结核分枝杆菌潜伏感染抗原Rv2628c-Rv1737c融合蛋白的原核表达与免疫原性分析.pdf

,()中 国 人 兽 共 患 病 学 报C h i n e s eJ o u r n a l o fZ o o n o s e sD O I:/j i s s n 实验研究结核分枝杆菌潜伏感染抗原R v c R v c融合蛋白的原核表达与免疫原性分析解建辉,李昆,孙卫国,贺雄,朱琰,张灵霞国家科技重大专项(N o Z X )通讯作者:张灵霞,E m a i l:z h a n g l i n g x i a c o m;O R C I D:作者单位:滦州市人民医院,滦州 ;解放军总医院第八医学中心,结核病诊疗新技术北京市重点实验室,北京 摘要:目的原核系统表达、纯化结核分枝杆菌潜伏感染抗原R v c R v c融合蛋白,并检测其能否被结核感染者外周血P BMC细胞识别,通过小鼠模型判定其免疫原性.方法按照原核系统密码子特点,全基因合成R v c R v c表达核酸序列,构建表达质粒p E T a R v c R v c,原核细胞内诱导表达、亲和层析纯化R v c R v c蛋白;分离不同患者样本P BMC细胞,抗原刺激后,通过q P C R分析I F N mR NA表达差异,判定融合蛋白能否被T B感染者识别;联合融合佐剂DMT免疫B A L B/c小鼠,检测体液免疫应答水平.结果原核克隆的重组表达质粒p E T a R v c R v c测序正确,融合蛋白以包涵体表达形式存在,经复性、亲和纯化后,分子量为 k D a,纯度 以上.以R v c R v c融合蛋白刺激T B感染者,尤其T B潜伏感染(L T B I)者,外周血P BMC细胞I F N mR NA水平高于健康对照者(P);同时,B C GR v c R v c/DMT诱导小鼠能产生高水平的I g G抗体.结论原核重组可获得高纯度R v c R v c融合蛋白,其作为潜伏感染抗原,可被T B感染者P BMC细胞识别,具有较强的免疫原性,是具有潜力的T B候选亚单位疫苗靶抗原,可用于T B感染尤其是潜伏感染的预防及实验室诊断.关键词:结核分枝杆菌;潜伏感染;R v c蛋白;R v c蛋白;干扰素中图分类号:R 文献标识码:A文章编号:()P r o k a r y o t i ce x p r e s s i o na n d i mm u n o g e n i c i t ya n a l y s i so f l a t e n t i n f e c t i o na n t i g e nR v c R v c f u s i o np r o t e i no fM y c o b a c t e r i u mt u b e r c u l o s i sX I EJ i a n h u i,L IK u n,S UN W e i g u o,HEX i o n g,Z HUY a n,Z HANGL i n g x i a(L u a n z h o uP e o p l esH o s p i t a l,L u a n z h o u ,C h i n a;B e i j i n gK e yL a b o r a t o r yo fN e wT e c h n i q u e s o fT u b e r c u l o s i sD i a g n o s i sa n dT r e a t m e n t,I n s t i t u t e f o rT u b e r c u l o s i sR e s e a r c h,t h eE i g h t hM e d i c a lC e n t e ro fG e n e r a lH o s p i t a l o fP L A,B e i j i n g ,C h i n a)A b s t r a c t:A c c o r d i n gt ot h ec o d o nc h a r a c t e r i s t i c so ft h ep r o k a r y o t i cs y s t e m,w es y n t h e s i z e dt h eo p t i m i z e d R v c R v cn u c l e i ca c i ds e q u e n c e a n dc o n s t r u c t e d