利用mCherry荧光蛋白报告布鲁氏菌VirB启动子体外活性质粒的构建及应用.pdf

-0034-07网络首发时间：2 0 2 3-0 9-2 22024,54(01):34-40中国兽医科学2024,54(01)ChineseVeterinaryScienceDOI:10.16656/j.issn.1673-4696.2023.0217中图分类号：S852.614文献标志码：A文章编号：16 7 3-46 96（2 0 2 4)0利用mCherry荧光蛋白报告布鲁氏菌VirB启动子体外活性质粒的构建及应用陈彪,王振华,鲍佳鹏,冯紫佳,杨晓彤,孙悦，许行3,郑可4许玉静5,侯桂芳5,秦建华1*（1.河北农业大学，河北保定071000；2.石家庄圣博生物科技有限公司，河北石家庄050031;3.河北科技大学，河北石家庄050018；4.广西壮族自治区人民医院，广西南宁530021;5.河北省动物疫病预防控制中心，河北石家庄050026)摘要：布鲁氏菌病是由布鲁氏菌感染引起的人畜共患传染病，对养殖业的发展和人类的公共健康安全有着严重的危害。由VirB编码的IV型分泌系统（T4SS)为布鲁氏菌重要的毒力因子，布鲁氏菌侵染细胞后，吞噬体酸化被证实是VirB启动T4SS的主要信号，利用mCherry红色荧光蛋白作为报告基因，构建可以在体外酸性环境中检测VirB启动子活性的质粒，对于研究布鲁氏菌毒力基因的表达具有重要意义。以pBE-1质粒为骨架，构建质粒pBE-1-VirB-mCherry，以pBE-1-ptrc-mCherry质粒为阳性对照，通过电穿孔法转入布鲁氏菌S2株中，构建工程菌株S2(pBE-1-ptrc-mCherry）和S2（p BE-1-Vi r B-m Ch e r r y）。体外酸性环境下诱导工程菌株S2(pBE-1-VirB-mCherry），结果显示，mCherry荧光蛋白可以精准地报告VirB启动子的活性。结果表明，构建了利用mCherry荧光蛋白报告布鲁氏菌VirB启动子活性的质粒，并验证mCherry荧光蛋白可以精准反应布鲁氏菌VirB启动子在体外的活性，为研究布鲁氏菌毒力基因，揭示其IV型分泌系统致病机制奠定基础。关键词：mCherry荧光蛋白；布鲁氏菌；VirB启动子；IV型分泌系统Construction and application of in vitro active plasmids of the BrucellaVirB promoter were reported using mCherry fluorescent proteinCHEN Biao,WANG Zhenhua,BAO Jiapeng,FENG Zijia,YANG Xiaotong,SUN Yue,XU Hang,ZHENG Ke1,XU Yujing,HOU Guifang,QIN Jianhual*(1.Agricultural University of Hebei,Baoding 071000,China;2.Shengbo Biotechnology Co.,Ltd.,Shijiazhuang 050031,China;3.University of Science and Technology,Shijiazhuang 050018,China;4.People s Hospital of Guangxi Zhuang A utonomousRegion,Nanning 530021,China;5.Hebei Animal Disease Prevention and Control Center,Shijiazhuang 050026,China)Abatract:Brucellosis is a zoonotic disease caused by Brucella infection,which has serious harmto the development of breeding industry and human public health and safety.Type IV secretion systems(T4sS)encoded by VirB are important virulence factors of Brucella.After Brucella infects cells,phagosome acidification is confirmed to be the main signal for VirB to initiate T4SS.Using mCherry redfluorescent