复方野菊花眼贴对蓝光诱导小鼠睑板腺功能异常的防治作用及其机制.pdf

实验研究117.ChinJebriiart2024.Vo1.42.No.2中华实验眼科杂志2 0 2 4年2 月第42 卷第2 期复方野菊花眼贴对蓝光诱导小鼠脸板腺功能异常的防治作用及其机制李勇黄彩虹?李清坚2王玉倩？吕雨霏3张兆强？胡皎月？文刘祖国？南华大学附属第二医院眼科，衡阳42 10 0 0；厦门大学附属厦门眼科中心福建省眼科与视觉科学重点实验室福建省眼再生医学工程研究中心厦门大学眼科研究所厦门大学医学院，厦门36 110 2；南华大学附属第一医院眼科，衡阳42 10 0 0通信作者：刘祖国，Email：z u g u o l i u x m u.e d u.c n【摘要】目的探讨复方野菊花眼贴对蓝光诱导小鼠脸板腺功能异常的防治作用及其机制。方法将64只15周龄雄性C57BL/6J小鼠按照随机数字表法分成2 个部分，每部分32 只，分别进行预防实验和治疗实验。预防实验和治疗实验各32 只小鼠分别按照随机数字随机分为正常组、蓝光组、溶剂组和眼贴组，每组8只。预防实验中，除正常组外，各组小鼠采用波长46 0 nm、光照度2 0 0 0 lx的蓝光，每天暴露6 h，连续暴露15d建立小鼠脸板腺功能异常模型；溶剂组和眼贴组每天在蓝光暴露前和暴露后，分别用相对应眼贴敷贴预防2 5min，连续15d,蓝光组仅接受蓝光暴露15d处理，并于第15天行脸板腺开口照相观察小鼠脸板腺功能。治疗实验中，除正常组外，各组小鼠均采用上述方法建立小鼠脸板腺功能异常模型，溶剂组和眼贴组在结束15d的蓝光暴露后，每天早上和下午分别用相对应眼贴敷贴治疗2 5min，连续15d，蓝光组置于标准环境中观察15d,并在第15天行脸板腺开口照相观察小鼠脸板腺功能变化。预防实验及治疗实验的各组小鼠在处理完成后进行离体脸板腺拍照、油红0 染色、苏木精-伊红染色观察小鼠脸板腺组织学变化；采用实时荧光定量PCR法检测各组脸板腺组织中炎性因子白细胞介素1（IL-1）、IL-6、肿瘤坏死因子（T NF-）、干扰素（IFN-）m RNA 相对表达量；采用Westernblot法检测脸板腺组织中核因子（NF）-k B和磷酸化NF-kB（p-NF-k B)蛋白的表达，评估复方野菊花眼贴对蓝光诱导小鼠脸板腺炎症的改善程度。结果与正常组相比，蓝光组暴露后15d小鼠脸板腺开口阻塞数量逐渐增加，脸板腺下脸相对剩余面积逐渐减小，差异均有统计学意义（均P0.05）。预防实验中，眼贴组脸板腺开口阻塞数量为1.8 330.7 53，明显少于溶剂组的3.6 6 7 1.033，眼贴组脸板腺下脸相对剩余面积为0.7 18 0.0 91,明显大于溶剂组的0.6 2 40.130，差异均有统计学意义（均P0.05）。苏木精-伊红染色结果显示，蓝光组和溶剂组脸板腺有炎性细胞浸润；眼贴组无炎性细胞浸润，腺泡形态接近正常组；油红O染色结果显示各组脸板腺均无明显脂质沉积。眼贴组IL-1、IL-6、T NF-、IFN-mRNA相对表达量明显低于溶剂组，眼贴组NF-kB、p-NF-k B蛋白相对表达量明显低于溶剂组，差异均有统计学意义（均P0.05）。苏木精-伊红染色结果显示，蓝光组和溶剂组脸板腺有炎性细胞浸润，眼贴组无炎性细胞浸润，腺泡形态接近正常组；油红O染色结果显示各组脸板腺均无明显脂质沉积。眼贴组IL-1、IL-6、IFN-mRNA相对表达量明显低于溶剂组，眼贴组NF-kB、p-NF-k B蛋白相对表达量明显低于溶剂组，差异均有统计学意义（均P0.05）。结论复方野菊花眼贴可通过抑制NF-kB信号通路减轻脸板腺组织炎症反应，对蓝光诱导的脸板腺功能异常具有防治作用【关键词】炎症；蓝光；脸板腺功能异常；复方野菊花眼贴基金项目：国家自然科学基金（8 2 2 7 10 54、8 19 0 0 8 2 5）D01:10.3760/115989-20230217-00055Preventive and therapeutic effects of compound wild chrysanthemum eye pad on blue light-induced alterationof meibomian gland function in miceand its mechanismLi Yong,Huang Caihong,Li Qingjian,Wang Yuqian,Lyu Yufei,Zhang Zhaoqiang”,Hu Jiaoyue,Liu Zuguo?Department of Ophthalmology,The Second Hospital,University of South China,Hengyang 421000,China;XiamenUniversity Afiliated Xiamen Eye Center,Fujian Provincial Key Laboratory of Ophthalmology and Visual Science,FujianEngineering and Research