吸入制剂微细粒子空气动力学粒径分布评价方法研究.pdf

中国药物警戒 第 21 卷第 2 期 2024 年 2 月 February,2024,Vol.21,No.2141DOI:10.19803/j.1672-8629.20230411 中图分类号：R917.4文献标志码：A 文章编号：1672-8629（2024）02-0141-06基金项目：国家重点研发计划（2023YFC2410202）。作者简介：贾茵茵，女，在读硕士，药物分析。*通信作者：陈华，男，硕士，主任药师，药物分析与质量控制。E-mail:#为共同通信作者。吸入制剂微细粒子空气动力学粒径分布评价方法研究贾茵茵1,2，张财树2，周颖2，刘丽3，耿颖2，魏宁漪2，钮思静2，陈华2*，许卉1#（1烟台大学药学院，山东 烟台 264003；2中国食品药品检定研究院化学药品检定所，北京 102629；3中国食品药品检定研究院医疗器械检定所，北京 102629）摘要：目的评估吸入制剂的空气动力学粒径分布（APSD），提高药品质量和安全有效性。方法通过对不同国家药典收载的检测 APSD 的方法以及相关标准进行比较与总结，用多种计量学参数来表征 APSD，通过微细粒子剂量的大小和在总收集剂量中所占的比例作为评估吸入产品的关键指标。结果安德森撞击器（ACI）和新一代撞击器（NGI）是目前应用最广泛也是 美国药典 中所收载的方法，中华人民共和国药典 又额外收载了玻璃二级撞击器，欧洲药典除以上 3 种装置外还收载了多级液体撞击器。空气动力学质量中值经（MMAD）是控制颗粒在肺部沉积位置的重要变量，几何标准偏差（GSD）表征的是药物颗粒粒度分布曲线形状，越接近于1说明粒度分布越窄。有效数据分析（EDA）中大粒子质量（LPM）与小粒子质量（SPM）的比值以及撞击粒子总质量（ISM）可检测 APSD 的变化。药物微粒的大小及分布很大程度上决定了粒子在呼吸系统中的沉积部位和沉积量，进而影响药物的疗效。所以若使吸入制剂中的活性药物成分（API）能够经由呼吸系统递送至肺，其气溶胶的空气动力学粒径应在15 m。结论合适的测试方法能够保证吸入产品的质量、安全性和有效性，合理的给药剂量和药物颗粒大小是决定吸入制剂性能的关键指标。不断改进细颗粒的测试方法，深入研究体内外的相关性，能够为吸入产品的进一步研究与开发创造有利条件。关键词：吸入制剂；空气动力学直径；级联撞击法；表征方法；数据分析；安全性；一致性评价；标准Evaluation methods for aerodynamic particle size distribution of fine particles in inhaled productsJIA Yinyin1,2,ZHANG Caishu2,ZHOU Ying2,LIU Li3,GENG Ying2,WEI Ningyi2,NIU Sijing2,CHEN Hua2*,XU Hui1#(1School of Pharmacy,Yantai University,Yantai Shandong 264003,China;2 Institutes for Chemical Drug Control,National Institutes for Food and Drug Control,Beijing,102629,China;3Institute for Medical Device Control,National Institutes for Food and Drug Control,Beijing 102629,China)Abstract:Objective To improve the quality,safety,and effectiveness of drugs by evaluating the aerodynamic particle size distribution(APSD)of inhaled formulations.Methods The methods and related standards for detecting APSD specified in different national pharmacopoeias were compared and contrasted.APSD was characterized using multiple econometric parameters.The size of the fine particle dose and its proportion in the total collected dose were used as the key indicators for evaluating inhaled products Results The Anderson cascade impactor(ACI)and the next generation