protein as a reporter gene,a plasmid that can detect VirB promoter activity in an acidicenvironment in vitro is constructed,which is important for studying the expression of Brucella viru-收稿日期：2 0 2 3-0 7-11；修回日期：2 0 2 3-0 9-18基金项目：河北省现代农业产业技术体系第三期奶牛创新团队建设项目（HBCT2023180201）；石家庄圣博生物科技有限公司研发基金项目（SBSW202201）作者简介：陈彪（1998-），男，河北廊坊人，硕士生，研究方向为奶牛病学，E-mail：136 312 50 97 q q.c o m。*通讯作者：秦建华（196 4-），男，教授，博士，研究方向为寄生虫和奶牛病学E-mail：q j h q q q 12 6.c o m。35陈彪等：利用mChe灾光蛋日报告布鲁氏菌VirB启动子体外活性质粒的构建及应用第1期lence genes.Plasmid pBE-1-VirB-mCherry was constructed with pBE-1 plasmid as backbone and transferredinto Brucella S2 strain by electroporation with pBE-1-ptrc-mCherry plasmid as positive control.Recom-binant strains S2(pBE-1-ptrc-mCherry)and S2(pBE-1-VirB-mCherry)were constructed.Recombinant strainS2(pBE-1-VirB-mCherry)was induced in acidic environment in vitro.The results showed that mCherryfluorescent protein could accurately report the activity of VirB promoter.In conculsion that of aplasmid was constructed to report the activity of Brucella VirB promoter using mCherry fluorescentprotein,and it was verified that mCherry fluorescent protein could accurately reflect the activity ofBrucella VirB promoter in vitro,which laid a foundation for studying Brucella virulence genes and re-vealing the pathogenic mechanism of its type IV secretion system.Key words:mCherry fluorescent protein;Brucella;VirB promoter;type IV secretion system*Corresponding author:QIN Jian-hua,E-mail:布鲁氏菌病(Brucellosis）简称布病，是由布鲁氏菌引起的一种人畜共患病。布鲁氏菌感染动物后主要侵害动物的生殖系统，表现为流产、睾丸炎和附睾炎等，人类主要通过接触患病动物或食用带有病原菌的动物副产品而感染，该病在世界范围内广泛流行，极难清除，对畜牧业发展带来了极大的威胁。布鲁氏菌感染的主要途径是通过胞内感染，由VirB启动子编码的IV型分泌系统（typeIVsecretionsystems,T4SS)为布鲁氏菌重要的毒力因子，T4SS对于布鲁氏菌在细胞内存活和繁殖是至关重要的，吞噬体酸化被证明是诱导T4SS启动的主要信号，可以使VirB启动子在巨噬细胞内特异性启动2 。mCherry荧光蛋白也叫樱桃荧光蛋白，是从蘑菇珊瑚(mushroom coral)分离出来的单体红色荧光蛋白，相对于其他单体荧光蛋白，mCherry因其颜色和单体分子的光稳定性，所以比其他的荧光蛋白标签更加优异，因此作为报告基因检测VirB启动子的体外活性具有很大的应用潜力。1材料与方法1.1菌种及试剂布鲁氏菌活疫苗（S2，批号2 0 2 30 0 2)购自天康生物制药有限公司。