非洲猪瘟病毒B318L蛋白的多克隆抗体的制备及应用.pdf

中国预防兽医学报Chinese Journal of Preventive Veterinary Medicine第45卷 第9期2023年9月Vol.45，No.9Sep.2023doi院10.3969/j.issn.1008-0589.202209021非洲猪瘟病毒B318L蛋白的多克隆抗体的制备及应用刘晓红1，刘宏扬1，叶光强1，焦爽1，宿志民3，黄丽1,2*，翁长江1,2(1.中国农业科学院哈尔滨兽医研究所 兽医生物国家重点实验室，黑龙江 哈尔滨 150069；2.黑龙江省兽医免疫学重点实验室，黑龙江 哈尔滨 150069；3.山东畜牧兽医职业学院，山东 潍坊 261061)摘要：非洲猪瘟病毒(ASFV)B318L是ASFV编码的晚期蛋白，具有香叶基香叶基合成酶活性。为了制备B318L的多克隆抗体并将其初步应用，本研究利用PCR方法从重组质粒pCAGGS-HA-B318L中扩增ASFV B318L基因构建重组表达质粒pGEX-6p-1-B318L，经PCR和测序鉴定正确后转化大肠杆菌BL21(DE3)经IPTG诱导并克隆至pGEX-6p-1载体中，采用GST亲和层析柱纯化重组蛋白，利用SDS-PAGE检测该蛋白的表达，采用western blot鉴定重组蛋白的纯化效果和反应原性，采用超微量紫外分光光度计测定蛋白浓度。结果显示，在约60 ku处出现特异性条带，且重组B318L蛋白(rB318L)主要以可溶性形式表达；纯化后在约60 ku处出现了单一特异性条带，经超微量紫外分光光度计测定蛋白浓度为10 mg/mL。将纯化的rB318L 4次免疫小鼠并于3免后一周采血，采用westernblot鉴定该多克隆抗体(pAb)，经Protein G亲和层析介质纯化后采用SDS-PAGE进一步鉴定纯化效果，采用间接ELISA检测pAb的效价。结果显示，制备的小鼠血清(pAb)在60 ku处出现特异性条带，其与原核表达的rB318L发生了反应；该pAb包含重、轻链且纯度较好，且其效价可达1颐32 000。将不同剂量的pCAGGS-HA-B318L(1滋g、2滋g、4滋g)分别转染HEK293T细胞，24 h后收集细胞，将MOI 1的ASFV HLJ/18株感染猪肺泡巨噬细胞(PAM)，并分别于感染后6 h、12 h、24 h收集细胞。上述细胞均经相应处理后分别采用western blot、间接免疫荧光试验(IFA)(pCAGGS-HA-B318L转染剂量为1滋g)检测制备的pAb的反应原性。Western blot结果显示，HEK293T细胞中出现约35 ku的特异性条带，并随转染质粒浓度的增加B318L蛋白表达量增多；ASFV感染24 h后的PAM在35 ku处出现特异性条带，其余时间点均无该条带。IFA结果显示，过表达B318L蛋白的HEK293T细胞中出现红色荧光；ASFV感染12 h后的PAM中出现红色荧光，24 h后PAM中红色荧光的量增加。将制备的B318L pAb用于免疫共沉淀(Co-IP)试验检测293T细胞中过表达的B318L、ASFV感染PAM后内源表达的B318L，以及两种细胞中表达的B38L蛋白与pAb、Protein A/G Magnetic beads三者结合物的反应性。结果显示，B318L pAb可以检测到上述细胞中内源过表达和外源表达的B318L蛋白以及结合在beads上的B318L蛋白，均出现约35 ku的特异性条带。上述结果表明，B318L蛋白是ASFV晚期表达的蛋白，且制备并纯化的B318L pAb反应原性较强，既可以与HEK293T细胞中过表达的B318L蛋白也可以与ASFV感染的PAM中内源表达的B318L蛋白反应，反应原性较强，且可以用于Co-IP试验检测细胞中表达的B318L蛋白，本研究为深入研究ASFV B318L的生物学功能奠定了基础。关键词：非洲猪瘟病毒；B318L蛋白；多克隆抗体中图分类号：S852.65文献标识码：A文章编号：1008-0589(2023)09-0922-08Prokaryotic expression of African swine fever virus B318L proteinand preparation of polyclonal antibody收稿日期：2022-09-23基金项目：黑龙江省自然科学基金(YQ2020C022)作者简介：刘晓红(1996-)，女，河北张家口人，硕士研究生，主要从事非洲猪瘟病毒调控天然免疫分子机制研究.