impactor(NGI)were currently the most widely used and included in the US Pharmacopoeia.The Chinese Pharmacopoeia also included a glass twin impinger while the European Pharmacopoeia also included a multi-stage liquid impactor.The mass median aerodynamic diameter(MMAD)was an important variable to control the deposition position of particles in the lung.The geometric standard deviation(GSD)represented the shape of the drug particle size distribution curve.The closer to 1 the distribution curve,the narrower the distribution of particles.The changes in APSD could be detected by measuring both the ratio of the large particle mass(LPM)to the small particle mass(SPM)and the impactor-sized mass(ISM)in effective data analysis(EDA).The size and distribution of drug particles largely determined the location and amount of particle deposition in the respiratory system,thereby affecting the efficacy of drugs.The delivery of active pharmaceutical ingredients(APIs)in the inhaled formulations to the lungs through the respiratory system required that the aerodynamic particle size of aerosols range from 1 to 5 m.Conclusion Appropriate testing methods can ensure the quality,safety,and effectiveness of inhaled products.Well-designed dosages and drug particle sizes are the key indicators that determine the performance of inhaled formulations.Therefore,successive improvement of testing methods for fine particles and in-depth 不同分析方法在药品质量控制中的应用专栏编者按：药品质量控制是保证药品安全有效和保障公众健康的重要手段，药品检验工作相关方法研究及优化对药品安全有重要意义。本专栏组织药品检验领域及科研院所药物分析研究人员，通过总结 中华人民共和国药典 中吸入制剂的空气动力学粒径分布、研究激光衍射法测定药品中粒子粒径分布、改进含量测定方法，介绍吸入制剂微细粒子空气动力学粒径分布评价以及建立西格列他钠的粒径分布测定方法，为药品检验检测和质量控制相关工作提供参考。中国药物警戒 第 21 卷第 2 期 2024 年 2 月 February,2024,Vol.21,No.2142肺部给药是指药物微粒通过口咽部进入呼吸道，是肺部相关疾病的主要给药途径，如哮喘和慢性阻塞性肺病（chronic obstructive pulmonary disease,COPD）。由于此种给药方式见效迅速且能避免胃肠道吸收不良和肝脏的首过代谢现象，吸入制剂也越来越多地用于全身治疗。然而只有当药物颗粒成功沉积入肺时，才能达到这种理想治疗效果1。因此，研究粒子在人体吸入过程中的分布情况、控制其空气动力学粒径对新型鼻、耳、泪道系统药物缓释可降解支架相关研究尤为重要。空气动力学粒径分布（aerodynamic particle size distribution,APSD）是经口吸入制剂（orally inhaled products,OIPs）以及鼻用喷雾剂（nasal spray）的关键质量属性（critical quality attribute,CQA）之一2-3。