Center of Eye Regenerative Medicine,Eye Institute of Xiamen University,School of MedicineXiamen University,Xiamen 361102,China;Department of Ophthalmology,The First Afiliated Hospital of University o0825.118.ChinJExpOpthaimolFebruary2024,Vol.42,No.2中华实验眼科杂志2 0 2 4年2 月第42 卷第2 期South China,Hengyang 421000,ChinaCorresponding author:Liu Zuguo,Email:AbstractObjectiveTo investigate the preventive and therapeutic effects of compounddwildchrysanthemum eye pad on blue light-induced alteration of meibomian gland function in mice and its mechanism.Methods Sixty-four 15-week-old male C57BL/6J mice were divided into two groups of 32 mice each according torandom numbers for the prevention test and the treatment test.The respective 32 mice in the prevention and treatmentexperiments were randomly divided into normal group,blue light group,solvent group and eye pad group according torandom numbers,with eight mice in each group,respectively.In the prevention experiments,mice in each group wereexposed to blue light at a wavelength of 460 nm and a light intensity of 2 000 lx for 6 hours per day for 15 consecutivedays to establish a mouse model of meibomian gland function changes except for the normal group.The solvent groupand the eye pad group were treated with the corresponding eye pad before and after the blue light exposure for 25minutes daily for the 15 consecutive days.The blue light group was treated with blue light exposure only for 15 days,and the mice were photographed at the edge of the meibomian gland on day 15 to observe the function of themeibomian gland except for the normal group.In the treatment test,all groups of mice except the normal group wereinduced the altered function of the mouse meibomian gland by the above method.The solvent and eye pad groups weretreated with corresponding eye pads for 25 minutes in the morning and afternoon of each day for 15 consecutive daysafter blue light exposure.The blue light group was kept in a standard environment for 15 days and the changes inmeibomian gland function of mice were detected by meibomian gland photographs on day 15.Photography of the eyelidmargin in vitro,oil