t h e e x p r e s s i o np l a s m i dp E T a R v c R v c A f t e r s e q u e n c i n g,e x p r e s s i o ni nEc o l iw a s i n d u c e d T h e f u s i o np r o t e i nw a s f o u n d i n i n c l u s i o nb o d i e s A f t e r r e n a t u r a t i o na n da f f i n i t yc h r o m a t o g r a p h yp u r i f i c a t i o n,t h eR v c R v cr e c o m b i n a n tp r o t e i n,w i t ham o l e c u l a rw e i g h to f k D aa n dap u r i t ye x c e e d i n g,w a so b t a i n e d T h e r e c o m b i n a n t p r o t e i nw a su s e d t os t i m u l a t eP BMCc e l l s f r o md i f f e r e n t p a t i e n t s,a n d t h ed i f f e r e n c e s i n I F N mR NAe x p r e s s i o nw e r e a n a l y z e dw i t hq P C R T h eR v c R v c f u s i o np r o t e i ns t i m u l a t e dp a t i e n t sw i t hT B,p a r t i c u l a r l y l a t e n tT Bi n f e c t i o n(L T B I)T h e l e v e l o f I F N mR NAi nP BMCc e l l sw a sh i g h e r t h a nt h a t i nh e a l t h yc o n t r o l s(P)M i c e i mm u n i z e dw i t hB C GR v c R v c/DMTs h o w e ds i g n i f i c a n t i n d u c t i o no fh i g hl e v e l so f I g Ga n t i b o d i e s R v c R v cr e c o m b i n a n tp r o t e i n,a sa l a t e n t i n f e c t i o na n t i g e n,i s r e c o g n i z e db yP BMC s c e l l s i n f e c t e dw i t hT B,w i t hs t r o n g i mm u n o g e n i c i t y,a n dt h u sm a ys e r v e a s ap o t e n t i a lT Bs u b u n i t v a c c i n e t a r g e t a n t i g e n T h i sp r o t e i nm a yb eu s e d t op r e v e n tT B i n f e c t i o n,p a r t i c u l a r l y l a t e n t i n f e c t i o n,a n dt op e r f o r ml a b o r a t o r yd i a g n o s i s K e y w o r d s:M y c o b e c t e r i u mt u b e r c u l o s i s;L T B I;R v cp r o t e i n;R v cp r o t e i n;I F N S u p p o r t e db yt h e N a t i o n a lS c i e n c ea n d T e c h n o l o g y M a j o rP r o j e c t(N o Z X )C o r r e s p o n d i n ga u t h o r:Z h a n gL i n g x i a,E m a i l:z h a n g l i n g x i a c o m结核病(t u b e r c u l o s i s,T B)是由结核分枝杆菌(M y c o b a c t e r i u mt u b e r c u l o s i s,MT B)感染引起的一种慢性传染性疾病,我国每年约万人死于结核病,是结核病高负担国家之一,其中 的病例由于缺乏高灵敏度和特异度的诊断方法而无法确诊,没有得到适当的诊断和治疗.