中国、美国和欧洲药典4-6对于空气动力学粒径分布的规范均有收载。APSD 的质量控制方法有很多种，且均是以多级级联撞击器（multi-stage cascade impactor）原理为基础7。目前，级联撞击器法常用于微细粒子剂量的检测，其中常用的撞击器为双级撞击器（twin-stage impinger,TSI）、安德森撞击器（andersen cascade impactor,ACI）和新一代撞击器（next generation impactor,NGI）8。该类方法通过将不同粒径范围的微粒沉积在相应的收集盘内，而后采用合适的溶剂分别将喉部、预分离器和各收集盘内药物收集并进行定量分析，计算小于规定粒径的微粒（即可能到达肺部的微粒）的含量。级联撞击技术可以回收、测定并报告固定大小或更小的细颗粒，这些细颗粒中所含活性药物成分（active pharmaceutical ingredients,API）的质量通常称为微细粒子剂量（fine particle dose,FPD），以表示可能的肺部递送粒径9。或可将 APSD 的所有数据简化为几个相邻大小级别的质量，这些大小级别代表吸入剂量的粗、细和超细颗粒在生理意义上可能沉积的位置10。由于实验装置的差异，每种装置收集到的FPD 粒子范围不尽相同11，所以通过比较不同的国家标准和各类装置对吸入产品的适用性，筛选合适的设备及实验条件对于准确评估吸入制剂的体外特性，保障药品质量，促进合理用药是相当关键的。1 中国、美国及欧洲药品监管机构对 APSD 的测定中华人民共和国药典（2020 年版）4（简称表1 美国药典收载4 种撞击器分类和适用制剂Table 1 Classification and applicable formulations of impactors of USP方法（装置描述）适用制剂安德森撞击器（不安装预分离器）吸入气雾剂、吸入喷雾剂、鼻用气雾剂安德森撞击器（安装预分离器）吸入粉雾剂、鼻用粉雾剂新一代撞击器（不安装预分离器）吸入气雾剂、吸入喷雾剂、鼻用气雾剂新一代撞击器（安装预分离器）吸入粉雾剂、鼻用粉雾剂、吸入液体制剂“中国药典”）四部通则中规定，吸入制剂中 FPD应采用相应方法进行表征，雾滴（微粒）分布和微细粒子剂量是评价吸入制剂质量的重要参数。吸入制剂的雾滴（微粒）大小，在生产过程中可以采用合适的显微镜法或光阻、光散射及光衍射法进行测定；但产品的雾滴（微粒）分布，则应采用雾滴（微粒）的空气动力学直径分布来表示12。中国药典 中收载三种级联撞击方法（装置）：双级撞击器（TSI）、安德森撞击器（ACI）和新一代撞击器（NGI）。其判定方法为收集适配器、预分离器、喉及各层级的沉积量，计算规定层级的累积质量，得到微细粒子剂量13。美国药典6中收载了4种方法（装置）（表1），本版通则中与前述差异较为显著，去掉了前版中的马普尔-米勒撞击器法（装置 2）和多级液体撞击器法（装置 4），保留了ACI 和 NGI，通过安装预分离器对粉雾剂进行测定14。根据 美国药典6中描述的测定法，确定由撞击器区分出的气溶胶的累积质量粒子大小分布。从滤膜级开始，推导各个层级的模拟质量与有效截止直径。其判定方法依然是收集相关部件及各层级的沉积量，计算出规定层级的累积质量，得出微细粒子剂量13。欧洲药典通则5中收载了装置 A-玻璃撞击器法，装置 C-多级液体撞击器法，装置 D-安德森级联撞击器法和装置 E-新一代级联撞击器法，欧洲药典通则与 美国药典 的描述基本一致。细颗粒质量测试应使用经过验证的多级撞击器方法或经过适当验证的替代方法进行。如果单独的细颗粒质量不足以完全表征治疗剂量的粒径分布，则可用其他合适的参数，如 MMAD 和 GSD。为满足与药物的治疗指数的相关性，需要将粒度分布控制在 5 m以下6,15-16。research on the correlation between in vitro and in vivo use can facilitate the research and development of inhaled products.Keywords:inhaled products;aerodynamic diameter;cascade impactor;characterization methods;data analysis;safety;consistency evaluation;standard中国药物警戒 第 21 卷第 2 期 2024 年 2 月 February,2024,Vol.21,No.21432 有关 APSD 的评价参数及数据分析评价APSD 有几个重要参数（表 2），ACI是8阶级联撞击器，可承载高体积流量的检测，现采用此法对吸入粉雾剂A 进行微细粒子剂量的测定。因A产品所需流量为 72 L min-1，可将ACI配置中的第7 级移除并在上面增加-1级，随后对该粉雾剂进行取样并分级收集。所得结果用CITDAS 软件进一步计算分析。