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中草药鉴定种特异性DNA探针的筛选方法【摘要】 基因芯片技术为中草药高效、并行、快速鉴定提供了可能。而中草药种特异性探针的筛选是中草药基因芯片鉴定技术开发的关健。文章结合当今中药鉴别芯片和其它物种鉴定芯片研究进展总结了几种适合中草药特异性探针筛选的方法。【关键词】 基因芯片； 中草药鉴别； 种特异； DNA探针Abstract:DNA chip technology makes it feasible to identify Chinese herbal medicine rapidly, efficiently and in parallel. The screening of species-specific DNA probes from medicinal plants is the key step in developing DNA chip for the authentication of Chinese herbal medicines. Combined with current DNA chip researches on identification of herbal plants or other species, some methods available for the screening of medicinal plants species-specific DNA probes were summarized in this paper.Key words：DNA chip; Herbal medicine; Species-specific DNA Probe 在中药材基因鉴别和特征性基因测序的基础上，建立以基因诊断和基因芯片为载体的中药材分子鉴别技术和方法是今后中药生物技术研究中的努力方向之一1。中药鉴定的基因芯片技术是指采用原位合成或显微打印手段，将中药种特异性DNA探针固定在玻璃片、尼龙膜或其它支持物表面上，形成二维DNA探针阵列，然后与荧光或DIG标记待检中药基因组DNA样本杂交，通过检测杂交信号来实现对中药的准确、并行、高效地检测。虽然DNA芯片技术已广泛应用于DNA测序2、单核苷酸多态性分析3、基因表达分析4、基因诊断5、药物筛选6、微生物种类鉴定等7各个方面，但应用于中药鉴定尚处于起步阶段，近年来随着基因芯片技术的广泛应用，国内外一些研究机构已开始研究使用基因芯片对中药(材)进行鉴别8，9。采用基因芯片技术鉴定中药的基本过程是10：应用分子生物学技术找出待鉴定中药的特定寡核苷酸序列；以此寡核苷酸序列作为探针，装配到芯片上；检测样品的提取、扩增和标记；杂交检测及结果分析。其中找出待定中药的特定DNA序列是建立中草药鉴定基因芯片的关键。本文结合近年来中药及其它物种鉴别芯片研究进展总结了几种可用于中草药特异性DNA片段筛选的方法，并对这些方法的优势和不足做出评价。 1 利用现有药用植物基因资源筛选其特异性片段 首先，登录GeneBank网站，在核酸数据库中检索研究对象及其相关种属的基因序列(如植物的rRNA的ITS序列或微卫星序列或某种功能基因)，应用分析软件，对这些序列进行对齐和分析，得到碱基对齐图和聚类分析的结果。然后根据对齐图找出具有高度多态性的区段，在这一区段用Primers程序设计引物并在相应区段结合Oligo 程序找出所有可能的探针，经过筛选后在Genebank中进行Blast查询，筛选出特异性最好的片段作为探针使用。 这种方法简单、快捷，充分利用了现有的基因资源。目前很多微生物检测探针11,12及植物cDNA探针13都是根据已公开的基因序列设计的。然而，对于大多数药用植物种类，其遗传背景很不清楚。已注册的药用植物DNA 序列的数量相对于总的药用植物资源非常有限，而且这些已知序列中大多集中在少数植物种类14，所以，这种方法只适合于遗传背景比较清楚或已有相关序列发布的药用植物。 2 通过构建的DNA文库筛选 这种方法要求先构建DNA克隆文库或cDNA文库，然后从文库中随机选出若干克隆，将各克隆插入片段斑点印迹在杂交膜上(如硝酸纤维膜、尼龙膜)，用标记的本种基因组和其他种基因组的总DNA 为探针分别进行斑点杂交，选择与本种基因组杂交时杂交信号强，而与其他基因组杂交时无杂交信号的克隆，该克隆的插入序列即为本种基因组的特异序列。 Q. Cai.Bullen15从梯牧草属(Phleum)两个野生种P. alpinum和P. bertolonii的DNA文库中分别筛选到它们的特异性探针。首先，提取P. alpinum 和P. bertolonii的总DNA，用Sau3AI部分酶切，然后将消化后片段用pUC19作为载体克隆到E. coli DH5amcr.