疏风解毒胶囊预防给药对流感病毒感染小鼠模型TLR4介导肺组织炎性损伤的影响.pdf

中国药物警戒 第 21 卷第 1 期 2024 年 1 月 January,2024,Vol.21,No.145DOI:10.19803/j.1672-8629.20230419 中图分类号：R978;R994.1文献标志码：A 文章编号：1672-8629（2024）01-0045-06基金项目：国家自然科学基金资助项目（82141206）；中国中医科学院科技创新工程（CI2021A04606）。作者简介：曹姗，女，在读博士，中药药理。*通信作者：崔晓兰，女，博士，研究员，中药抗病毒与抗感染药理。E-mail:#为共同通信作者。甲型流感病毒（influenza A virus，IAV）是一种引起人类和动物感染的主要病原体，可导致全球大流行的暴发，严重威胁人类健康。过去100 年里，甲型 H1N1、H2N2 和 H3N2 流感病毒曾大流行，导致全球较高的发病率和死亡率1-2。无论是季节性还是疏风解毒胶囊预防给药对流感病毒感染小鼠模型 TLR4 介导肺组织炎性损伤的影响曹姗，庞博，徐英莉，张敬升，陈梦苹，张宇，王雅欣，包蕾，耿子涵，郭姗姗，赵荣华#，崔晓兰*（中国中医科学院中药研究所生物安全实验室，北京 100700）摘要：目的探究疏风解毒胶囊预防给药对甲型流感病毒肺炎小鼠的影响及可能的干预机制。方法采用甲型 H1N1流感病毒（FM1株）滴鼻感染 ICR小鼠，构建病毒性肺炎模型。每日固定时间观察各组小鼠一般状态，计算各组小鼠肺指数、抑制率和病毒载量；采用 Micro-CT、苏木精-伊红染色（HE）法观察小鼠肺组织病理形态变化；采用酶联免疫吸附法（ELISA）检测肺组织中肿瘤坏死因子（TNF-）、白介素-6（IL-6）的含量；蛋白免疫印迹法（Western blot）检测肺组织中 TLR4、MyD88 蛋白的表达含量。结果预防性给予疏风解毒胶囊可降低小鼠的肺指数，降低肺组织中病毒载量，修复流感小鼠肺部损伤，减轻肺部病变，降低肺组织中 TNF-和 IL-6 含量。Western blot 结果显示疏风解毒胶囊可下调肺组织 TLR4、MyD88 蛋白的表达。结论疏风解毒胶囊预防性给药对甲型流感病毒肺炎小鼠具有保护作用，其机制与抑制病毒复制、改善肺组织病变、抑制炎症因子释放和下调肺组织中 TLR4、MyD88 蛋白的表达有关。关键词：甲型流感病毒；疏风解毒胶囊；抗病毒作用；TLR4/MyD88；小鼠；肺组织；肺炎Effects of Shufeng Jiedu capsules prophylactic administration on TLR4-mediated inflammatory injury in lung tissue in a mouse model of inffuenza virus infectionCAO Shan,PANG Bo,XU Yingli,ZHANG Jingsheng,CHEN Mengping,ZHANG Yu,WANG Yaxin,BAO Lei,GENG Zihan,GUO Shanshan,ZHAO Ronghua#,CUI Xiaolan*(Biosecurity Laboratory,Institute of Chinese Materia Medica,China Academy of Chinese Medical Sciences,Beijing 100700,China)Abstract:Objective To investigate the effects of prophylactic administration of Shufeng Jiedu capsules on mice with influenza A virus pneumonia and the possible mechanisms of intervention.Methods Influenza A(H1N1)virus(FM1 strain)was used to infect ICR mice with nasal drops to construct a viral pneumonia model.The general status of mice in each group was observed at a fixed time every day,and the lung index,inhibition rate,and viral load of mice in each group were calculated;Micro-CT and hematoxylin-eosin