*通信作者：E-mail：*Corresponding authorLIU Xiao-hong1,LIU Hong-yang1,YE Guang-qiang1,JIAO Shuang1,SU Zhi-min3,HUANG Li1,2*,WENG Chang-jiang1,2(1.Harbin Veterinary Research Institute,Chinese Academy of Agricultural Sciences,State Key Laboratory of Veterinary Biotechnology,Harbin 150069,China;2.Heilongjiang Provincial Key Laboratory of Veterinary Immunology,Harbin 150069,China;3.Shandong Vocational Animal Science and Veterinary College,Weifang 261061,China)Abstract:B318L,encoded by African swine fever virus(ASFV),is a late protein with Geranylgeranyl pyrophosphate synthaseactivity.In order to prepare a polyclonal antibody against B318L,this study amplified the ASFV B318L gene from the recombinantplasmid pCAGGS-HA-B318L by PCR and cloned into pGEX-6p-1 constructed a recombinant plasmid pGEX-6p-1-B318L.AfterPCR and sequencing identification,the recombinant plasmid was transformed intoBL21(DE3)and induced by IPTG.Therecombinant protein was purified by GST affinity chromatography column,and the expression of the protein was detected bySDS-PAGE.The purification efficiency and reactivity of the recombinant protein were identified by western blot,And the proteinconcentration was measured by an ultraviolet spectrophotometer.The results showed that the specific bands appearing atapproximately 60ku and the recombinant B318L protein(rB318L)mainly expressed in soluble form.After purification,a singlespecific band appeared at approximately 60ku,and the protein concentration was determined to be 10mg/mL by ultravioletspectrophotometry.Mice were immunized with purified rB318L four times and the blood was collected one week after the thirdimmunizations.The polyclonal antibody(pAb)was identified by western blot,and purified by Protein G affinity chromatographymedium.The titer of pAb was detected by indirect ELISA.The purified antibody was identified by SDS-PAGE.The resultsshowed that murine serum appeared specific bands at 60ku,and It reacted with ther B318L expressed by prokaryotic.The pAbcontains both heavy and light chains with good purity,and the titer of pAb could reach 1颐32000.Different doses of pCAGGS-HA-B318L(1滋g,2滋g,4滋g)were transfected into HEK293T cells,respectively,and the cells were collected at 24 hours later.Porcinealveolar macrophages(PAM)were infected with ASFV HLJ/18 strain(MOI 1)and the cells were collected at 6,12 and 24 hoursafter infection.Western blot and indirect