red O staining,and hematoxylin-eosin staining were performed to observe the histologic changes in themeibomian glands of mice after the preventive and experimental treatment.The relative expression of interleukin-1p(IL-1),IL-6,tumor necrosis factor-(TNF-),and interferon-(IFN-)mRNA in mouse meibomian gland tissueswas detected by real-time fluorescence quantitative PCR.The expression of nuclear factor-kB（NF-k B）a n dphosphorylation of NF-kB(p-NF-kB)proteins in mice meibomian gland tissues was detected by Western blot toassess the degree of amelioration of blue light-induced inflammation in mouse meibomian glands by the compound wildchrysanthemum eye pad.This study was conducted in accordance with the Statement of the Association for Research inVision and Ophthalmology on the Use of Animals in Ophthalmology and Vision Research,and was approved by theAnimal Ethics Committee of Xiamen University(No.XMULAC20220258).Results Compared with the normalgroup,a gradually increased number of blocked meibomian gland openings,and a gradually decreased remaining areaof lower meibomian gland,were observed in the mice after 15 days of blue light group,and all the differences werestatistically different(all at P0.05).In the prevention test,the number of obstructed opening in the eye pad groupwas 1.8330.753,which was significantly less than 3.6671.033 in the solvent group(P0.05).The relativeremaining area of the lower lid meibomian gland in the eye pad group was 0.7180.091,which was significantlygreater than 0.6240.130 in the solvent group(P0.05).Hematoxylin-eosin staining showed inflammatory cellinfiltration in mouse meibomian gland in the blue light and solvent groups.There was no inflammatory cell infiltrationin eye pad group,and the morphology of the acini was similar to that of the normal group.Oil red O staining showedthat there was no significant lipid deposition in the groups.The relative expressions of IL-1,IL-6,TNF-,and IFN-mRNA were significantly lower,and the relative expressions of NF-kB and p-NF-kB proteins were significantly lowerin the eye pad group than in the solvent group,showing statistically significant differences(all