staining(HE)were used to observe histomorphological changes in mouse lungs;An enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA)was used to detect the levels of tumor necrosis factor(TNF-)and interleukin-6(IL-6)in lung tissues;protein immunoblotting(Western blot)was used to detect the expression levels of TLR4 and MyD88 proteins in lung tissues.Results Prophylactic administration of Shufeng Jiedu capsules reduced lung index,decreased viral load in lung tissue,repaired lung damage,attenuated lung lesions and decreased TNF-and IL-6 levels in lung tissues in mice with influenza.Western blot results showed that Shufeng Jiedu capsules could down-regulate the expression of TLR4 and MyD88 proteins in lung tissue.Conclusion Prophylactic administration of Shufeng Jiedu capsules had a protective effect in mice with influenza A virus pneumonia.The mechanism is related to the inhibition of viral replication,improvement of lung tissue lesions,inhibition of inflammatory factor release and down-regulation of TLR4 and MyD88 protein expression in lung tissue.Keywords:influenza A virus;Shufeng Jiedu capsules;anti-viral effect;TLR4/MyD88;mice;lung tissue;pneumonia大流行的流感病毒感染，都可能引起肺炎，造成严重的健康问题3。IAV 通过攻击宿主上皮细胞完成复制进而感染更多细胞，触发免疫系统攻击、破坏整个呼吸系统受感染组织，引起肺组织损伤4。疏风解毒胶囊由虎杖、板蓝根、连翘等 8 味中药组成，具有疏风清热、解毒利咽的功效，研究发现其具有广谱抗菌、抗病毒的作用，是严重急性呼吸综合征、H1N1流感国家卫生健康委员会诊疗方案推荐用药5-6，在临床实践中作为一种用于治疗急性上呼吸道感染疾病的药物疗效确切，无明显不良反应6-8。本实验建立中国药物警戒 第 21 卷第 1 期 2024 年 1 月 January,2024,Vol.21,No.146流感病毒 H1N1/FM1 株感染 ICR 小鼠模型，预防性给予疏风解毒胶囊治疗，探究其发挥作用的可能机制，以期为临床应用提供一定的理论与实验证据。1 实验材料1.1 实验动物ICR 小鼠（SPF 级）36只，（141）g，雌雄各半，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号：SCYK（京）2021-0006。动物购进后饲养于中国中医科学院中药研究所ABSL-2 生物安全实验室，温度1829，日温差 3，相对湿度40%70%。所有动物实验均遵循北京市实验动物伦理委员会的规定，经过中国中医科学院中药研究所动物伦理委员会批准（2022D052）。1.2 实验病毒株 流感病毒 H1N1/FM1 株，购自美国标准生物品收藏中心（ATCC），由 ABSL-2 生物安全实验室常规传代，-80冰箱保存备用。1.3 实验药品及试剂 疏风解毒胶囊（简称“SFJD”，安徽济仁药业股份有限公司，批号：3201020）；磷酸奥司他韦胶囊（简称“奥司他韦”，宜昌华电长江药业有限公司,批号：0221903034）。