pBE-1质粒和pBE-1-ptrc-mCherry质粒由石家庄圣博生物有限公司保存。大肠杆菌（Escherichiacoli,E.coli)Match1-T1感受态细胞购自上海唯地生物技术有限公司。质粒快速小提试剂盒、琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒购自上海迈跟生物科技有限公司。细菌基因组DNA提取试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司。BsaI-HFv2限制性内切酶、T4DNALigase购自NewEnglandBiolabs 公司。Phanta Max Super-Fidelity DNAPoly-merase购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司。2XTaqPCRStarMix购自北京康润诚业生物科技有限公司。ProteinFind Anti-His Mouse MonoclonalAntibody购自北京全式金生物技术有限公司。硝酸纤维素印迹膜(NC印迹膜,规格为0.2 2 m）、T RI z o l购自生工生物工程（上海)股份有限公司。DEPC购自北京博奥拓达科技有限公司。PrimeScriptMRTreagentKitwithgDNAEraser(Perfect Real-time)购自宝日医生物技术有限公司。HieffUNICONUniversalBlueqPCRSYBRGreenMasterMix购自上海翌圣生物科技有限公司。RNALaterTM动物组织RNA稳定保存液购自碧云天生物技术有限公司。DAB显色试剂盒购自北京酷来搏科技有限公司。Omni-Easy一步法PAGE凝胶快速制备试剂盒购自上海雅酶生物医药科技有限公司。TSB培养基、苯酚、无水乙醇分析纯购自国药集团化学试剂有限公司。GEM培养基参考文献3 配方配制，每升含有MgSO47H,O0.2g,Cit-ric acid H,O 2.0 g,K,HPO4 10 g,NaNHHPO4 4H,O3.5g，葡萄糖2 0 g。矿物油购自生工生物工程（上海）股份有限公司1.2仪器及设备PCR仪及qPCR仪购自天隆科技有限公司。生物安全柜、COz培养箱购自Labconco公司。电泳仪电源、凝胶成像系统、半干电转仪购自北京君意东方电泳设备有限公司。微量分光光度计、电转仪、Bio-RadSDS-PAGE制胶器及电泳系统购自伯乐生命医学产品（上海）有限公司。高速离心机、恒温摇床购自山东博科生物产业有限公司。酶标仪购自美国伯腾仪器有限公司。多功能化学发光成像系统购自德国耶拿分析仪器股份公司1.3引物PCR引物见表1,由生工生物工程（上海）股份有限公司合成1.4布鲁氏菌S2菌株DNA的提取将布鲁氏菌S2疫苗株划线分离于TSA平皿36第54卷中国兽医科学表1PCR引物序列Table1PCR primer sequences引物名称引物序列（5 3）PrimersnamePrimerssequencepBE-1-FGGCTACGGTCTCCCTCTACCCCGTAGAAAAGATCAAAGGATCpBE-1-RGGCTACGGTCTCCGTAAGTTAGCTCACTCATTAGGCACCGGCTACGGTCTCCCCAATAATTCTAGA-mCherry-FGATTAAAGAGGAGAATACTmCherry-RGGCTACGGTCTCCAGAGCGGATAACAATTTCACACAGVirB-FGGCTACGGTCTCCTTACCTTGTTCACCGGCTAGCTGAAATCVirB-RGGCTACGGTCTCCTTGGAGGATCGTCTCCTTCTCAGAGAATGGJP-FCGGTGCCTAATGAGTGAGCTAAJP-RCTTGAAGCGCATGAACTCC16s RNA-FTAAGGGGACTGCCGGTGATA16s RNA-RTGCAGAGTGCAATCCGAACTmCherry-RT-FGGTACCCAAACCGCCAAACTmCherry-RT-RTCCCACTTAAAGCCTTCCGG上，37 培养3d后取出，挑取单菌落接于10 mLTSB培养基中培养2 4h，培养完成后使用高压蒸汽灭活法灭活，分装于1.5mLEP管中置于4保存。取1支灭活后的布鲁氏菌S2疫苗株菌液，按照细菌基因组DNA提取试剂盒操作，提取完成后于一2 0 保存。1.5质粒的构建以pBE-1质粒为模板，使用引物pBE-1-F/R为引物PCR扩增制备线性化的pBE-1质粒；以pBE-1-ptrc-mCherry质粒为模板，使用引物mCherry-F/R为引物PCR扩增mCherry基因片段；以布鲁氏菌S2菌株DNA为模板，使用引物VirB-F/R为引物PCR扩增VirB基因启动子片段。