immunofluorescence assay(IFA)(transfected with 1滋g pCAGGS-HA-B318L)were usedto detect the reactivity of prepared pAb.Western blot results showed that a specific band of about 35ku appeared in HEK293Tcells,and the expression of B318L protein increased with the increase of transfection plasmid concentration.PAM infected withASFV for 24 hours showed a specific band at 35ku,and no such band were observed at other time points.IFA results showed thatred fluorescence appeared in HEK293T cells overexpressing B318L protein,PAM showed red fluorescence at 12 hours afterinfection with ASFV,and the amount of red fluorescence in PAM increased at 24 hours after infection.The prepared anti-B318Lpolyclonal antibody was used in immunoprecipitation(Co-IP)assay to detect the overexpression of B318L in 293T cells,theendogenous expression of B318L in PAM infection by ASFV,and the reactivity of the combination of the three of B318L proteinexpressed in the two cells and pAb and Protein A/G Magnetic beads with B318L pAb.Co-IP results showed that the anti-B318LpAb could detect B318L protein in the cells described above as well as B318L bound with beads,with a specific band of about35ku.The results above indicated that B318L protein is a late expressed protein of ASFV,and the prepared and purified B318LpAb has strong reactivity.It could react with both overexpressed B318L in HEK293T cells and endogenous B318L proteinexpressed in PAM infected with ASFV,with strong reactivity.Moreover,it could be used for Co-IP assay to detect exogenousexpression and endogenous B318L protein,laying a foundation for in-depth research of the biological function of ASFV B318L.Key words:African swine fever virus(ASFV);B318L protein;polyclonal antibody非洲猪瘟(African swine fever，ASF)是由ASF病毒(ASFV)感染家猪和野猪引起的一种急性、烈性、高度接触性传染病，是世界动物卫生组织(WOAH)法定通报动物疫病1，该病也是我国重点防范的一类动物疫病。ASFV感染家猪和野猪会导致急性型病理变化，在感染后4 d15 d病死率接近100%，临床表现为发热、心跳加快、呼吸困难、眼、鼻有浆液性或黏液性分泌物、皮肤发绀、心脏、肺脏、胆管、肾脏和胃肠黏膜等多器官出血，脾脏充血肿大2。ASF疫情于1921年首次于肯尼亚报道3，然后在非洲刘晓红，等.非洲猪瘟病毒B318L蛋白的多克隆抗体的制备及应用第9期923广泛传播并大规模暴发。于1957年传入葡萄牙，随后开始在欧洲国家和南美洲出现。目前，ASF是威胁亚洲国家的严重动物疫情，已对全球养猪业形成威胁，并造成严重的经济和生态后果2。