为得到颗粒在各个层级的分布数据以及药物累积质量，可以对级联撞击器的收集结果进行分析并提供小于规定截止粒径的累积百分比与截止粒径的关系图。在合适的情况下（要求数据满足单峰对数正态分布），可以采用对数-概率图（log-probit），通过内插法计算出小于给定大小或在上限和下限之间的质量分数，并确定 MMAD 和 GSD 值17。此外，要求考虑质量平衡。ISM 分为 LPM 和 SPM，其区分的边界理论上为MMAD 或接近 MMAD。LPM 和 SPM 间的比率独立于 ISM（图1）。级联撞击器特定层级的颗粒收集效率（efficiency,E），以百分比表示，将在 0%100%逐步增加。实际上，对于设计良好的级联撞击器，收集效率的曲线会从 E 约为 0%陡增至大于 95%，在 E 为50%时，增长率达到最大值18（图 2）。应注意不要混淆粒径分布和统计误差分布地区别。美国药典 对数正态模型不是指 APSD 基于对数正态分布，而是假设颗粒的累积质量百分比分布和基于对数正态分布的随机变量的累积分布曲线具有相同的形状6。在此假设下，对数转换后的有效截止粒径（effective cut-off diameters，ECDs）与累积质量百分比向标准正态分布的转换之间存在线性关系。通过对溶液的分析，可以计算出每次沉积在各个层级以及在适配器和使用预分离器时所沉积的活性物质的质量。从微孔收集器（MOC）层级开始，得出相应层级的累积质量与截止粒径的表格。通过内插法计算小于 5 m 的活性物质的质量，即是 FPD19。绘制出活性物质的累积分数与临界直径的关系（图 2），并使用该图确定相应的 MMAD 和 GSD 的值。也可以使用适当的计算方法17,20。APSD 是 1 个多元的响应变量，旨在检测基于粒径大小的函数所形成的曲线变化21。美国药典 中的方法需要 APSD 满足对数正态分布从而获得 MMAD，但实际上大多数气溶胶的 APSD 可能无法实现。所以需要根据下面几种分析模型来估计出 MMAD 值。Mercer-Morgan-Flodin（MMF）模型、Chapman-Richards（CR）模型、原始数据的两点线性插值法皆能得到合理的 MMAD 值17。这几种模型既不用将原始数据进行对数转换处理，也不需要APSD满足对数正态分布，只满足 APSD 是单分布即可。其中的两点线性插值法更为简便，一般会作为首选。3 APSD 的评估方法和各机构间的评估标准虽然多级级联撞击器产生的APSD 数据经常被认为可以直接表明人类呼吸道中颗粒的沉积情况，但是这种理论是不正确的。人体呼吸道（human respiratorytract,HRT）中有多重机制主导控制颗粒的沉积，因而级联撞击器从根本上并不是肺部模拟器。但一定程度上可以通过 CI 法提供的数据来预测呼吸道中颗粒的沉积22-23。目前，简化的级联撞击测定法（abbreviated impactor measurement,AIM）与有效数据分析法（efficient data analysis,EDA）作为改进与口服吸入产品递送出的气溶胶大小表征相关的数据收集和分析的方法概念已经并行发展24。从 AIM 的发展中可以认识到，在产品质量控制中，定义 APSD 所需的所有与大小颗粒总和及比例有关的最小度量标准都是必要的25-26。AIM 的质量控制方法中，可以最大程度地简化测量过程，即确定 LPM 和 SPM 的分数，这些参数会敏感地反映 APSD 的变化17。EDA的理念在于将在全分辨表 2 APSD 相关计量学参数的含义及意义Table 2 Meaning and Significance of APSD Related Metrological Parameters计量学参数含义意义MMAD当 APSD 中各层级累积的颗粒质量达到或最接近 CI 中颗粒物总质量 50%时的粒径 体现了 APSD 曲线的集中趋势和中位直径GSD粒径呈单峰对数正态分布的几何标准偏差表示 APSD 曲线的离散程度FPD所有层级中d50值小于 5 m 的 API 的剂量代表成功沉积入肺的药物质量FPFFPD 占粒子收集总量的百分比（Fine Particle Fraction）控制药物质量ISMCI 装置所收集的 API 的总量代表 APSD 的曲线下面积LPM大颗粒质量，所有层级中d50值大于 MMAD 的 API 质量之和LPM 和 SPM 两者比值可检测 APSD 的变化SPM小颗粒质量，所有层级中d50值小于 MMAD 的 API 质量之和注：D15.87D84.13GSD=D84.13、D15.87分别表示84.13%、15.87%的累积质量百分数对应的API的空气动力学粒径；d50值为CI 装置 中各个层级的截止粒径Note:D15.87D84.13GSD=D84.13 and D15.87 represent the aerodynamic particle sizes of API corresponding to cumulative mass percentages of 84.13%and 15.87%,respectively;The d50 value is the cut-off particle size of each level in the CI device中国药物警戒 第 21 卷第 2 期 2024 年 2 月 February,2024,Vol.21,No.2144率CI每个层级收集到的API的累积质量分成粗、细和超细颗粒 3 组。