at P0.05).Hematoxylin-eosinstaining showed inflammatory cell infiltration in mouse meibomian glands in the blue light and solvent groups,with asimilar morphology of acini as in the normal group.There was no inflammatory cell infiltration in eye pad group.Oilred O staining showed that there was no significant lipid deposition in the groups.The relative expressions of IL-1,IL-6,and IFN-mRNA were significantly lower and the relative expressions of NF-kB and p-NF-kB proteins weresignificantly lower in the eye pad group than in the solvent group(all at P0.05).Conclusions Compound wildchrysanthemum eye pad may have preventive and therapeutic effects on blue light-induced changes in meibomiangland function by reducing the inflammatory response of meibomian gland tissue through the inhibition of the NF-kBsignaling pathway.Key wordsInflammation;Blue light;Meibomian gland dysfunction;Compound wild chrysanthemum eye padFund program:National Natural Science Foundationational Natural Science Foundation of Chinaa（8 2 2 7 10 54,8 19 0 0D0I:10.3760/115989-20230217-00055?119ChinJebruiai4.Vol.42.No.2中华实验眼科杂志2 0 2 4年2 月第42 卷第2 期脸板腺是位于上眼脸和下眼脸的一种特殊皮脂腺，在脸板中呈上下垂直排列。脸板腺通过分泌特定的脂质来维持眼表泪膜的稳态，脂质的主要功能是润滑眼表以防止眼表水分挥发，并保护眼表免受外来病原体的威胁2-4。脸板腺功能障碍（meibomian glanddysfunction，M G D)以慢性炎症反应为中心环节，是一种以脸板腺终末导管萎缩和/或脸酯分泌的量或质发生异常为主要特征的慢性、弥漫性脸板腺病变，可导致泪膜稳定性改变，产生眼表炎症和刺激症状5，是导致干眼的主要原因。MCD的全球患病率为3.5%70.0%6，目前其治疗方式主要分为物理治疗、药物治疗和手术7 ，但既往方法普遍存在治疗成本高、操作难度较大、治疗周期长、效果较差、对患者伤害较大、不能完全满足患者的需求等问题。有研究表明，复方野菊花眼贴在干眼治疗中获得了较好的临床效果8 ,其是否对干眼主要致病因素之一的MCD也具有防治作用尚不清楚。本研究拟观察复方野菊花眼贴对蓝光引起的脸板腺功能异常的防治作用，探讨复方野菊花眼贴改善脸板腺功能异常的效果及可能的机制，为未来开发预防和治疗MCD相关药物提供理论支持。1材料与方法1.1材料1.1.1实验动物及分组15周龄成年雄性SPF级C57BL/6J小鼠6 4只，购自上海SLAC实验动物中心许可证号：SYXK（闽）：2 0 18-0 0 0 9 。本研究严格遵循视觉与眼科研究协会（ARVO）关于动物用于眼科和视觉研究的声明，并经厦门大学动物伦理委员会批准（批文号：XMULAC20220258）。小鼠可自由饮食和饮水，在（2 51)、相对湿度（6 0 10)%和交替12 h明暗循环(8:0 0 2 0:0 0)的标准无病原体环境中饲养。预防实验和治疗实验中各32 只小鼠分别按随机数字表法随机分为正常组、蓝光组、溶剂组和眼贴组，每组8 只。1.1.22主要试剂及仪器兔抗小鼠核因子（nuclearfactor,NF）-k B抗体（47 6 4S）、兔抗小鼠磷酸化NF-kB（p h o s p h o r y l a t i o n o f NF-k B,p-NF-k B）抗体（30 39 S）（美国CellSignalingTechnology公司）；山羊抗兔二抗（a b 6 7 2 1）、兔抗小鼠-actin抗体（ab227387）（美国Abcam公司）；苏木精-伊红染色试剂盒（C0105S-2）（上海碧云天生物技术有限公司）；改良油红O染色液（BL9 8 7 A）（安徽Biosharp公司）。