ASFV是非洲猪瘟病毒科非洲猪瘟病毒属的唯一成员，ASFV的主要靶细胞是巨噬细胞和单核细胞，不同ASFV株基因组大小不同，在170 kb193 kb，编码约150200种蛋白质，这些蛋白或参与病毒复制4，或协助病毒逃逸宿主的免疫反应，如拮抗型干扰素的产生5-6、诱导细胞凋亡7、参与细胞自噬8、抑制宿主炎症反应6、调节宿主蛋白质合成9等。ASFV B318L蛋白由ASFV晚期基因B318L编码，由318个氨基酸组成，分子量为36 ku。有研究表明，ASFV B318L与香叶基香叶基焦磷酸合成酶的同源性较高10，包含这类酶特有的4个高度保守的氨基酸区域，具有香叶基香叶基焦磷酸合成酶活性10。迄今为止，ASFV B318L蛋白是唯一被鉴定的病毒香叶基香叶基焦磷酸合成酶11。B318L蛋白在感染后期病毒形态形成的过程中表达，能够包装于ASFV病毒粒子中12。为了研究B318L在ASFV复制中的功能，本研究利用小鼠制备B318L多克隆抗体(pAb)，并采用western blot和间接免疫荧光试验(IFA)鉴定该pAb的反应原性，将该pAb用于Co-IP试验检测细胞中过表达的B318L蛋白及ASFV感染的PAM中内源表达的B318L蛋白，为深入研究B318L的分子机制奠定实验基础。1材料与方法1.1病毒、细胞、载体及实验动物ASFV HLJ/18株由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所分离并保存；HEK293T细胞由本实验室保存；猪肺泡巨噬细胞(PAM)分离自30日龄的SPF猪；大肠杆菌()DH5、BL21(DE3)感受态细胞均购自宝生物工程(大连)有限公司；表达载体pGEX-6p-1、pCAGGS-HA、pCAGGS-HA-B318L及小鼠阴性血清均由本实验室保存；BALB/c小鼠购自辽宁长生生物技术有限公司。1.2主要试剂Prime STAR Max DNA Polymerase购自宝生物工程(大连)有限公司；质粒提取试剂盒、胶回收试剂盒均购自QIAGEN公司；限制性内切酶R I、I购自NEB公司；同源重组试剂盒购自Vazyme公司；DMEM培养基、胎牛血清购自Gibco公 司；兔 源HA单 克 隆 抗 体(MAb)、鼠 源GAPDHMAb购 自Sigma公 司；鼠 源IgG购 自Abcam公 司；Alexa Flour 488绿色荧光标记的山羊抗兔IgG(H+L)、Alexa Flour 594红色荧光标记的山羊抗鼠IgG(H+L)购自Invitrogen公司；HRP标记的山羊抗小鼠IgG(H+L)购自北京博奥龙免疫技术有限公司；弗氏完全佐剂和弗氏不完全剂、4,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)、Protein A/G Magnetic beads均购自Sigma公司；兔源GST MAb和鼠源ASFV p54 pAb均由本实验室制备；IRDye 800 CW标记的山羊抗鼠IgG以及山羊抗兔IgG购自LI-COR公司。1.3重组质粒 pGEX-6p-1-B318L的 构 建 与 鉴 定根据B318L基因序列(NP_042768.1)和pGEX-6p-1载体序 列 采 用Snapgene软 件 设 计 引 物F：CCCCTGGGATCCCCGGAATTCATGCGCAAACCTAAGTATTTTAGAA/R：GTCACGATGCGGCCGCTCGAGGGTCCCCAATGCAACATTTATA，引物由库美生物科技有限公司(吉林)合成，以重组质粒pCAGGS-HA-B318L为模板，采用上述引物经PCR扩增B318L基因，并利用同源重组酶将扩增的B318L基因与经R I/I双酶切的pGEX-6p-1载体连接，构建重组质粒，经菌液PCR及测序鉴定正确的重组质粒命名为pGEX-6p-1-B318L。1.4重组B318L蛋白(rB318L)的原核表达、纯化及鉴定将重组质粒pGEX-6p-1-B318L转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，37培养至OD600nm值为0.60.8，取出3 mL作为未诱导组，剩余菌液加入终浓度为0.5 mmol/L的IPTG作为诱导组，诱导组和未诱导组均16220 r/min培养20 h后离心，PBS重悬，于冰浴中超声破碎，离心，收集上清和沉淀，经SDS-PAGE电泳检测。大量培养后经IPTG诱导20 h，8 000 r/min离心15 min，超声破碎后收集的上清液经GST亲和层析柱纯化，将纯化后的蛋白经SDS-PAGE检测，以兔源GST MAb(1颐500)为一抗，以IRDye800 CW标记的山羊抗兔IgG(1颐10 000)为二抗，经western blot检测rB318L的纯化效果及反应原性。采用紫外分光光度计测定该蛋白浓度后置于-80保存。1.5鼠B318L蛋白pAb的制备、纯化及检测将纯化的rB318L与弗氏完全佐剂等体积混合并乳化，以200滋g/只，经皮下多点注射免疫5只小鼠。