并通过选择合适的粒径标准更合理地分析数据。有效数据分析（EDA）法是 AIM的辅助概念，可以应用于来自全分辨率 CI 或简化的 CI 的数据。由于消除了混杂变量，基于EDA的OIP气溶胶APSD的测量方法不易出现误差。与其他数据分析技术相比，EDA 确实能够更容易地评估气溶胶的 APSD17,24。目前粒度测定的方法有显微镜测定法、撞击器法、光学测定法等，中国药典4收载的是 CI 方法。根据人体呼吸道生理结构，为使药物有效的分布或沉积在治疗部位，药物的粒度通常在 5 m 以下。粒度过大可能会使药物不能有效沉积，疗效降低。控制药物的粒度分布，须求出 d10、d50、d90（即分别表示 10%、50%、90%的累积质量百分数对应的API 的空气动力学粒径）的值，CI 法系将药物经过一系列的不同粒径过滤器收集后采用专一性的理化方法测定药物含量，根据每一级的相应粒径可以获得空气动力学粒度直径分布，以控制最终质量27。经过单剂量临床研究，欧洲监管机构与加拿大监管机构达成协调28-29，认为 FPD 为测定的空气动力学粒径为小于 5 m 的颗粒，并且为了评估在体内研究中使用产品的完整概况，应提供这些研究中使用批次的各个阶段粒度分布数据，以及给药速率和给药总量。欧洲药品管理局（EMA）和加拿大卫生部（HC）在 2006 年有关经口和经鼻吸入产品质量的指导原则28-29中指出：如果单独的 FPD 不足以完全表征治疗剂量的颗粒尺寸分布，则可附加其他标准，如分组阶段或 MMAD、GSD。美国食品药品监督管理局（FDA）在其 1998 年定量吸入器和干粉吸入器药品行业指南的指导原则拟定稿30中要求：来自全分辨率 CI 测量的数据也可以用标示含量在各个层级和配件上检测到的质量百分比表示。可以根据对各层级和配件的适当分组来提出验收标准。但如果采用该方法至少应有 3 或4 个分组，以确保未来所生产产品的粒度分布的批次间一致性。而上述要求仅在拟定稿中提出，在 2002年鼻喷雾剂、吸入溶液、吸入混悬液和喷雾剂药品行业指南的最终版指导原则31中，则取消了该要求。而在其于 2018 年发布的定量吸入器和干粉吸入器产品质量的行业指导原则草案32中提出：仅根据MMAD、GSD，或者仅将特征限制为 FPD 或 FPF，不足以表征 APSD。应根据设备各个阶段沉积的药物量提出接收标准。申请人应为连续阶段的分组提出验收标准，而不是为每个阶段提出验收标准。在大多数情况下，3 或 4 个分组应足以充分表征 APSD。4 APSD 一致性评价方法生物等效性（bioequivalence,BE）是我国正在进行的仿制药质量与疗效一致性评价工作的重点之一，吸入制剂的生物等效性评价存在其特殊性和复杂性，在研发过程中，与体内研究相比，体外测定通常更简便、敏感，变异也更小，因而科学系统的体外研究在 BE 评估中尤其重要33-35。在吸入制剂评价中，体外等效评估的关键则是考察粒子的空气动力学粒径分布和装置等指标。由于剂型以及局部用药对有效粒径分布要求的不同，经口吸入制剂和鼻用制剂考虑的体外评价项目和接受限度也有所差异36。4.1 轮廓分析法FDA在2004 年有关粒径分布轮廓的统计比较指注：采用 ACI 装置对某一粉雾剂产品进行微细粒子剂量的检测，并根据 CITDAS 软件的计算结果作图Note:ACI devices were used to detect the dosage of fine particles in a powder spray product,and a graph was drawn based on results calculated by CITDAS software图1 吸入粉雾剂产品的API在不同截止粒径范围内的含量分布Figure 1 Content distribution of API in dry power inhalers within different cut-off particle size ranges注：采用 ACI 装置对某一粉雾剂产品进行微细粒子剂量的检测，并根据 CITDAS 软件的计算结果作图Note:ACI devices were used to detect the dosage of fine particles in a powder spray product,and a graph was drawn