SLM-7E型裂隙灯显微镜（山东康华科技有限公司）；CX23光学显微镜（日本Olympus公司）；M165FC正置荧光显微镜、CM1850冰冻切片机、EG1160石蜡切片机（德国Leica公司）；ZK-10-VISU-150手术显微镜（德国蔡司公司）。1.2方法1.2.1眼贴的制备通过全封闭动态回流多功能提取罐控温萃取甄选的多味中药材，确保提取的无污染、高浓度和充分性；过滤、静置沉淀后将上清液经6 0 70真空浓缩、16 30 0 r/min离心30 min并用超速离心管分离上清，形成提取浓缩液；将提取浓缩液置于冷库中静置沉淀，制剂后进行灌装，最终制成眼贴。1.2.2实验动物的分组处理1.2.2.1脸板腺功能异常动物模型将小鼠按照随机数字表法分成正常组32 只和蓝光组32 只。正常组和蓝光组各32 只小鼠再分别按照随机数字表法随机分为0 d组、7 d组、15d组和30 d组,每组8 只。正常组和蓝光组均置于标准无病原体环境中饲养，蓝光组组小鼠采用波长46 0 nm、光照度2 0 0 0 1x的蓝光，每天暴露6 h，分别在蓝光暴露0、7、15和30 d时进行脸板腺开口拍照、离体脸板腺拍照，观察小鼠脸板腺组织学变化。1.2.2.2子预防实验部分正常组小鼠置于标准环境下饲养，其余各组在标准环境的基础上进行蓝光暴露（波长为46 0 nm，光照度为2 0 0 0 lx），每天6 h（8:0 0 14:00），连续暴露15d建立小鼠脸板腺功能异常模型；溶剂组和眼贴组在蓝光暴露的15d中每天进行2次相对应的眼贴敷贴预防治疗（7:0 0、15:0 0），每次25min。在第15天对各组小鼠行脸板腺开口拍照，观察小鼠脸板腺功能情况，并采用颈椎脱白法处死小鼠，取小鼠脸板腺进行脸板腺拍照、油红O染色、苏木精-伊红染色、实时荧光定量PCR和Westernblot实验1.2.2.3治疗实验部分正常组小鼠置于标准环境下饲养，其余各组在标准环境的基础上进行蓝光暴露（波长为46 0 nm，光照度为2 0 0 0 lx），每天6 h（8:0 0 14：0 0），持续15d。蓝光组在蓝光暴露结束后不作任何处理，溶剂组和眼贴组在蓝光暴露结束后，每天进行2次相对应的双眼眼贴敷贴治疗（7:0 0、15：0 0），每次25min，持续15d。在第15天对各组行脸板腺开口拍照，观察小鼠眼表及脸板腺功能，并采用颈椎脱白法处死小鼠，取小鼠脸板腺进行脸板腺拍照、油红O染色、苏木精-伊红染色、实时荧光定量PCR和Westernblot实验。1.2.3小鼠脸板腺形态检查1.2.3.1脸板腺开口拍照操作者用右手将小鼠固定好，左手调整裂隙灯显微镜，保持灯光与小鼠垂直，尽可能保证小鼠脸缘不反光；另一操作者将裂隙灯显微镜焦距调好同时确定拍摄倍数，至屏幕显示出清晰图像即可1.2.3.2离体脸板腺拍照采用颈椎脱白法处死各:120ChinJExpnalmoaorilar2024,Vol.42.No.2中华实验眼科杂志2 0 2 4年2 月第42 卷第2 期组小鼠，迅速取下小鼠上下眼脸，去除多余组织后充分暴露小鼠脸板腺，置于正置显微下观察并拍照。采用ImageJ软件（美国NationalInstituteof Health公司）计算脸板腺剩余面积。脸板腺相对剩余面积=脸板腺剩余面积/脸板腺面积1.2.4小鼠脸板腺组织病理学检查1.2.4.1苏木精-伊红染色观察小鼠脸板腺结构和炎性细胞浸润情况各组任意选取3块脸板腺组织，用2 块载玻片将组织轻轻压平并摊开，用4%多聚甲醛固定组织30 min，待脸板腺初步固定后，将脸板腺轻轻转移至装有1ml4%多聚甲醛的EP管中固定2 4h，用双蒸水冲洗掉多余多聚甲醛，常温下梯度乙醇脱水（7 0%、8 0%、9 5%、10 0%、10 0%、10 0%乙醇各2 min），后用二甲苯进一步脱水（二甲苯I、I、各2 min）以及二甲苯透明后浸蜡包埋。采用LeicaEC1160石蜡切片机切片，切片方向为垂直于脸板腺腺体方向，切片厚度为5m，每个组织制备5个脸板腺组织切片，苏木精-伊红染色，光学显微镜下选取脸板腺中央5个腺体组织，观察脸板腺腺体结构改变以及腺体间细胞增生情况并拍照。采用ImageJ软件进行组织间炎性细胞计数。1.2.4.2油红0 染色观察各组小鼠脸板腺脂质沉积情况各组任意选取3块脸板腺组织，用专用吸水纸吸干多余水分，同时用2 把显微镊轻轻夹住组织边缘并将脸板腺尽可能展开，另一人再次用吸水纸吸干多余水分，再平整地将其置于装有OCT溶液的包埋盒中，待脸板腺组织中气泡完全排出后，用镊子夹取包埋盒缓慢放人液氮中固定。使用冰冻切片机于平行脸板腺腺体方向行5m厚切片，每块组织制备5个脸板腺组织切片。进行油红O染色，光学显微镜下选取脸板腺中央5块腺体组织观察脸板腺腺体中脂质堆积情况并拍照。采用ImageJ软件统计脸板腺组织中脂质沉积情况1.2.5实时荧光定量PCR法检测各组脸板腺组织中白细胞介素1、白细胞介素6、肿瘤坏死因子、干扰素mRNA表达实验结束后将小鼠全部安乐死，采用随机数字表法随机选取6 只小鼠，将小鼠脸板腺取出后置于含1mlTrizol的EP管中，采用Trizol法提取组织RNA，按照说明书逆转录成cDNA。