间隔2周，采用弗氏不完全佐剂与纯化的rB318L等体积混合并乳化，以与首免同样的剂量和方法分别二免、中 国 预 防 兽 医 学 报2023年924M:DL2000 DNA Marker;1:ddH2O;2:B318L gene fragment图1pGEX-6p-1-B318L的PCR鉴定结果M122000bp1000bp750bp500bp250bp100bp三免和四免。三免后一周经鼠尾采血，分离血清。将 重 组 质 粒pGEX-6p-1-B318L转 化 大 肠 杆 菌BL21(DE3)感受态细胞，经0.5 mmol/L的IPTG诱导后以及未诱导的该重组菌超声破碎后离心取上清并均经SDS-PAGE电泳后，以小鼠三免后一周的血清(1颐500)为一抗，以小鼠阴性血清为阴性 对 照，以IRDye800 CW标记的山羊抗鼠IgG(1颐10 000)为二抗，经western blot检测该pAb。四免后一周，经小鼠眼球采血，分离血清，采用Protein G亲和层析纯化后经SDS-PAGE检测该pAb的纯化效果。1.6pAb效价的间接ELISA测定利用碳酸盐缓冲液(0.05 mol/L，pH值9.6)将纯化的rB318L稀释至2.5滋g/mL，采用PBST将制备的pAb 2倍倍比稀释(1颐1 0001颐512 000)分别做为一抗，以HRP标记的山羊抗鼠IgG(1颐5 000)为二抗，利用间接ELISA方法检测制备的pAb的效价13。1.7pAb反应原性的western blot鉴定将不同剂量的真核表达质粒pCAGGS-HA-B318L(1滋g、2滋g、4滋g)分别转染HEK293T细胞24 h后收集细胞；将MOI 1的ASFV HLJ/18株感染PAM，并分别于感染后6 h、12 h、24 h收集细胞。将上述收获的细胞采用1%Triton X-100细胞裂解液裂解后，12 000 r/min离心取上清加4伊Loading Buffer煮样，经SDS-PAGE电泳，后将蛋白转移至PVDF膜上，5%脱脂乳封闭后，分别以制备的鼠ASFV B318L pAb(1颐500)、兔源HAMAb(1颐1 000)、鼠源p54 MAb(1颐500)及鼠源GAPDHMAb(1颐1 000)为一抗，以IRDye 800 CW标记的羊抗鼠IgG以及羊抗兔IgG(1颐10 000)作为二抗，采用western blot分别检测B318L pAb与过表达的B318L及与PAM内源表达的B318L的反应原性。1.8pAb反应原性的间接免疫荧光试验(IFA)分别将HEK293T细胞和PAM铺于经多聚赖氨酸包被的共聚 焦 小 皿 中，将1滋g pCAGGS-HA-B318L转 染HEK293T细胞，24 h后用4%多聚甲醛固定；另外用MOI 1的ASFV HLJ/18株感染PAM，并于感染后6 h、12 h、24 h固定细胞，以转染pCAGGS-HA的HEK293T细胞和未感染ASFV的PAM作为阴性对照。上述细胞均固定30 min后，采用0.3%Triton X-100透膜15 min，10%FBS封闭1 h，分别以制备的鼠源ASFVB318L pAb(1颐100)、兔源HA MAb(1颐500)为一抗，以Alexa Flour 594红 色 荧 光 标 记 的 山 羊 抗 鼠IgG(H+L)(1颐1 000)以及Alexa Flour 488绿色荧光标记的山羊抗兔IgG(H+L)(1颐1 000)为二抗。DAPI染细胞核15 min后通过激光共聚焦显微镜观察。1.9pAb用于Co-IP试验检测细胞中外源及内源表达 的 B318L将pCAGGS-HA-B318L和pCAGGS-HA分别转染HEK293T细胞，24 h后收集细胞；将ASFV以MOI 1感染PAM，以加入鼠源IgG的PAM作为阴性对照，24 h后收集细胞。上述细胞均用100滋L含1%Triton X-100裂解液裂解细胞，12 000 r/min 4离心20 min后取30滋L上清加入4伊Loading Buffer煮样，作为Input样品；将B318L pAb加入剩余的70滋L样品中，4旋转结合8 h后，加入Protein A/G Mag-netic beads，4旋转结合4 h，用0.5%Triton X-100裂解液洗涤beads 35次，加2伊Loading Buffer煮样后，作为IP样品。将上述样品经SDS-PAGE电泳后，以 制 备 的ASFV B318L pAb(1颐500)、鼠 源GAPDHMAb(1颐1 000)、鼠源p54 MAb(1颐500)为一抗，以IRDye 800 CW标记的山羊抗鼠IgG(1颐10 000)和IRDye800 CW标记的山羊抗兔IgG(1颐10 000)为二抗，经western blot检测结合在beads上的B318L蛋白与pAb的反应原性。2结果2.1重组质粒pGEX-6p-1-B318L的构建与鉴定结果以pCAGGS-HA-B318L质粒为模板，采用PCR扩增B318L基因，采用同源重组的方式构建重组质粒pGEX-6p-1-B318L，并采用PCR和测序鉴定。PCR结果显示，扩增出957 bp的目的片段(图1)，与预期一致。测序结果显示插入片段完全正确，表明正确构建重组质粒pGEX-6p-1-B318L。