目前全世界将近有三分之一的人口可能感染有MT B.结核病的发生、发展进程主要是由MT B与机体免疫系统之间的相互作用所决定的,当MT B逃避人体的免疫攻击或者与人体免疫处于一种动态平衡后,可在体内处于持续感染或呈潜伏性感染(l a t e n tt u b e r c u l o s i si n f e c t i o n,L T B I)状态,早期识别和预防结核潜伏感染成为结核病控制的一个重要组成部分.MT B潜伏感染定义为机体对MT B抗原刺激产生的持久性的反应,临床上没有任何活动性结核病征象.研究发现,在L T B I者中,存在可能有 会因为免疫力低下、并发感染等原因发展为活动性结核病.L T B I没有特异性的临床症状和实验室诊断指标,目前尚缺乏统一的方法和金标准对其进行诊断;同时,针对L T B I还没有有效的保护性疫苗阻止L T B I发展为活动期结核病.在结核病的发病和发展过程中,人体的机体免疫功能发挥了关键作用,在机体淋巴细胞的免疫应答过程中,T细胞接触结核分枝杆菌的特异性抗原后成为记忆性T细胞,当再次接触MT B的特异性抗原时,T细胞将分化成为效应T细胞的同时释放多种细胞因子,包括变化水平高的 干扰素(i n t e r f e r o n ,I F N ).因此,可以通过检测I N F 含量变化或者释放I N F 的T淋巴细胞的数量来判断生物个体是否感染MT B,MT B基因组发现约 个开放阅读框,编码几千种蛋白分子,选择什么结核分枝杆菌刺激抗原就变得尤为重要,同时需要保证检测抗原的敏感性和特异性.当结核分枝杆菌进入休眠期时,一些与潜伏感染有关的基因包括D o sR(d o r m a n c ys u r v i v a lr e g u l o n)调节子进行表达,这些MT B潜伏感染相关抗原帮助结核杆菌对抗宿主免疫活性细胞,在L T B I人群中,这类潜伏抗原激发机体产生免疫反应.R v c、R v c是受D o sR调控的潜伏感染相关抗原,研究发现R v c、R v c能诱导潜伏感染者产生较强的I F N 反应 .本实验室前期以R v c抗原刺激样本外周血单核细胞(p e r i p h e r a lb l o o dm o n o n u c l e a r c e l l s,P BMC s)也发现,R v c抗原在L T B I患者组中引起的I F N 分泌水平高于T B患者组以及健康人群组.同时,在B C G菌体内R v c基因表达减弱,但在休眠期的结核杆菌内正常表达.本研究根据结核分枝杆菌抗原刺激T B感染 人 群 释 放I N F 原 理,以E S AT /C F P 和MT B全菌裂解液蛋白为对照抗原,依据R v c、R v c抗原刺激特点,原核重组获得R v c R v c融合蛋白,验证其可否特异性诱导MT B感染者P BMC s细胞产生高水平的I F N ,根据L T B I者中诱导的特异性I F N 水平显著高于活动期感染者的特性,以期区分活动期病人和L T B I者;同时证实R v c R v c可被MT B感染者尤其是L T B I者外周血T细胞特异性识别,从而进一步研究用于T B融合蛋白疫苗构建的靶抗原可行性.对象与方法研究对象收集解放军总医院第八医学中心结核病医学部 年住院的 例活动期肺结核病人,男性 例、女性 例,年龄 岁,平均 岁.排除糖尿病、高血压等基础疾病以及其他合并症的临床期,所有结核病患者均进行胸部X线检查,发现有浸润性病变,符合活动性结核病(a c t i v et u b e r c u l o s i s,AT B)诊断标准.潜伏感染者样本选自总医院第八医学中心体检中心,无发热、咳嗽和咳痰等症状,影像学检查肺部无病灶,通过干扰素释放实验判定为潜伏感染者,共 例,男女各 例,年龄 岁,平均 岁.