使用0.8%琼脂糖凝胶电泳检测目的条带位置正确后，使用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒对目的片段进行回收纯化操作，完成后使用微量分光光度计进行定量，对回收产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，结果正确后将回收产物置于4保存备用将 Bsa I-HFv2和T4DNA Ligase混成 GoldenGate EnzymeMix后，使用GoldenGate方法将胶回收产物和线性化的pBE-1质粒连接，将5LGold-enGate产物转化人Match1-T1感受态细胞中，然后涂布于含有卡那霉素的LB琼脂培养基上（千分之一加人50 mg/mL卡那霉素），筛选阳性克隆，将挑选的阳性克隆接种至含有卡那霉素的LB液体培养基中（千分之一加入50 mg/mL卡那霉素），37 200r/min培养3h，使用引物JP-F/R进行菌液PCR检测，选取2 个PCR正确的菌液进行质粒提取并送测序分析，将测序结果正确的重组质粒命名为pBE-1-VirB-mCherry1.6布鲁氏菌工程菌株的构建布鲁氏菌S2菌接人TSB培养基中,37 18 0r/min培养至对数生长前期（Doo为0.6），15静置30min,3718 0 r/m i n 培养2 0 min后放置冰上，42400g离心7 min收集沉淀菌体，使用去离子水洗涤菌体3次，加人10 mLBuffer(10%甘油，0.5%海藻糖，1mmol/LDTT)重悬菌体，分装于1.5mLEP管中于一8 0 保存。取2 只分装好的布鲁氏菌感受态分别加人30 ng的pBE-1-VirB-mCherry和pBE-1-ptrc-mCherry质粒，3.0 kV作用4ms，将质粒经电穿孔法转化至布鲁氏菌S2菌株感受态细胞中，加人50 0 L无抗的TSB培养基复苏6 h，取50 L菌液涂布含有卡那霉素的TSA平皿（千分之一加入50mg/mL卡那霉素）中筛选阳性克隆菌落，构建S2(pBE-1-ptrc-mCherry）和 S2（p BE-1-Vi r B-m Ch e r-ry)工程菌株，挑取单菌落,接人含有卡那霉素的TSB培养基中（千分之一加人50 mg/mL卡那霉素）,37 180r/min培养12 h，培养完成后于4保存备用。1.7体外低pH值诱导将S2（p BE-1-Vi r B-m Ch e r r y）工程菌株培养于10mLTSB培养基中，将培养至对数生长中期（D6o0为1.0)的菌液2 40 0 g离心7 min收集菌体，将收集的菌体重悬于10 mLpH4.0的GEM培养基中（千分之一加入50 mg/mL卡那霉素），诱导3、6、9、12h后，菌液加人1mLRNALaterIM动物组织RNA稳定保存液作用10 min，分装于2 mLEP管中，8 0 0 0r/min离心5min，收集菌体于一8 0 保存备用1.8qPCR检测mCherry报告基因表达情况取在GEM培养基（pH4.0环境中）诱导表达后和诱导表达前处理好的S2（p BE-1-Vi r B-m Ch e r r y）菌体，使用液氮研磨处理后，采用TRIzol法提取细菌 RNA,使用 PrimeScript M RT reagent Kit with gDNAEraser(PerfectReal-time)试剂盒和引物16 SRNA-R和mCherry-RT-R将RNA逆转录为cDNA,使用Hi-eff UNICON Universal Blue qPCR SYBR Green MasterMix试剂和设计好的基因特异性引物16 SRNA-R/F和mCherry-RT-R/F进行荧光定量检测，每个样品均设立空白对照（水)和阴性对照（无逆转录酶），根据qPCR相对定量计算公式，计算出mCherry报告基因的相对表达量1.9Western-blot验证低pH值诱导后mCherry表达的情况取2 mL S2(pBE-1-ptrc-mCherry)工程菌株的菌液作为阳性对照,2 mL低pH诱导3h的S237陈彪等：利用mCherry荧光蛋白报告布鲁氏菌VirB启动子体外活性质粒的构建及应用第1期(pBE-1-VirB-mCherry)工程菌株的菌液,2 mL低pH值诱导前的S2（p BE-1-Vi r B-m Ch e r r y）工程菌株的菌液，8 0 0 0 r/min离心5min收集菌体。