构建了P. alpinum和P. bertolonii的部分基因组DNA文库，接着从P. alpinum DNA文库中选了1230个克隆，从P. bertolonii DNA文库中选了1320个克隆斑点印迹在膜上，最后和通过缺口平移法采用32P-dCTP 标记的P. alpinum和P. bertolonii总基因组探针杂交，根据杂交信号挑选到P. alpinum特异性克隆8个，P. bertolonii特异性克隆13个，对其进行测序后筛选到3个P. alpinum特异性探针和3个P. bertolonii特异性探针。还有其它通过类似方法筛选到植物种特异性探针的例子16,17。 这种方法可以一次筛选大量克隆，能得到相当数量的探针，主要问题是构建DNA库过程比较繁琐，耗时费力，文库质量也会影响筛选效果。再是如果从cDNA文库中筛选，因cDNA是切除了内含子的DNA序列，而很多内含子本身在种间具有高度多态性，这些序列的切除会降低种特异性探针的筛选效率。 3 从nrDNA筛选 因结构和功能上的差异，植物基因组不同部位的序列变异速度很不一致，一般情况编码区比较保守，而非编码区序列因其功能上的限制较少, 比编码区表现出更快的进化速率，不同种间各编码序列或非编码序列的变异方式和速率也是千差万别。植物细胞核中编码rRNA 的基因分编码区和非编码区，其中编码区的18S 与， 与26S基因间被两个非编码区ITS1和ITS2所间隔。它们共同组成一转录单位顺反子(cistron) ，顺反子高度重复(几百至几千次) , 以串联的方式排列于核染色体上, 并且这些核糖体RNA 顺反子拷贝表现出高度的均一性(homogeneity) 18。据此特征，可根据保守区序列设计引物，扩增出易变异区DNA片段，通过对扩增产物测序分析后，从中筛选出可做为种特异性探针的寡核苷酸序列19。 ITS (内转录间隔区)高等植物中nrDNA序列差异主要表现在ITS、ETS 及IGS 等非编码区上。被子植物中ITS 序列既具有核苷酸序列的高度变异性又有长度上的保守性。有研究表明18：被子植物大多数科属其ITS 序列的种间差异值为% ， 属间差异值为% ，这对系统发育研究来说都是较合适的范围，也适合从这些序列中筛选种特异性探针。Zhang Y B等20将16个不同种属石斛的 序列固定于玻片上制作了基因芯片，并用荧光标记的ITS2 序列作为探针,可检测出5种已被载入中国药典的石斛。该基因芯片还可检测出含有9 种不同的中药材复方中的石斛。刘建全等21从市售“藏茵陈”药材中提取DNA , PCR 扩增 rDNA-ITS2 整个片段， 扩增产物直接测序得到约700 bp 片段，采用排序和系统发育分析软件分析“藏茵陈”原植物的亲缘关系， 据此设计的特异性分子快速鉴定试剂盒可对市场上的藏茵陈进行检测。26S rDNAnrDNA编码区比较保守，但其中有些可变区，不同的植物类群，其可变区变异率有很大差别。对于变异率大的类群，可以据此从中筛选到鉴别DNA探针。 为了对不同种的贝母进行区分，香港城市大学及香港理工大学的研究者22设计了一种基因芯片可有效地对不同种的贝母进行区分。他们首先提取9种贝母球茎的基因组DNA ，用引物对(上游引物 5- GAG TCG GGT TGT TTG GGA-3；下游引物 5- GCT ATC CTG AGG GAA ACTTC-3) 对其26S rDNA 基因D2 与D3 区进行扩增和测序，从其多态性区段设计了各种属特异性寡核苷酸探针，然后将不同种属寡核苷探针点置于经多聚赖氨酸处理包被的芯片。用来自不同种贝母的荧光素标记的PCR产物与DNA 芯片进行杂交，可在芯片特定位置检测到不同种贝母的荧光信号从而达到区分不同贝母的目的。 陈月琴等23从采自陕西秦岭和广东自然保护区的杜仲中提取总DNA ，PCR 扩增产物与质粒载体PTZ19 连接，Sanger 终止法测定26S rDNA 片段， 采用计算机分析软件Pcgene 610 比较了金缕梅、栓皮栎、水青树、领春木及前人测定的8 种植物的同源序列， 找出其特征性核苷酸序列，为进一步开展杜仲的专一性核酸分子探针研究奠定基础。 rDNA Carles Maria等24设计和制作了一种能鉴别有毒中草药的DNA芯片。 芯片中种特异性寡核苷酸探针来源于Aconitum carmichaeli， A. kusnezoffi， Alocasia macrorrhiza， Croton tiglium，等17种中药的 rRNA 基因及Aconitum pendulum 和 Stellera chamaejasme的Leu-tRNA 基因，这些探针通过巯基连接固定在硅片上，靶基因序列通过不对称PCR扩增和荧光标记后与芯片杂交，通过这种并行的基因分型技术可以将多种有毒草药种类鉴别出来。18S rDNAG. fragilis是一种产生大量粘液状物质的微藻，在亚德里亚海的大量繁殖时严重影响水产和旅游业。为了对其进行监测，F. TintiL等25从G. fragilis 的18S rDNA 中筛选出了可用作检测海水中G. fragilis的寡核苷酸探针。