引物由上海生工生物工程有限公司合成，其引物名称及序列分别为-actin正向引物：5-AGATCAACATCATTGCTCCTCCT-3，反向引物：5-ACGCAGCTCAGTAACAGTCC-3;白细胞介素1（i n t e r l e u k i n-1,IL-1）正向引物：5-GCACTACACCCTCCGAGATGAA-3，反向引物：5GTCGTTGCTTGGTTCTCCTTGT-3;IL-6正向引物：5CTTGGGACTGATGCTGGTGACA-3，反向引物：5GCCTCCGACTTGTGAAGTGGTA-3；肿瘤坏死因子（t u m o r n e c r o s i s f a c t o r-,TNF-）正向引物：5*-ACAGCAAGGGACTAGCCAGGAG-3,反向引物：5-AGTGCCTCTTCTGCCAGTTCCA-3;干扰素（interferon-,INF-）正向引物：5-CTTCAGCAACAGCAAGGCGAAA-3,反向引物：5-CCGAATCAGCACCGACTCCT-3。进行实时荧光定量PCR反应，PCR反应条件：9 5预变性10min;95变性10 s,60退火和延伸30 s，进行40个循环。以-actin为内参，采用2-AAC法计算各目的基因相对表达量。1.2.6Westernblot法检测脸板腺组织中NF-kB和p-NF-kB蛋白表达采用随机数字表法随机选取3只小鼠左眼脸板腺，置于含有0.1mlRIPA的EP管中，研磨组织收集蛋白，进行SDS-PACE电泳并转膜至醋酸纤维素膜中2%BSA封闭1h；分别加人NF-kB一抗（1:10 0 0）、p-NF-kB一抗（1:10 0 0)4孵育过夜，1倍TBST漂洗3次，每次5 10 min，加人羊抗兔IgG二抗（1：50 0）孵育1h，1倍TBST漂洗3次，每次510 min,使用Western BrightTM ECL 和 Western BrightMPeroxide按照1：1配制显影液，使用BIO-RAD显影仪显影。以-actin为内参，采用ImageJ软件分别计算内参和目蛋白条带灰度值。目的蛋白相对表达量=目的蛋白条带灰度值/内参条带灰度值1.3统计学方法采用GraphPadPrism8软件进行统计分析。计量资料数据经Shapiro-Wilk检验证实呈正态分布，以xs表示。正常组与蓝光组间不同时间点脸板腺形态指标总体差异比较采用区组设计两因素方差分析，多个组间评估指标的总体差异比较采用单因素方差分析，多重比较采用LSD-t检验。P0.05为差异有统计学意义，2结果2.1正常组与蓝光组小鼠眼脸板腺形态变化2.1.1正常组与蓝光组小鼠脸板腺开口阻塞数量比较裂隙灯显微镜拍照显示，蓝光暴露前（Od），正常组和蓝光组小鼠脸缘规整、光滑、无阻塞现象；7 d时，正常组和蓝光组小鼠脸缘规整、光滑，少见脸板腺开口阻塞；15d时，蓝光组小鼠出现脸板腺开口阻塞和脸缘光滑程度下降，正常组脸缘无明显变化；30 d时，蓝光组小鼠脸板腺开口明显阻塞，脸缘光滑程度明显下降，正常组脸缘无明显改变（图1A）。正常组和蓝光组不同时间点小鼠脸板腺开口阻塞数量总体比较差异121:ChinJamebruary2024.Vol.42.No.2中华实验眼科杂志2 0 2 4年2 月第42 卷第2 期均有统计学意义（F下分组=75.92,P0.001;FF时间=40.32,P0.001），其中蓝光暴露后15、30 d蓝光组脸板腺开口阻塞数量明显多于正常组，差异均有统计学意义（均P0.05）（表1）。由于本实验重点关注早期脸板腺功能异常，与暴露15d相比，蓝光暴露30 d脸板腺功能损伤过重，故选用蓝光暴露15d所诱导的脸板腺功能异常进行后续研究2.1.2正常组与蓝光组小鼠脸板腺下脸剩余面积比较离体脸板腺拍照显示，蓝光暴露前（Od），正常组和蓝光组小鼠脸板腺完整，排列整齐；7 d时，蓝光组和正常组小鼠脸板腺基本完整，未见明显缺失；15d时，蓝光组小鼠脸板腺形态出现异常并伴下脸腺体部分缺失，正常组脸板腺结构完整；30 d时，蓝光组小鼠脸板腺损伤明显，下脸腺体基本缺失，正常组脸板腺腺体形态完整（图1B）。正常组和蓝光组不同时间点小鼠脸板腺下脸相对剩余面积总体比较差异均有统计学意义（F分组=2 58.30,P0.001;F时间=57.47,P0.001），其中蓝光暴露后15、30 d蓝光组小鼠脸板腺下脸相对剩余面积明显小于正常组，差异均有统计学意义（均P0.05）（表2）。