同时,选择体检中心健康体检者 例,男女各 例,年龄 岁,平均 岁,常规体检项目和胸部X线检查均显示正常.本研究通过单位伦理委员会审批,所有受试者均已签署知情同意书.实验动物实验动物S P F级雌性B A L B/c小鼠 只,周龄,体重 g,从中国疾病预防控制中心实验动物中心购进.动物实验经单位伦理委员会审查通过.试剂大肠杆菌(E s c h e r i c h i ac o l i,Ec o l i)DH 、B L (D E)菌株和载体p E T a本实验室保存;全基因合成与测序由北京华大生物公司完成;限制性内切酶、T 连接酶、I P T G购自天根生化科技(北京)有限公司;淋巴细胞分离液F i c o l l、N i NT A蛋白纯化树脂购自美国G E公司,本室灌装柱;T B感染T细胞检测试剂盒(T B I G R A)购自万泰生物药业股份有限公司;蛋白质相对分子质量m a r k e r(美国s i g m a公司);R PM I 培养基和胎牛血清购于以色列B I公司;R I P A细胞裂解液购于美国S i g m a公司;羊抗人I g G、酶标二抗、B C A蛋白定量试剂盒和牛血清白蛋白(B S A)购于北京索莱宝公中 国 人 兽 共 患 病 学 报 ,()司;S Y B R荧光定量试剂盒和反转录试剂盒均购自T a K a R a公司;其它试剂为进口或国产分析纯.MT B抗原准备R v c R v c蛋白原核重组与纯化根据G e n B a n k中 公 布 的R v c(N p )和R v c(N p )蛋白氨基酸序列,参照Ec o l i体内表达密码子喜好特点,采用R v c L i n k e r R v c融合模式对所需融合蛋白对应核酸密码子序列进行全基因合成,表达载体为p E T a,限制性酶切位点为N d eI和X h oI,柔性L i n k e r氨基酸序列为G G G G S G G G G S.全基因核酸序列由北京华大基因公司合成,构建亚克隆表达载体p E T a R v c R v c,通 过 热 激 法 转 化Ec o l iB L (D E),融合蛋白的C端自带有H i s标签,通过柱上复性和亲和纯化对表达的重组蛋白进行纯化.MT BH R v全菌裂解液的制备保存方法为将MT B临床标准株H R v(AT C C )复苏后用 H 培养基于P 实验室 条件下进行液体培养周,条件下,r/m i n离心收集沉淀菌体,条件下水浴 m i n,再用无菌P B S进行充分 重 悬,冰 浴 条 件 下 进 行 超 声 破 碎,r/m i n离心收集上清,为H R v全菌裂解液,B C A定量分装后 冰箱保存.E S AT /C F P 多肽合成由于无法购得标准品,同时前期实验发现以重组E S AT C F P 融合肽作为抗原刺激时产生较多的非特异性,本研究MT B抗原E S AT 和C F P 多肽由北京赛百盛公司合成,其中每条多肽长度为 个氨基酸,相邻片段重复个氨基酸,共 条多肽,以P B S溶解保存.人外周血单个核细胞的分离与刺激采集各研究样 本 抗 凝 血 m L,按 照 等 比 比 例 以R PM I 基础培养基稀释,然后使用等比F i c o l l密度梯度离心(室温 g,m i n),吸取中间细胞层获取P BMC s,再加入 m LR PM I 不完全培养液充分洗涤,离心(室温 g,m i n),弃上清,沉淀即为P BMC s.抗原刺激时,按照/m L接种P BMC s.实验抗原刺激浓度分别为:R v c R v c融合蛋白浓度为g/m L;全菌裂解 液(l y s a t e)浓 度 为g/m L;E S AT /C F P 多 肽(p o o l)浓 度 为 g/m L(每 条 多 肽 浓 度 为g/m L),刺激 h后,收集细胞,加入T r i o z l,充分震荡,使细胞溶解于T r i o z l,放置 保存,实验方法参照文献 进行.P BMC s细胞总R NA的抽提与c D NA合成常规乙醇沉淀法提取总R NA:T r i o z l细胞混合物进行室温融化,加入m L氯仿,剧烈振荡 s,室温放置m i n;r/m i n、条件下离心 m i n,取上清到无R NA a s eE P管内,加入异丙醇m L进行上下颠倒混匀,静置 m i n;r/m i n、条件下离心 m i n,弃上清,使用冰浴的m L无核酸酶水稀释的 乙醇清洗R NA沉淀;干燥数分钟后加入无R N a s e水 L,震荡混匀;以A g i l e n t 对R NA样本的浓度、纯度和完整性进行检测,冰箱保存.