蛋白质提取试剂盒（北京索尔比奥科技有限公司，批号：20220224）；组织总RNA 提取试剂 TRIzol（美国 Life Technologies 公司，批号：350110）；甲型流感病毒核酸测定试剂盒（上海之江生物科技股份有限公司，批号：P20220301）；4%细胞组织固定液和超敏化学发光检测试剂盒（北京百瑞极生物科技有限公司，批号：20211229、20221104）；PVDF 膜 0.45 m（爱必信上海生物科技有限公司，批号：526A036）；anti-TLR4 抗体、anti-MyD88（proteintech 武汉三鹰生物技术有限公司，批号：10005089、10022637）；anti-Tubulin（英国 Abcam公司，批号：GR123235-14）；小鼠肿瘤坏死因子-（TNF-）ELISA试剂盒和小鼠白介素-6（IL-6）ELISA试剂盒（北京百瑞极生物科技有限公司，批号：BN50578、BN50553）。1.4 实验仪器 A2型生物安全柜（美国Thermo 公司，型号：Thermo MSC1.8）；电子天平（上海越平科学仪器有限公司，型号：YP1002）；电子分析天平（梅特勒-托利多仪器公司，型号:AL204）；IVC 小鼠饲养笼（苏州冯氏股份有限公司，型号：ZJ-4）；Real-Time PCR Instrument（美国 Applied biosystems 公司，型号：QuantStudio 5）；震荡裂解仪（美国 Mp Biomedicals 公司，型号：FastprepTM-24）；低温高速离心机（德国 Eppendorf 公司，型号：5810R）；全景切片扫描仪（匈牙利 3DHISTECH 公司，型号：pANNORAMIC DESK）；多功能酶标仪（德国 PerkinElmer 公司，型号：Enspire）。2 实验方法2.1 流感病毒感染小鼠模型及给药方式健康 SPF 级 ICR 小鼠 36只，随机分为 6 组：正常对照组、模型组、阳性药磷酸奥司他韦组（简称“奥司他韦组”）、疏风解毒胶囊高剂量组（简称“SFJD-高剂量组”）、疏风解毒胶囊中剂量组（简称“SFJD-中剂量组”）和疏风解毒胶囊低剂量组（简称“SFJD-低剂量组”），每组 6只，雌雄各半。除正常对照组和模型组外，每组小鼠先预防给药 3 d，正常对照组和模型组给予同等体积的蒸馏水。每组小鼠灌胃给药，连续给药 3 d，剂量按 0.2 mL 10 g-1体重计算。依据前期实验基础，SFJD（规格：每粒 0.52 g，每次4 粒，每日3 次）根据人临床用量 0.104 gkg-1d-1，换算成小鼠用量 1.144 gkg-1d-1，实验用高、中、低剂量分别相当于临床用量的 2 倍、1 倍、0.5 倍，即 2.288、1.144、0.572 gkg-1d-1；奥司他韦（规格：每粒 75 mg，每次 1 粒，每日2 次）根据人临床用量150 mg 60 kg-1 d-1，换算成小鼠用量 27.5 mg kg-1 d-1，实验用剂量相当于临床 1 倍6。灌胃 3 d 后造模，小鼠轻度麻醉后用 35 L 100TCID50的病毒溶液经鼻腔感染，滴鼻感染后正常饲养 5 d。2.2 小鼠一般状态观察及肺指数和肺指数抑制率的测定每天对各组小鼠的活动状态、毛发状况、精神状态、饮食和体重进行观察。感染第 5 天，小鼠称重后脱颈椎处死，取完整肺组织，剔除多余结缔组织称重。计算各组肺指数和肺指数抑制率，公式如下：肺指数（%）=100%肺湿重（g）体重（g）（公式 1）（公式 2）肺指数抑制率（%）=100%（模型组平均肺指数-药物组平均肺指数）（模型组平均肺指数-正常对照组平均肺指数）2.3 小鼠 Micro-CT 肺部扫描及病理学检测感染第 5 天对各组小鼠进行 Micro-CT 肺部扫描，参数设置如下：90 kV，88 mA 和 36 mm，每只小鼠的扫描时间为 2 min。扫描后小鼠称重取肺组织，取左肺浸泡于 4%多聚甲醛固定液中，用于苏木素-伊红（hematoxylin-eosin，HE）染色，其余肺组织冻于-80，用于蛋白免疫印迹实验和肺组织病毒载量检测。采中国药物警戒 第 21 卷第 1 期 2024 年 1 月 January,2024,Vol.21,No.147用全景组织扫描仪扫描各组肺组织切片，观察肺组织病理改变。2.4 小鼠肺组织病毒载量 Real-time PCR 检测研磨肺组织，采用 Trizol 法提取肺组织中的RNA，冻于-80备用。按照甲型流感病毒核酸测定试剂盒说明书进行后续操作。反应体系为 25 L，依照说明书推荐的循环参数设置条件：逆转录 10 min（45），预变性15 min（95），变性15 s（95），退火60 s（60），循环 40 次，单点荧光检测在 60。荧光通道选择 FAM 和 VIC。