2.2rB318L的原核表达、纯化与鉴定结果将重组质粒pGEX-6p-1-B318L转化大肠杆菌BL21(DE3)感刘晓红，等.非洲猪瘟病毒B318L蛋白的多克隆抗体的制备及应用第9期925A：鼠pAb与原核表达的rB318L反应原性的western blot鉴定；B：鼠pAb纯化的SDS-PAGE检测M：蛋白质分子质量标准；12：未经IPTG及经IPTG诱导的pGEX-6p-1-B318L/BL21菌液；34：纯化的鼠pAbA:Identification of the reactogenicity of mouse pAb with B318Lprotein expressed with prokaryotic by western blot;B:Detection of purified mouse pAb by SDS-PAGEM:Protein Marker;1-2:Uninduced and induced ofpGEX-6p-1-B318L/BL21 bacterial solution by IPTG;3-4:Purified mouse pAb图3鼠源B318L蛋白pAb的western blot鉴定(A)及纯化的SDS-PAGE检测(B)结果受 态 细 胞，经IPTG诱 导 后 采 用SDS-PAGE检 测rB318L的 表 达 及 表 达 形 式。结 果 显 示，重 组 菌pGEX-6p-1-B318L/BL21(DE3)经IPTG诱导后出现约60 ku的 目 的 条 带，未 经IPTG诱 导 的pGEX-6p-1-B318L/BL21(DE3)无该条带，且该重组菌上清和包涵体中均出现约60 ku的目的条带(图2)。经GST亲和层析柱纯化后，采用western blot检测rB318L的纯化效果及与其的反应原性。结果显示，出现约60 ku的单一特异性条带(图2)，经紫外分光光度计测定rB318L的浓度为10 mg/mL。表明rB318L在大肠杆菌中获得了表达，且纯化效果较好，浓度较高。2.3鼠B318L蛋白pAb的制备、纯化与效价的检测结果将纯化的GST-B318L蛋白(rB318L)4次免疫BALB/c小鼠，三免后一周采血分离血清做为一抗，经western blot检 测 诱 导 后pGEX-6p-1-B318L/BL21(DE3)中表达的rB318L。结果显示，该小鼠血清可以与rB318L发生反应，在60 ku处出现特异性条带，而 未诱导的pGEX-6p-1-B318L/BL21(DE3)中无该条带(图3A)。小鼠血清经Protein G亲和层析纯化后，经SDS-PAGE检测显示，鼠源pAb出现了重链与轻链两条带且条带清晰特异(图3B)。经间接ELISA方法检测鼠B318L pAb的效价，结果显示pAb效价可达1颐32 000，以上结果表明，本研究获得了纯度及效价均较高的鼠B318L蛋白的pAb，且其免疫原性较强。2.4pAb反应原性的western blot 鉴定结果将不同剂量的pCAGGS-HA-B318L(1滋g、2滋g、4滋g)转染HEK293T细胞，24 h后收获细胞，利用B318L蛋白pAb经western blot检测。结果显示，在过表达B318L的HEK293T细胞中检测到35 ku的特异性条带，并随转染质粒浓度的增加B318L蛋白及HA表达量均增多(图4A)；同 时，以MOI 1的ASFV HLJ/18株 感 染PAM，6 h、12 h、24 h后收集细胞。Western blot检测结果显示，在ASFV HLJ/18株感染24 h的PAM中，在35 ku处出现特异性条带，但其余时间点均无该条带；ASFV p54蛋白则在感染后12 h获得表达(图4B)。以上结果表明本研究制备的鼠B318L蛋白pAb的反应原性较好，能够用于western blot检测内源和外源过表达的ASFV B318L蛋白。2.5pAb反应原性的的IFA结果将pCAGGS-HA-B318L转染HEK293T细胞，24 h采用IFA进一步检测pAb的反应原性。结果显示，以兔源HA MAb和鼠源B318L pAb作为一抗的细胞中均分别出现绿色和红色荧光(图5A)；同时，以MOI 1的ASFV感染PAM，6 h、12 h、24 h后以鼠源B318L pAb作为一抗经IFA检测，结果显示，ASFV感染PAM 12 h后出现红色荧光，感染24 h后PAM中的红色荧光量增加(图5B)。而转染pCAGGS-HA空载体的HEK293T细胞和未感染ASFV的PAM中均未出现任何荧光(图5A、图5B)。