使用50 L的去离子水重悬，加人5L10SDS-Loding，使用10L矿物油液封后，96 预变性处理10 min，经SDS-PAGE电泳后，转移至NC膜上。在转膜仪中按负极-滤纸-SDS PAGE胶-NC膜-滤纸-正极的顺序排放，电压8 0 V,20min后，取NC膜放到保护袋中，加人5%脱脂奶粉进行封闭，摇床6 5r/min培养1h。封闭完成后使用1XTBST洗涤10 min,将膜与一抗放入新的保护袋中4孵育过夜，1XTBST洗涤10 min，重复三次后使用DAB显色试剂盒37 避光孵育NC膜，最后置于背光板上曝光收集实验结果，观察报告基因的表达情况1.10检测mCherry荧光强度以GEM培养基（pH4.0环境）中诱导表达后的工程菌S2(pBE-1-VirB-mCherry）为实验组,TSB培养基(pH7.0环境）中培养的工程菌S2(pBE-1-VirB-mCherry）为对照组，培养3h后，千分之一体积加人10%苯酚与95%乙醇配制好的灭活剂，作用2 0 min。灭活剂作用后的4mL菌液,8 0 0 0 r/min离心1min集菌，然后使用10 0 L纯水重悬菌体，使用多功能化学发光成像系统观察mCherry的荧光效果。配制完成酶标仪检测样品后，放入酶标仪中，设置检测通道Ex580nm,Em620nm，检测mCherry荧光强度。2结果与分析2.1质粒的构建以pBE-1质粒为模板,PCR扩增获得352 2 bp大小的pBE-1质粒片段；以pBE-1-ptrc-mCherry质粒为模板,PCR扩增获得约10 18 bp的mCherry基因片段；以布鲁氏菌S2菌株DNA为模板,PCR扩增获得531bp大小的VirB基因启动子片段(图1)。与线性化pBE-1质粒链接构建pBE-1-VirB-mCherry质粒（图2），质粒图谱见图3，菌液PCR鉴定结果见图4。2.2VirB启动子体外活性分析将 pBE-1-ptrc-mCherry 和 pBE-1-VirB-mCherry经电穿孔法转化入布鲁氏菌S2菌株中，构建了工程菌株 S2(pBE-1-VirB-mCherry）和S2（p BE-1-p t r c-mCherry）。对工程菌株S2（p BE-1-Vi r B-m Ch e r r y)进行诱导表达前和不同时间段诱导表达后提取RNA，使用琼脂糖凝胶电泳进行RNA质量检测，结果见图5。反转录为cDNA，进行qPCR荧光定量检测mCherry报告基因表达情况，根据qPCR相对M1235.000 bp3.000bp2.000bp1 000bp750bp500bp250bp图1PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳Figure 1Agarose gel electrophoresis of PCR amplificationproductsM:DNA分子质量标准；l:pBE-1质粒；2:VirB基因3:mCherry基因。M:D2000 Plus DNA Marker;1:pBE-1 plasmid;2:VirB gene;3:mCher-ry gene.M15.000 bp3.000bp2.000 bp小1 000 bp750 bp500bp250bp图2 质粒的琼脂糖凝胶电泳Figure 2 Agarose gel electrophoresis for plasmidsM:DNA分子质量标准；l:pBE-1-VirB-mCherry质粒。M:D2000 Plus DNA Marker;1:pBE-1-VirB-mCherry plasmid.pBE-1-VirB-mCherry49814#图3pBE-1-VirB-mCherry质粒图谱Figure3pBE-1-VirB-mCherry plasmidmap38第54卷中国兽医科学M12345675 000bp3 000 bp2.000 bp1000bp750bp500bp250bp图4菌液PCR的琼脂糖凝胶电泳Figure 4 Agarose gel electrophoresis for bacterial solution PCRM:DNA分子质量标准；17:pBE-1-VirB-mCherry菌落的PCR检测。M:D2000 Plus DNA Marker;17:PCR detection of pBE-1-VirB-mCher-ry colonies.M1234565.000 bp3.000 bp2.000bp1 000 bp750bp500bp250bp图5琼脂糖凝胶电泳检测RNA质量Figure 5Determination of RNA quality by agarose gel elec-trophoresisM:DNA分子质量标准；1 2:诱导表达前的S2(pBE-1-VirB-mCherry)；36:GEM培养基于pH4.0环境下分别诱导表达3、6、9 h的S2(pBE-1-VirB-mCherry)。