗氧化活性的皂鼠类还有三七皂玳、西洋参皂就、竹节参总皂成、柒 胡皂忒等。2.4.2.4 植酸II是肌醇的六磷酸酯，在大多数谷类、坚果类、豆类等植物中的含量约为1%5%,它的抗氧化性能不是来自它与活性氧的反应，而是因为它与金属离子的螯合 作用，尤其是植酸与铁离子的高度螯合作用。一分子的植酸可与四个铁离子结合,因此植酸抑制由Fc抗坏血酸系统催化的脂质过氧化反应。另外植酸还可催化Fe?氧化为Fe34,由于植酸的存在，Fe?+与Fe的循环被打断,从而可以有效抑制Fe?+诱导下脂质过氧化反应。植酸的抗氧化作用可应用于预防结肠癌的发生.据流行 病学调查摄取植酸最高的人比摄取纤维素高的人还不易得结肠癌。2.4.3 微量元素类抗氧化剂人体必需的微量元素如锌、铁、铜、锦、硒、碘等是构成机体生命活动重要 酶类和蛋白质的重耍成份。微最元素以其自身的电子传递性质在生物体氧化程原 过程中起抗氧化作用，例如硒代半胱氨酸是硒依赖型谷胱甘肽过氧化物酶的总性 中心；铜是CuSOD、Zn-SOD.铜蓝蛋白的组成部分，并和过氧化氢醐，GSH-P x 的活性有关。锌也是Cu-SOD、Zn-SOD的必须成分，可通过其螯合作用来维持生 物膜的正常功能，生物体内缺乏锌可使脂质过氧化水平升高。生物体内的微量元 素的生理作用是相互联系的，例如，缺悴时铜含量升高，铜和锌的含量一同下降 时引起铁含量升高，过量快引起的失衡可通过抗氧化剂来调节【,皿L2.4.4 蛋白质、肽类、氨基酸的抗氧化活性氨基酸、肽及其蛋白质的抗氧化活性，尤其是作为油脂自动氧化的