进一步表明，本研究制备的鼠B318L蛋白pAb的反应原性较好，可以用于IFA检测外源过表达及内源表180ku130ku110ku75ku65ku45ku35ku25ku55ku25ku180ku130ku110ku75ku65ku45ku35ku25ku15ku60kuM12M34ABM：蛋白质分子质量标准；1：未经IPTG诱导的pGEX-6p-1-B318L/BL21菌液；24：IPTG诱导并超声破碎后的pGEX-6p-1-B318L/BL21裂解液、上清和沉淀；5：rB318L纯化效果的western blot鉴定M:Protein Marker;1:Uninduced pGEX-6p-1-B318L/BL21 bacteriasolution;2-4:IPTG-induced lysate,supernatant and pellet afterultrasonication of pGEX-6p-1-B318L/BL21 recombinant bacteria;5:Identification of purified recombinant B318Lprotein by western blot图2rB318L的表达、纯化及鉴定结果180ku130ku110ku75ku65ku45ku35ku25ku15ku60kuM1234510ku中 国 预 防 兽 医 学 报2023年926刘晓红，等.非洲猪瘟病毒B318L蛋白的多克隆抗体的制备及应用第9期927达的B318L蛋白。也表明B318L是ASFV晚期表达的蛋白。2.6pAb用于Co-IP试验检测细胞中B318L蛋白表达的结果将pCAGGS-HA-B318L转染HEK293T细胞，同时将ASFV感染PAM，24 h后收集上述细胞样品裂解取上清并分为两份，一份上清样品煮沸后常温放置作为Input样品；另一份上清样品分别加入鼠B318L pAb(转染表达B318L蛋白的质粒)及鼠源IgG和B318L pAb(转染ASFV的PAM)，4旋转结合8 h后，再加入Protein A/G Magnetic beads，4旋转结合4 h后洗涤、煮沸作为IP样品。两份处理后的上清样品加入相应的一抗二抗后，经western blot检测。结果显示，在Input样品中，转染pCAGGS-HA-B318L的293T细胞以及感染ASFV的PAM与鼠B318L蛋白pAb反应后在35 ku处均出现了特异性条带，而转染空载体pCAGGS-HA的293T细胞中无该特异性条带；在IP样品中，转染表达B318L质粒的293T细胞以及感染ASFV的PAM中表达的B318L蛋白与pAb、Pro-tein A/G Magnetic beads三者的结合物均可以与纯化的B318L蛋白的pAb反应，在35 ku处出现特异性条带，而转染pCAGGS-HA的293T细胞中以及ASFV感染结合鼠源IgG的PAM中均无该特异性条带(图6)。B318L蛋白与pAb、Protein A/G Magnetic beads结合后，鼠B318L蛋白pAb可以与结合在beads上的B318L蛋白反应。表明制备的纯化的鼠pAb可以用于Co-IP试验检测B318L蛋白的表达。3讨论ASF是WOAH的法定通报动物疫病1。ASFV强毒株感染家猪和野猪可导致几乎100%的死亡率2。ASF自2018年传入中国并暴发，对全球养猪业和经济构成了严重威胁。由于ASFV基因组庞大，致病机制极其复杂，50%以上的ASFV蛋白功能未知，目前尚无安全有效的商品化疫苗用于ASF防控。B318L是ASFV编码的结构蛋白，其在ASFV复A：293T细胞中外源过表达的HA-B318L蛋白的western blot鉴定；B：ASFV感染PAM中内源表达B318L蛋白的western blot鉴定；A:Identification of exogenous HA-B318L protein over expressed in293T cells by western blot;B:Identification of exogenous endogenousB318L protein in ASFV/HLJ18-infected PAMs by western blot图4鼠源B318L蛋白pAb反应原性的western blot鉴定结果WB:B318LWB:HAWB:GAPDHWB:B318LWB:P54WB:GAPDH35ku35ku35ku35ku35ku25ku-124HA-B318L(滋g)AB-6h12h24hASFVA：HEK293T细胞中外源过表达HA-B318L蛋白的IFA检测；B：ASFV感染 PAM中内源表达B318L蛋白的IFA检测A:Detection of exogenous overexpression of HA-B318L protein inHEK293T cells by IFA;B:Detection of endogenous B318L proteinexpression in PAM infected with ASFV by IFA图5鼠B318L蛋白pAb反应原性的IFA鉴定结果Anti-HADAPIMergeAnti-B318LDAPIMergeAnti-B318LDAPIMergeBAA：HEK293T细胞中外源过表达HA-B318L蛋白的Co-IP试验；B：ASFV感染PAM中内源表达B318L蛋白的Co-IP试验A:Co-IP assay for exogenous overexpression of HA-B318L protein inHEK293T cells;B:Co-