M:D2000PlusDNAMarker;1-2:S2（p BE-1-V ir B-m C h e r r y)b e-fore induction expression;36:GEM culture was based on pH 4.0 en-vironment to induce the expression of S2（p BE-1-Vi r B-m Ch e r r y）f o r3,6and9h,respectively.定量计算法计算出低pH诱导后mCherry报告基因的表达量，证明VirB启动子成功表达mCherry，且在GEM培养基pH4.0的环境中诱导3h,VirB启动子的活性是正常环境下的10 倍以上，结果见图6。以 S2(pBE-1-ptrc-mCherry)为阳性对照,对 GEM培养基于pH4.0环境下诱导表达后的S2（p BE-1-VirB-mCherry)工程菌株和TSB培养基诱导表达前的S2(pBE-1-VirB-mCherry）工程菌株进行West-ern-blot检测，验证mCherry报告基因的表达情况，结果显示，在布鲁氏菌S2菌株中VirB启动子可以成功表达mCherry报告基因，结果见图7。15-0h3h10-6h9h12h5-0036912时间/hTime图6qPCR检测mCherry报告基因诱导不同时间段的相对表达量Figure 6 qPCR detects the relative expression of mCherryreporter genes after different time periodsM123180ku130ku100 ku72ku55ku43ku33ku25ku17ku图7 Western-blot验证mCherry报告基因表达情况Figure 7 Western-blot verifies mCherry report gene expres-sionM：蛋白质分子质量标准；1：诱导表达前；2：GEM培养基pH4.0诱导3h表达后；3：阳性对照M:Protein molecular Marker;l:Before inducing expression;2:GEMmedium pH 4.0 induces 3 h expression;3:Positive control.2.3mCherry荧光强度将处理好的实验组与对照组工程菌S2(pBE-1-VirB-mCherry）放人多功能化学发光成像系统观察mCherry的荧光，使用绿光背景可以清楚观察到mCherry的红色荧光效果,结果见图8。将配制完成的实验组与对照组的样品放人酶标仪中检测，诱导后的荧光强度要高于诱导前的荧光强度，结果见图9。3讨论布病是由布鲁氏菌引起的一种人畜共患病，世界动物卫生组织（WOAH)将其列为B类疫病，我国将其列为二类动物疫病。布鲁氏菌感染动物后主要侵害动物的生殖系统，表现为流产、睾丸炎和附睾炎等4,该病在世界范围内广泛流行，难易清除，给畜39陈彪等：利用mCherry荧光蛋白报告布鲁氏菌VirB启动子体外活性质粒的构建及应用第1期对照组实验组Control groupExperimental group图8 多功能化学发光成像系统观察mCherry荧光效果Figure 8 Multifunctional chemiluminescence imaging sys-tem to observe mCherry fluorescence effect对照组：诱导表达前；实验组：GEM培养基pH4.0诱导3h表达后。Control group:Before inducing expression;Experimental group:GEMmedium pH 4.0 induces 3h expression.200150-100-50-0-对照组实验组Control groupExperimental group图9使用酶标仪检测诱导前后mCherry荧光蛋白的荧光强度Figure 9 Detection of the fluorescence intensity of mCherryfluorescent protein before and after induction us-ingamicroplatereader对照组：诱导表达前；实验组：GEM培养基pH4.0诱导3h表达后。