吸取样本R NA至 L反应体系中进行反转录成c D NA,反转录条件为:温浴 m i n复制,条件下s.将反应产物按 进行稀释后分装,保存备用.I F N mR NA的检测登录N C B I网站,借用p r i m e r B L A S T程序设计I F N 的荧光定量P C R引物,合 成 的 序 列 如 下:上 游 GAG T G T G GAGA C C AT C AAG ,下 游 T GAG T T C AT G T AT T G C T T T G ;实验以看家基因GA P DH作为内参,合成引物为:上游 G C A C C G T C AAG G C T GAGAA C ,下 游 T G G T GAAGA C G C C AG T G GA .以S Y B RG r e e nI荧光定量试剂盒检测mR NA的表达.反应体系为 L,包含c D NA模板L,水L,S Y B RG r e e nM I X L,上下游引物稀释浓度为 m o l/L,反应体系各加入L.P C R反应条件为:变性m i n;变性 s,退火与延伸 s,共计 个循环.实验动物分组及免疫对 只 g雌性B A L B/c小鼠,随机分为P B S、B C G、佐剂组(弗氏不完全佐剂)、融合蛋白(R v c R v c)佐剂组和B C G融合蛋白佐剂组,每组只,经皮下点注射免疫.用P B S配制m g/m L的融合蛋白,与DMT佐剂等体积混合,乳化,制备融合蛋白DMT佐剂混悬液.B C G组注射次;P B S和融合蛋白DMT佐剂组每周注射次,共次;B C G融合蛋白DMT佐剂组在免疫B C G 周后,用融合蛋白DMT佐剂加强免疫次,间隔周.各组每次注射剂量均为 L/只,B C G注射剂量约为 C F U/只.免疫后周,将各组小鼠处死,取脾脏提取淋巴细胞,摘眶采血,收集血清.E L I S A法检测小鼠血清结核特异性抗体水平取融合蛋白以包被缓冲液进行稀释至 g/m L,孔酶标板每孔加 L,酶标板置湿盒中放置过夜;取出酶标板,吸去包被液,洗板次;每孔加入 稀释的血清 L,孵育h;洗板次;将HR P标记的羊抗鼠I g G抗体 期解建辉,等:结核分枝杆菌潜伏感染抗原R v c R v c融合蛋白的原核表达与免疫原性分析稀释,每孔加入 L,孵育h;洗板次;加入等比混合的显色液A、B液,每孔 L,避光放置 m i n;每孔加入终止液 L,以空白孔为零点,在酶标仪检测波长 n m的吸收值.E L I S A法检测小鼠脾细胞培养上清中抗原特异性T h 型细胞因子水平在 孔板中每孔加入 个小鼠脾细胞,R PM I 培养基、MT B全菌裂解液、融合蛋白分别作为阴性、阳性和实验组刺激物.阴性对照孔加入R PM I 完全培养基,L/孔;实验孔加入 L融合蛋白,终浓度为 g/孔;阳性对照孔加 L MT B全菌裂解液,终浓度为 g/孔.置 培养 h,g离心 m i n,收集上清.采用鼠细胞因子E L I S A检测试剂盒进行检测,具体操作按说明书进行.统计学分析I F N mR NA的相对表达采用相对定量 C t表示,C tC tI F N C tGA p DH.采用G r a p h p a dp r i s m软件对数据分析生成散点图,并进行独立样本t检验和o n ew a yANOV E检验分析两组和多组样本间I F N mR NA的表达差异,数据采用平均值标准差(xs)表示,P 为差异具有统计学意义.结果潜伏感染抗原R v c R v c原核重组与纯化对R v c R v c蛋白密码子核酸序列根据原核系统表达特点进行优化,全基因合成后,克隆到表达载体为p E T a,测序正确,成功构建原核表达载体p E T a R v c R v c,转化Ec o l i感受态 细 胞B L (D E)进 行 原 核 重 组 表 达,以 S D S P AG E电泳发现重组蛋白以包涵体的形式存在(图).包涵体经尿素溶解后,进行柱上复性,以 mm o l/L咪唑洗涤目的蛋白,S D S P AG E电泳分析纯度.结果如图所示,纯化后的重组蛋白纯度在 以上,分子量大约为 k D a(R v c分子量为 k D a、R v c分子量为 k D a)同预期结果一致,B C A蛋白浓度测定融合蛋白浓度为m g/m L.