Od7d15d30d联工个个个个个A0d7d15d30d联工1个个B图1正常组与蓝光组不同时间点小鼠脸缘及脸板腺形态变化比较A：裂隙灯显微镜下拍照Od时，正常组和蓝光组脸板腺开口通畅，脸缘光滑；7 d时，蓝光组较正常组脸缘光滑程度降低，但未见明显脸板腺开口阻塞；15d时，蓝光组较正常组脸板腺开口出现阻塞，脸缘光滑程度降低（箭头）；30 d时，蓝光组较正常组脸板腺开口阻塞程度进一步加重，脸缘不规整（箭头）B：离体脸板腺拍照0 d时，正常组和蓝光组小鼠脸板腺完整，排列整齐；7 d时，蓝光组较正常组脸板腺基本完整，未见明显缺失；15d时，蓝光组较正常组脸板腺形态出现异常，下脸腺体部分缺失（箭头）；30 d时，蓝光组较正常组脸板腺损伤明显，下脸腺体基本缺失（箭头）Figure 1 Comparison of morphological changes in mice eyelid margins and meibomian glands at different time points between normal group andblue light group ASlit lamp microscopy images On day O,the mice meibomian gland opening was normal and the eyelid margin was smooth in the twogroups.On the7th day,theeyelid marginwas lessmooth intheblue lightgroup compared to normal groupbut nosignificant obstruction of the opening wasseen.On the 15th day,the openings were blocked in the bluelight group compared to the normal group,with a decrease in the smoothness of the eyelid margin(arrows).On the 3Oth day,obstruction of the opening was severer in the blue light group compared to the normal group,and the eyelid margins were irregular(arrows)B:Photographs of meibomian gland in vitro On day O,the mice meibomian gland was intact and neatly aranged in the two groups.On the 7thday,the mice meibomian gland in the blue light group was generally intact without significant loss compared to normal group.On the 15th day,the micemeibomian gland in the blue light group was abnormal,showing partial absence of the lower meibomian gland(arrows)compared with normal group.On the3Oth day,the mice meibomian gland damage was more obvious with whole absence of lower meibomian glands(arows)in the blue light group than in thenormal group.122ChinJExpOphthalmolebruary2024.Vol.42.No.2中华实验眼科杂志2 0 2 4年2 月第42 卷第2 期表1名各组小鼠蓝光暴露后不同时间点脸板腺开口阻塞数量比较（xs，个）Table 1 Comparison of the number of obstructed mice meibomian gland openingsat different time points after blue light exposure between two groups(x+s,pcs)不同时间点脸板腺开口阻塞数量组别样本量od7d15d30d正常组80.0000.0000.2500.4330.6250.4841.0000.707蓝光组80.1250.3310.8750.7813.6250.8576.1251.452注：F分组=7 5.9 2,P0.001；F时间=40.32，P0.001.与各自时间点正常组比较，P0.05（两因素方差分析，LSD-t检验）Note:Fgoup=75.92,P0.001;Frm=40.32,P0.001.Compared with respetive normalgroup,P0.05(Two-way ANOVA,LSD-t test)表2各组小鼠蓝光暴露后不同时间点脸板腺下脸相对剩余面积比较（xs）Table 2 Comparison of the relative remaining area of lower mice meibomianat different time