based on results calculated by CITDAS software图2 在对数概率坐标上所作的吸入粉雾剂产品的API在不同截止粒径范围的累积分布和频度分布Figure 2 Cumulative distribution and frequency distribution of API of DPI in different cut-off particle size ranges on log probability coordinates频度分布累积分布/%中国药物警戒 第 21 卷第 2 期 2024 年 2 月 February,2024,Vol.21,No.2145导原则37中，提出使用置信区间方法对级联撞击器所产生的粒子分布的轮廓进行分析（profile analysis）。可以根据比较受试制剂和参比制剂通过级联撞击器在各个层级检测值的卡方差异来评估其粒子轮廓的等效性38-39。在选定的样本中，将数学期望 E（RD）=E（DTR/DRR）的 95%置信上限作为确定等效性的限度，其中 DTR为受试制剂和参比制剂间的轮廓差异，DRR为参比制剂内轮廓的变异性。如果 E（RD）的95的置信上限小于等效性限度，则认为这 2 种产品是等效的。测试步骤如下：假设从每种样品中，随机抽取 3 批。每批抽取 10 个样品进行测试，获得测试结果。然后将每一批受试制剂与 2 批参比制剂进行组合，采用 bootstrap 法进行数据模拟37,39，计算共计 6 种配对方式的受试-参比 1-参比 2 组合的 RD值，FDA 指导原则中推荐的模拟数量为N=50033。4.2 单侧 PBE 法群体生物等效性（population Bioequivalence,PBE）的评估方法，可评价制剂间药代动力学参数的平均水平及个体内变异是否等效40。如鼻喷雾剂的作用部位为鼻腔，通过鼻腔给药后，较小的微粒可能通过呼吸道进入肺部而产生毒副作用，故出于对肺部安全性的考虑，鼻喷雾剂的液滴粒径需大于10 m41-43。目前 中国药典 没有对鼻喷雾剂微细粒子剂量进行要求。FDA 在 2003 年关于鼻用气雾剂和鼻用喷雾剂的生物利用度和生物等效性研究的指导原则44中要求使用经验证的 CI 方法对微细粒子剂量进行检测，采用单侧群体生物等效性（Population Bioequivalence,PBE）的评估方法，以便比较小于 9 m 的小颗粒或液滴中的药物质量。5 总结近年来吸入给药无论是治疗肺部相关还是其他方面的疾病都得到了国内外的高度重视。随着呼吸系统疾病的发病率和病死率逐年上升，作为以无创给药方法治疗各种疾病的吸入制剂凭借其独特的作用优势已成为一大研究热点。但不论是这些疾病本身还是药物治疗的复杂性都使之在评价体内肺部沉积的道路上变得尤为困难，所以评价吸入相关制剂体外药效相当必要，微细粒子的测量与计算则是其中的重要部分。目前各国药典中收载的测量 APSD 的方法依然是 CI 法，其中 美国药典 主要收载了ACI 和 NGI，中国药典中收载了TSI、ACI、NGI，欧洲药典中则收载了TSI、ACI、NGI 以及多级液体撞击器，各国标准也基本是根据 GSD、MMAD、FPD、FPF 4 个计量学参数来表征 APSD。CI 法在现在的吸入产品市场上应用依然最为广泛，且被誉为“金标准”，但由于其装置的复杂性，结果的高变异性，对操作人员和外界环境的高要求性，使得测定失败率偏高且耗时耗力。AIM 法可以最大程度地简化撞击器的测量过程，实现高效、简便、快速的优势，其与 EDA 配合后能够达到减少实验误差和不确定性，增加对APSD 变化的灵敏度效果。因为测定用时更少，所以可以进行更大规模的实验设计，对AIM 方法的变异性评价的统计学结果更加可靠，产品的质量和用药安全得到了保障，为新型鼻、耳、泪道系统药物缓释可降解支架的研制和临床应用研究提供参考，也能促进吸入制剂在未来获得更长足的发展。参考文献1 SENG HL,PAPK S,LEE CC,et al.A 3D printed human upper respiratory tract model for particulate deposition profilingJ.Int J Pharm,2021,597:120307.2 SORINO C,NEGRI S,SPANEVELLO A,et al.Inhalation therapy devices for the treatment of obstructive lung diseases:the history of inhalers towards the ideal inhalerJ.Eur J Intern Med,2020,75:15-18.3 ROBERTS DL,MITCHELL JP.Measurement of 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