健康者外周血P BMC s受不同MT B抗原刺激前后I F N mR NA表达差异刺激前健康者I F N mR NA表达量为 ,经E S AT /C F P (p o o l)和R v c R v c抗原刺激后,P BMC s中I F N mR NA表达量分别为(t,P)和(t ,P),刺激前后差异无统计学意义(P);但健康者P BMC s注:M低分子量蛋白标准;未诱导的全菌体;诱导的全菌体;超声沉淀;超声上清.图R v c R v c蛋白原核表达形式S D S P A G E分析F i g A n a l y s i s o fR v c R v cp r o t e i ne x p r e s s i o n i nap r o k a r y o t i c s y s t e m注:M低分子量蛋白标准;上样前溶解的包涵体;和纯化后R v c R v c.图R v c R v c蛋白柱上复性与亲和纯化S D S P A G E分析F i g S D S P A G Ea n a l y s i so fR v c R v cp r o t e i na f t e r c o l u m nr e n a t u r a t i o na n da f f i n i t yp u r i f i c a t i o n经MT B全 菌 裂 解 液 混 合 物 刺 激 后,P BMC s中I F N mR NA表达量出现明显上升,由刺激前的上升到刺激后的(t,P ).见图.AT B患者P BMC s受 不 同MT B抗 原 刺 激I F N mR NA表达差异活动期结核病患者P B MC s经不同的MT B抗原刺激后,I F N mR NA的表达量均出现明显变化,其中经E S AT /C F P (p o o l)抗原多肽刺激后,P BMC s中I F N mR NA表达量上升为 ;经潜伏感染 相 关 抗 原R v c R v c刺 激 后,P BMC s中I F N mR NA表达量上升为 ;经MT B全菌裂解液刺激后,P BMC s中I F N mR NA表 达 量 上 升 为 .AT B患者P BMC s经不同抗原刺激,I F N mR NA的表达量差异有统计学意义(F中 国 人 兽 共 患 病 学 报 ,(),P ).结果见图.图健康者P BMC s经不同M T B抗原刺激前后I F N m R N A表达差异F i g I F N m R N Ae x p r e s s i o nd i f f e r e n c e si n P BMC sf r o mh e a l t h y i n d i v i d u a l s a f t e r s t i m u l a t i o nw i t hd i v e r s eM T Ba n t i g e n s图A T B患 者P BMC s经 不 同MT B抗 原 刺 激 前 后I F N m R N A表达差异F i g I F N m R N Ae x p r e s s i o nd i f f e r e n c e s i nP BMC s i np a t i e n t sw i t h A T Ba f t e rs t i m u l a t i o nw i t hd i v e r s eM T Ba n t i g e n sL T B I者P B M C s受不同MT B抗原刺激I F N mR NA表达差异与活动期结核病患者P BMC s相似,潜伏感染结核病患者P BMC s经不同的MT B抗原刺激后,I F N mR NA的表达量均出现明显变化,其中,经E S AT /C F P (p o o l)抗原多肽刺激后P BMC s中I F N mR NA表达量上升至;经潜伏 感 染 相 关 抗 原R v c R v c刺 激 后,P BMC s中I F N mR NA表达量上升至 ;经MT B全菌裂解液刺激后,P BMC s中I F N mR NA表达量上升至 .L T B I者P BMC s经不同抗原刺激,I F N mR NA的表达量差异有统计学意义(F ,P ).结果见图.