2.5 小鼠肺组织炎性因子表达检测肺组织研磨后静置 30 min，在 4离心机中以12 000 rmin-1、10 min 条件离心取上清液。按照酶联免疫吸附法试剂盒说明书进行加样、孵育、显色。于 450 nm下检测各样本的吸光度，计算肺组织中炎性因子 TNF-和 IL-6 的含量。2.6 小鼠肺组织 TLR4、MyD88 蛋白表达量检测取液氮研磨肺组织，参照蛋白质提取试剂盒使用方法制备蛋白样本。等量的蛋白质在 10%的聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳分馏，然后转移到 0.45 m PVDF 膜上。将膜依次与适当稀释的 Tubulin、TLR4和 MyD88 抗体在 4下慢摇孵育过夜。次日用 TBST洗膜 3 次，在二抗稀释液（110 000）中 37下慢摇孵育 1 h。然后用 TBST 清洗膜 3 次，根据制造商的说明，用超敏化学发光检测试剂盒检测蛋白条带。使用 Image J 软件来分析扫描图像的目标条带。2.7 统计分析所有的数据处理和分析都使用Graphpad prism7.0（Graphpad,San Diego，CA，United States）进行。数据以 x-s 表示。单因素方差分析（ANOVA）用于多组间差异的显著性比较。组间差异的显著性用 t 检验，以 P0.05 表示数据有统计学差异。3 实验结果3.1 疏风解毒胶囊对流感病毒感染小鼠一般状态的影响在正常对照组中，小鼠精神状态良好，行动迅速、毛发光滑、呼吸均匀、摄食良好、体重增长正常。模型组小鼠表现出不同程度的流感症状，包括活动减少、蜷缩体态、毛发失去光泽、饮水和饮食减少、体重减轻。与模型组相比，各给药组的小鼠精神状态稍有改善，活动量和体重均有一定程度的增加，尤其是奥司他韦组和 SFJD-高剂量组，整体情况良好。3.2 疏风解毒胶囊对流感病毒感染小鼠肺指数和肺指数抑制率的影响流感病毒感染引起小鼠病毒性肺炎，炎症渗出使肺重量增加，肺指数值越大，肺炎性病变程度越严重、病毒抑制率越低。与正常对照组比较，模型组肺指数显著升高（P0.001）；与模型组相比，阳性药奥司他韦组和 SFJD-高剂量组肺指数有所降低，且具有显著差异（P0.01），其肺指数抑制率分别为 68.21%、63.05%；与模型组相比，SFJD-中剂量组和 SFJD-低剂量组小鼠肺指数均有一定程度的降低，但无统计学意义，各组肺指数抑制率分别为44.47%和 39.54%，提示疏风解毒胶囊治疗流感病毒感染小鼠呈现一定的剂量依赖性，且高剂量效果最佳（图1）。3.3 疏风解毒胶囊对流感病毒感染小鼠肺组织病毒载量的影响感染第 5 天，取各组小鼠肺组织匀浆上清进行病毒载量检测。检测结果表明，正常对照组检测结果阴性，未检出流感病毒表达；与正常对照组比较，模型组核酸检测阳性，核酸载量显著增加，表明小鼠肺组织中流感病毒 RNA呈现阳性表达，具有统计学意义（P0.01）；与模型组比较，奥司他韦组、SFJD-注：A.肺指数；B.肺指数抑制率；与正常对照组比较，#P0.001；与模型组比较，*P0.01Note:A.Lung index;B.Inhibition rate of the lung index；Comparison with normal control group,#P0.001;Comparison with model group，*P0.01图1 疏风解毒胶囊对流感病毒感染小鼠肺指数和肺指数抑制率的影响（x-s，n=6）Figure 1 Effects of SFJD on the inhibition rate of lung index and lung index in mice infected with influenza virus（x-s，n=6）AB小鼠肺指数抑制率/%小鼠肺指数/%中国药物警戒 第 21 卷第 1 期 2024 年 1 月 January,2024,Vol.21,No.148高剂量组和 SFJD-中剂量组可明显降低小鼠肺组织中病毒核酸载量（P0.01，P0.05）（图 2）。司他韦组、SFJD-高剂量组和 SFJD-中剂量组小鼠肺组织肺泡壁轻度增厚，红细胞渗出较少，伴有少量炎性细胞浸润；SFJD-低剂量组肺组织病变情况较模型组有一定程度的改善，但仍可见肺泡腔、支气管腔内的大量红细胞渗出，炎性细胞浸润较多。以上结果提示疏风解毒胶囊能够减轻病毒感染小鼠肺组织病变，且最佳剂量组为 SFJD-高剂量组（图 4）。注：A.正常对照组；B.模型组；C.