主要过程是：从培养的G. fragilis细胞提取其总DNA，用引物对16S1N-16S2N 扩增其18S rDNA 基因，对扩增产物纯化后进行测序，测序结果与GeneBank中Lingulodinium polyedrum, Gonyaulax spinifera, Protoceratium reticulatum的同源序列进行比对，比对后发现G. fragilis的18S rDNA核苷酸序列与其它种有明显的不同，因此可用此序列用于G. fragilis鉴定的特异性探针或制成芯片用于海水中这种有害藻种的常规监测。 从上述例子可以看到有些探针的是从rRNA编码区基因筛选出来，因这些区段的保守性，在不同品种间的变化比较有限，难于筛选到有较大差异的长探针，对有些类群的植物甚至难于奏效，如需鉴别的种类较近缘时，从非编码区筛选可能会得到更好的结果。 4 从叶绿体DNA matK，trnL基因筛选 目前常用于生药分析的叶绿体基因组中的基因片段有核酮糖-1, 5-二磷酸酯羧化酶基因( rbcL ) ， 编码成熟酶基因(matK) ， 编码RNA 聚合酶B亚基基因( rpoC) ，编码tRNA-lysine基因( trnL) ，编码核糖体大亚基蛋白16基因 ( rpl16) ，编码核糖体小亚基蛋白4基因 ( rps4) 等26。其中matK基因在叶绿体基因组中的所有编码蛋白基因中进化速率最快，常被用来研究被子植物科内水平的近缘关系研究中。再就是trnL基因，trnL 基因内有三段非编码区， 由于不受功能的限制， 其进化速率大于功能编码区，目前被广泛用于植物系统学研究，也可以作为种特异性探针筛选的目标区段。 目前还未见从叶绿体基因中筛选中药鉴别探针的报道，但应用其相关序列进行鉴别的事例很多，如章群27运用PCR产物直接测序法测定杜仲原植物matK基因序列，通过Clustal软件将其与GenBank中同源序列进行排序比较，发现32个特异性位点和一个杜仲所独有的GAC插入序列，结论认为matK基序列的测序分析可成为杜仲正品鉴定的有效手段。 5 从差减DNA克隆库中筛选 抑制差减杂交法是Diatchenko等28所创立，最初是应用于建立差异cDNA文库，它是一种在差减cDNA和RDA的基础上发展起来的基于PCR的差异基因表达筛选方法。其基本原理是利用链内退火优于链间退火，比链间退火更稳定，从而使非目的序列片段两端反向重复序列在退火时产生类似于“锅柄”的结构，无法与引物配对，从而选择性地抑制了非目的片段的扩增，而差异片段得到富集。 李同祥29利用该方法进行石斛鉴别DNA探针的筛选。首先获得两种石斛之间差减片段，然后选部分差异片段克隆分别和所有实验石斛的总DNA杂交，从中筛选出能与同种石斛DNA杂交而与其它种DNA不能杂交的克隆作为该种石斛专属DNA探针，将这些探针点在尼龙膜上制成微阵列，可灵敏而快速地鉴别出迭鞘石斛(D. aurantiacum Kerr)，金钗石斛(D . nobile Lind.)，铁皮石斛(D .ofcinale K imura et Migo)，鼓糙石斛( Lindl.)，流苏石斛( Hook)。因抑制差减杂交法的筛选目标基因是整个基因组，所以可以得到大量的探针，而且可以得到长碱基序列的探针，选择更近缘的种做为Driver有利于提高差减克隆中种特异性探针的比例，从而提高筛选效率，不足之处是过程比较复杂，各步骤反应条件难于把握。 6 利用RAPD、AFLP分子标记构建探针 RAPD、AFLP分子标记不但可以直接用来进行中药材的鉴别和药材道地性鉴定，还可以通过回收RAPD，AFLP多态性产物，克隆后作为RFLP探针32或作为筛选人工染色体文库(BAC、YAC文库)的特异性探针33，或对多态性产物进行测序，设计特异性引物探针34，用于中草药的鉴别。 此方法涉及4个步骤: DNA 抽提；RAPD或AFLP 扩增；特异性条带的回收测序；探针的设计和验证。庄南生等35应用AFLP标记技术获得了甘蔗祖亲种的AFLP特异片段478条，对其中部分AFLP特异片段通过斑点杂交和Southern杂交分析，筛选出了5个甘蔗属特异性探针，2个斑茅特异性探针。通过RAPD或AFLP的方法不设计引物，方法上比较简单省事，但获得的探针数量有限，很多情况难以得到探针。 综上所述，中药鉴别种特异性探针可以从多种途径获得，可以根据特定的设计选择有效的筛选途径。需要指出的是某DNA同源区段具多态性并不代表能从其中筛选出特异性探针，这是因为特异性探针在长度、碱基组成及其与其它种相应区段的变异程度都有一定的要求；另外，为提高芯片鉴别的准确性，有必要制备同一物种的多枚探针以增强其特异性，即使这样，这种特异性是相对的，只是增加探针的数量会最大限度地减少其它植物种类中同时出现相同序列的概率。随着中药现代化的进程及分子生物学技术在中药研究中更广泛的应用，会有越来越多的中药基因特征性序列被揭示，只有足够数量中草药种类相应的特异性探针被设计出来，利用基因芯片技术对中药的并行、快速、高效的检测才能真正实现。【参考文献】 1曾庆平.生物医药前沿技术M.北京：人民卫生出版社，2004：690. 2Arlinghaus H F, Ostrop M, Friedrichs O, et al. 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