图L T B I者P BMC s经不同M T B抗原刺激前后I F N m R N A表达差异F i g I F N m R N Ae x p r e s s i o nd i f f e r e n c e s i nP BMC s i np a t i e n t sw i t hL T B Ia f t e rs t i m u l a t i o nw i t hd i v e r s eM T Ba n t i g e n sR v c R v c刺激不同人群血清P BMC s后I F N mR NA表达差异与刺激前相比,AT B和L T B I者的P BMC s在经过R v c R v c刺激后,I F N mR NA的表达量均出现显著升高,分别上升到 (t ,P )和 (t ,P ),组样本经R v c R v c刺激后,I F N mR NA的表达量差异有统计学意义(F ,P ).见图.图R v c R v c刺 激 不 同 人 群P BMC sI F N m R N A表达差异F i g I F N m R N Ae x p r e s s i o nd i f f e r e n c e s i nP BMC s i nd i f f e r e n t p o p u l a t i o n s a f t e r s t i m u l a t i o nw i t hR v c R v ca n t i g e n s期解建辉,等:结核分枝杆菌潜伏感染抗原R v c R v c融合蛋白的原核表达与免疫原性分析各组小鼠血清中抗原特异性I g G抗体水平免疫后周,处死小鼠,用MT B全菌裂解液和 融合蛋白分别检测各小鼠血清抗体水平.P B S组小鼠用MT B全菌裂解液和融合蛋白检测,均无明显特异性I g G抗体产生;用融合蛋白检测,B C G组抗体水平与P B S组差异无统计学意义(t,P),融合蛋白DMT佐剂组和B C G融合蛋白DMT佐 剂 组 抗 体 水 平 较P B S组 显 著 升 高(t融合蛋白佐剂 ,tB C G融合蛋白佐剂 ,均P).用MT B全菌裂解液检测时,B C G组、融合蛋白DMT佐剂组和B C G融合蛋白DMT佐剂组与P B S组比较,抗体水平均有显著提升(tB C G,t融合蛋白佐剂,tB C G融合蛋白佐剂,均P),结果如图所示.图R v c R v c免疫小鼠产生I g G抗体值分析F i g A n a l y s i so fI g Ga n t i b o d yl e v e l s i nm i c e i mm u n i z e dw i t hR v c R v c各组小鼠脾细胞特异性T h 型细胞因子水平处死小鼠后分离、培养脾淋巴细胞,用MT B全菌裂解液和融合蛋白刺激时,P B S组均分泌最低水平的I L 、I F N 和T N F ;佐剂组与P B S组分泌I L(t,P)、I F N (t,P)、T N F (t,P)无差异,其他各组分泌I L (tB C G,t融合蛋白佐剂,tB C G融合蛋白佐剂 )、I F N (tB C G ,t融合蛋白佐剂 ,tB C G融合蛋白佐剂 )和T N F (tB C G,t融合蛋白佐剂,tB C G融合蛋白佐剂)与P B S组差异均有统计学意义(均P).融合蛋白刺激时,B C G组分泌各细胞因子水平均低于融合蛋白佐剂组(tI L ,tI F N ,tTN F ,均P)和B C G融合蛋白佐剂组(tI L ,tI F N ,tTN F ,均P).MT B全菌裂解液刺激时,融合蛋白佐剂组分泌各细胞因子水平均低 于B C G组(tI L ,tI F N ,tTN F ,均P)和B C G融合蛋白佐剂组(tI L ,tI F N ,tTN F ,均P).实验结果见图.图各组小鼠脾细胞分泌抗原特异性I F N (A)、T N F(B)和I L (C)水平F i g A n t i g e ns p e c i f i cI F N (A),T N F (B),a n dI L (C)l e v e l ss e c r e t e db ys p l e e nc e l l sf r o m m i c ei ne a c hg r o u p讨论L T B I无特异性的症状和体征指标,实验室诊断缺乏统一的方法和金标准.虽然L T B I者无传染性,但当机体因为消瘦、疲劳和其他并发症导致免疫力降低时,会导致MT B大量增殖,发展为活动性结核,严重情况下引发全身播散性结核,如消化道结核、骨结核,尤其是引起结核性脑膜炎 .