奥司他韦组；D.SFJD-高剂量组；E.SFJD-中剂量组；F.SFJD-低剂量组Note:A.Nor mal cont rol g roup;B.Model g roup;C.Oseltamivirphosphate group;D.SFJD-high-dose group,E.SFJD-medium-dose group;F.SFJD-low-dose group图 3 疏风解毒胶囊对流感病毒感染小鼠肺部 CT影像学的影响Figure 3 Effects of SFJD on Micro-CT of lungs of mice infected with influenza virus3.4 疏风解毒胶囊对流感病毒感染小鼠肺部CT 影像学的影响Micro-CT 结果显示，正常对照组小鼠肺部空气密度均匀，无斑点状阴影；模型组小鼠，肺部空气密度降低，图像呈现灰色，可观察到部分区域出现片状白色阴影（红色箭头），提示存在病理变化；与模型组比较，阳性药奥司他韦组和 SFJD-高剂量组小鼠肺部空气密度较低，斑点状阴影较少，而 SFJD-中剂量组和 SFJD-低剂量组小鼠肺部空气密度降低，图像呈现灰色，有少量散在斑点状阴影（图 3）。注：A.正常对照组；B.模型组；C.奥司他韦组；D.SFJD-高剂量组；E.SFJD-中剂量组；F.SFJD-低剂量组Note:A.Normal control group;B.Model group;C.Oseltamivirphosphate group;D.SFJD-high-dose group,E.SFJD-medium-dose group;F.SFJD-low-dose group 图 4 疏风解毒胶囊对流感病毒感染小鼠肺组织病理结构的影响（200）Figure4 Effects of SFJD on the histopathological structure of lung in mice infected with influenza virus（200）3.6 疏风解毒胶囊对流感病毒感染小鼠肺组织中炎性因子 TNF-、IL-6 表达量的影响小鼠感染 FM1 后肺组织中 TNF-和 IL-6 含量均有所升高。与模型组相比，阳性药奥司他韦组TNF-和 IL-6 含量均有一定程度的降低，具有统计学意义（P0.05；P0.001）；SFJD-高剂量组和 SFJD-中剂量组显著降低肺组织中 TNF-含量（P0.05；P0.01）；SFJD-高、中、低剂量组均能一定程度地降低肺组织中IL-6 含量，具有统计学意义（P0.01；P0.001）。以上结果表明疏风解毒胶囊能够降低肺组织炎症因子表达，保护肺组织（图5）。3.7 疏风解毒胶囊对流感病毒感染小鼠肺组织TLR4、MyD88 蛋白表达量的影响依据前期实验结果，SFJD-高剂量组治疗流感病毒感染小鼠的效果最佳，因此选择疏风解毒胶囊高剂量进行后续 TLR4、MyD88 蛋白表达的验证实验。蛋白免疫印迹实验结果表明：与正常对照组相比，模型组肺组织中 TLR4 和 MyD88 的蛋白表达明显增加（P0.05，P0.01）；与模型组相比，给予疏风解毒胶囊预防治疗后肺组织中 TLR4 和 MyD88的蛋白表达显著下调（P0.05）。提示疏风解毒胶注：与正常对照组比较，#P0.01；与模型组比较，*P0.01Note:Comparison with normal control group,#P0.01;Comparison with model group,*P0.01图 2 疏风解毒胶囊对流感病毒感染小鼠肺组织病毒载量的影响（x-s，n=6）Figure 2 Effects of SFJD on the viral load of lung tissue in mice infected with influenza virus（x-s，n=6）病毒载量/copiesmL-13.5 疏风解毒胶囊对流感病毒感染小鼠肺组织病理结构的影响肺组织病理结果显示正常对照组小鼠肺组织细胞结构正常，肺泡间隔未见水肿，无炎性细胞浸润。模型组小鼠肺组织支气管腔内可见红细胞渗出，部分肺泡结构发生改变，可见炎性细胞浸润；阳性药奥中国药物警戒 第 21 卷第 1 期 2024 年 1 月 January,2024,Vol.21,No.149囊可通过下调 TLR4 和 MyD88 的蛋白表达，起到一定的预防作用（图 6）。4 讨论中医学常把流感称作时行感冒，将其归属于“温病”“伤寒”“瘟疫”等范畴9-10。“疫病”多由疫戾邪毒上犯肺卫，皮毛先受邪气；肺气卫外，抵御病邪；治疗以“固护肺卫，扶正祛邪”立法为主。疏风解毒胶囊来源于民间验方，是由虎杖、连翘、甘草、马鞭草、板蓝根、败酱草、柴胡、芦根 8 味中药组成的复方制剂11。该药物通过其抗炎、免疫调节和抗病毒特性，在治疗上呼吸道感染和甲型流感（H1N1）等感染性疾病方面具有临床疗效12，是预防和治疗流感症状的一线中药13。