Control group:Before inducing expression;Experimental group:GEMmedium pH4.0 induces 3h expression.牧业发展带来了极大的威胁。据报道，世界上超过85%的国家和地区均存在布病流行的情况，尤其是发展中国家更为严重，受布病危害的人数超过世界人口总数的2 0%。我国作为人口基数大的发展中国家，畜牧业在国民经济中占有极其重要的地位，布病不仅危害我国经济的发展，而且对公共卫生安全有巨大的潜在风险5。因此布病的防治是保证我国畜牧业发展和公共卫生安全的重要措施布鲁氏菌主要的感染方式为胞内增殖，由VirB启动子编码的IV型分泌系统（T4SS）为布鲁氏菌重要的毒力因子6-8 ,T4SS对于布鲁氏菌在细胞内存活和繁殖至关重要9-11。当布鲁氏菌被巨噬细胞吞噬后，吞噬体酸化，VirB操纵子被迅速激活，编码的T4SS帮助布鲁氏菌逃逸胞内溶酶体的降解，并促进BCV小体移行至内质网建立胞内复制环境12 ,使布鲁氏菌完成胞内存活和繁殖。本研究通过构建原核表达质粒，体外模拟吞噬体酸化环境，证明mCherry基因可以在VirB启动子的调控下成功表达，预示mCherry荧光蛋白作为报告基因在布鲁氏菌的研究中具有一定应用潜力。试验通过PCR扩增VirB启动子片段构建S2(pBE-1-VirB-mCherry)菌株，通过模拟胞内吞噬体酸化，在体外pH4.0的环境下诱导VirB启动子，启动表达mCherry荧光蛋白,经Western-blot验证和RT-qPCR检测，mCherry荧光蛋白可以准确报告布鲁氏菌VirB在体外的活性。利用mCherry红色荧光蛋白作为报告基因构建了一种新的布鲁氏菌VirB启动子活性的报告系统，该报告系统可以在体外模拟吞噬体酸化的环境中准确报告VirB启动子的活性。同时mCherry红色荧光蛋白相较于其他的单体荧光蛋白具有很好的稳定性和发光性，同时它的颜色还可以和应用较为广泛的绿色荧光蛋白（GFP)进行共同标记。和传统的报告基因如荧光酶基因（luc)需要ATP、M g 2+、O 2存在的条件下氧化发光来说13-14,mCherry红色荧光蛋白很直观，可以直接检测到荧光。因此利用mCherry红色荧光蛋白作为报告基因构建布鲁氏菌VirB启动子活性报告系统，对于布鲁氏菌毒力基因的鉴定以及布鲁氏菌致病机制的研究具有很大潜力。参考文献(Referneces)1李小明，田波，杨儒爱，等.布鲁氏菌病的危害及流行情况概述J.兽医导刊，2 0 195）：2 9-30.LI Xiaoming,TIAN Bo,YANG Ruai,et al.Overview ofthe harm and prevalence of brucellosisJ.Veteri-naryGuide,2019(5):29-30.(inChinese)2AHMED W,ZHENG K,LIU Z F.Small non-coding RNAs:Newinsights in modulation of host immune response byintracellular bacterial pathogens J.Frontiersin Immunology,2016,7:431.3KULAKOV Y K,GUIGUTALET P G,RAMUZ M R,et al.Re-sponse of Brucella suis 1330 and B.canis RM6/66 togrowth at acid pH and induction of an adaptive acidtolerance responseJ.Microbiological Research,1997,148(2):145-151.4刘炳滟.布鲁氏菌S2疫苗株核酸标识序列分析及鉴别诊断方法建立的研究D.沈阳：沈阳农业大学，2 0 2 1.LIU Bingyan.Study on nucleic acid identification何知宇）40第54卷中国兽医科学sequence analysis and differential diagnosis methodof Brucella S2 vaccine strainD.Shenyang:ShenyangAgricultural University.,2021.(in Chinese)5罗德炎.布氏杆菌新型疫苗的构建及免疫保护效果的研究D.重庆：第三军医大学，2 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