寻找快速、有效的诊断方法鉴别L T B I者并对其进行预防性治疗,是减少活动性结核发生的有效途径.I F N 是机体对抗结核分枝杆菌感染的一类重要的T h 型细胞因子,主要由活化的T细胞和NK细胞产中 国 人 兽 共 患 病 学 报 ,()生,I F N 对阻碍和杀灭机体胞内MT B有重要作用.研究发现,I F N 受体缺乏则可能使人群对T B的易感性升高.结核病患者在不同感染状态具有特异性的抗原特征谱,通过免疫分析可以区分不同 感 染 状 态.本 项 研 究 中,选 择R v c R v c融合蛋白作为T B患者靶抗原,通过刺激不同样本人群P BMC细胞I F N mR NA水平的检测,发现相对于刺激前,其可特异性诱导MT B感染者P BMC细胞产生高水平的I F N ,尤其在L T B I者中诱导的特异性I F N 水平显著高于AT B感染者.实验发现,R v c R v c相对于E S AT /C F P 抗原多肽具有较高的敏感性,对MT B全菌裂解液而 言又具有较 强的特异性,同时AT B和L T B I人群P BMC s受R v c R v c融合蛋白刺激时,I F N mR NA表达均出现上调,分别上升到 和 ,利用R v c R v c抗原刺激I F N 表达差异特性以区分T B患者临床活动 性 期 与 潜 伏 感 染 期.本 实 验 中 出 现 样 本 受R v c R v c抗原刺激后出现假阴性现象,存在原因可能是受试者因为自身免疫力低下的原因造成,同时 样本的受融 合抗原刺激 后,阳性样本 的I F N 表达出现明显的个体差异,这需要在后续实验中进行条件优化,提高检测的平行性.蛋白亚单位疫苗是研究新型有潜力的结核疫苗之一,筛选出能够被MT B感染者T细胞免疫识别的潜力靶抗原,是构建更强保护力的新型T B亚单位疫苗的保证.目前多数进入临床试验的T B蛋白疫苗保护性有限.MT B感染者中含有大量L T B I人群,对这类人群进行预防保护,阻止发展成为AT B患者,是 年消灭结核病的关键一环.目前认为结核抗原诱导T h 型免疫应答水平(尤其是抗原特异性I F N 水平)与抗T B保护性密切相关.诱导效应性和记忆性C D 和C D T细胞产生高水平I F N 和I F N /I L 多功能应答效应,成为评价候选疫苗靶抗原免疫原性的重要依据.A r r o y o等 比较D o sR、重组融合蛋白E S AT C F P (E C )和结核菌素(P P D)抗原刺激潜伏感染人群和活动性结核患者的外周血单核淋巴细胞,检测细胞上清液I F N 水平,认为p f k B是区分L T B I和活动性感染组的最优单一抗原,作为D o sR调控蛋白,R v c、R v c均属于潜伏感染相关抗原,本实验鉴于I F N 释放试验和潜伏感染抗原的免疫特点,通过原核系统重组、表达和纯化获得R v c R v c融合蛋白,去刺激AT B和L T B I人群均检测到I F N mR NA表达水平在两者具有差异和较强特异性,在鉴别AT B和L T B I人群上具有潜在应用价值.另外实验小鼠模型中,R v c R v c/DMT和B C GR v c R v c/DMT免疫小鼠均可诱导出I F N 、T N F 和I L 因子的高水平分泌,以及产生特异性I gG.T N F 参与了肉芽肿的形成,其协同I F N 共同诱导单核细胞和粒细胞向感染病灶的迁移,控制MT B感染,因此重组R v c R v c/DMT诱导小鼠产生以T h 型细胞反应为主的免疫应答.实验数据证实,重组R v c R v c/DMT的免疫效果低于B C G组,这也佐证B C G作为减毒活菌疫苗,能在较长时间内持续刺激机体免疫反应,引起的免疫反应比单一抗原或组合抗原引起的免疫反应要强,而B C G R v c R v c/DMT组 比R v c R v c/DMT组及B C G的免疫效果都要强,说明R v c R v c组合蛋白能增强B C G的免疫效果,可以用于构建重组卡介苗,或者用于卡介苗接种后的加强接种.本研究获得的R v c R v c蛋白能刺激T B患者尤其是L T B I者外周血T细胞特异性识别,诱导小鼠产生以T h 型细胞反应为主的免疫应答,而且可以增强卡介苗的免疫应答,因此可作为靶抗原用于构建融合多肽抗原的T B增强保护型亚单位疫苗及重组卡介苗.利益冲突:无引用本文格式:解建辉,李昆,孙卫国,等结核分枝杆菌潜伏感染抗原R v c R v c融合蛋白的原核表达与免疫原性分析J中国人兽共患病学报,():D O I:/j i s s n 参考文献:WHO G l