药效学研究表明，疏风解毒胶囊对新冠病毒、冠状病毒 229E、甲型 H1N1 和 H3N2 流感病毒等均具有明显的抑制作用6。对甲型 H1N1/FM1、H1N1/PR8 病毒感染小鼠肺炎模型均有明显的治疗作用，可降低肺指数、肺组织中病毒载量、肺组织中炎性因子；降低死亡率并延长存活时间。疏风解毒胶囊不仅可用于治疗流感，还可作为流感的预防性用药。本实验研究结果表明，疏风解毒胶囊预防给药可改善感染小鼠一般状态，降低肺指数和肺组织病毒载量，有效抑制病毒的复制。流感病毒感染小鼠后，其肺组织出现大量炎症细胞浸润、充血及水肿，这与流感病毒性肺炎的临床表征一致14。Micro-CT 和病理结果显示疏风解毒胶囊可明显减轻肺组织病变，减少炎性细胞浸润和红细胞渗出，ELISA 结果表明预防给药能够降低肺组织中 TNF-和 IL-6 含量，降低炎症反应，以上结果提示疏风解毒胶囊预防给药对流感病毒感染小鼠有一定的保护作用。Toll 样受体（Toll-like receptors，TLRs）是一种型跨膜蛋白受体，可识别微生物上特定结构的病原相关分子模式（pathogen-associated molecular patterns，PAMPs）和宿主自身损伤细胞产生的损伤相关分子模式（damage-associated molecular patterns，DAMPs），在天然免疫中发挥着重要作用15。TLR4 是 TLR 家族中重要的成员，可能通过识别病毒颗粒的蛋白质注：A.肺组织中的 TNF-含量；B.肺组织中的 IL-6 含量；与正常对照组比较，#P0.05，#P0.001；与模型组比较，*P0.05，*P0.01，*P0.001Note:A.TNF-levels in lung tissue;B.IL-6 levels in lung tissue;Comparison with normal control group,#P0.05,#P0.001;Comparison with model group,*P0.05,*P0.01,*P0.001图 5 疏风解毒胶囊对流感病毒感染小鼠肺组织炎症因子TNF-、IL-6 表达量的影响（x-s，n=6）Figure 5 Effects of SFJD on the expression of inflammatory factors TNF-and IL-6 in lung tissues of influenza virus-infected mice（x-s，n=6）ABTNF-/pgmL in lungIL-6/pgmL in lung注：A.蛋白条带图；B.肺组织中 TLR4 蛋白表达量；C.肺组织中MyD88 蛋白表达量；与正常对照组比较，#P0.05，#P0.01;与模型组比较，*P0.05Note:A.Protein Strip Chart;B.TLR4 protein expression in lung tissue；C.MyD88 protein expression in lung tissue；Comparison with normal control group,#P0.05,#P0.01;Comparison with model group,*P0.05图 6 疏风解毒胶囊对流感病毒感染小鼠肺组织 TLR4、MyD88 蛋白表达量的影响（x-s，n=6）Figure6 Effects of SFJD on TLR4 and MyD88 protein expression in lung tissue of influenza virus-infected mice（x-s，n=6）ABCTLR4/TubulinMyD88/Tubulin中国药物警戒 第 21 卷第 1 期 2024 年 1 月 January,2024,Vol.21,No.150成分，参与感知病毒感染16，并激活下游信号调节物MyD88 调节机体发挥抗病毒作用。基于此，对 TLR4和 MyD88 蛋白进行蛋白免疫印迹分析，实验结果显示，与正常对照组相比，模型组TLR4、MyD88蛋白表达显著增加；与模型组相比，预防给药组显著下调TLR4、MyD88蛋白表达，提示疏风解毒胶囊可能是通过下调 TLR4 和 MyD88 的蛋白表达发挥作用。综上所述，疏风解毒胶囊预防性给药对流感病毒感染小鼠的保护作用可能与降低肺组织核酸表达量，减轻肺组织病理损伤、炎症损伤，以及下调TLR4 和 MyD88 的蛋白表达等作用有关。参考文献1 DU DD,LIU 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