化脓隐秘杆菌可视化LAMP检测方法的建立.pdf

第45卷第12 期2023年12 月doi:10.3969/j.issn.1008-0589.202303020中国预防兽医学报Chinese Journal of Preventive Veterinary Medicine化脓隐秘杆菌可视化LAMP检测方法的建立Vol.45,No.12Dec.2023李富祥，朱沛，赵文华，宋建领，高华峰*（云南省畜牧兽医科学院云南省热带亚热带动物病毒病重点实验室，云南昆明6 50 2 2 4)摘要：为建立化脓隐秘杆菌(A.pyogenes)可视化LAMP检测方法，本研究根据A.pyogenes16SrRNA基因的特异性保守核苷酸序列设计两对LAMP引物，通过反应体系和反应条件的优化，结果显示，本研究建立的LAMP方法的最佳反应条件为6 2 反应7 0 min。利用建立的LAMP方法检测金黄色葡萄球菌、伪结核棒状杆菌、A.pyogenes等山羊和绵羊常见的16 种细菌的DNA样品，结果显示仅A.pyogenesDNA样品检测为阳性，其它细菌DNA样品和阴性对照检测均为阴性，表明该方法具有较强的特异性。利用建立的LAMP方法检测不同稀释度的重组质粒标准品pMD19T-Arc，结果显示检测限为8.2 拷贝/L，表明该方法具有较高的敏感性。利用建立的LAMP方法和普通PCR方法对12 8 份山羊和绵羊皮下脓肿样品进行检测，结果显示两种方法对A.pyogenes的阳性检出率分别为18.8%(2 4/12 8)和17.2%(2 2/12 8)，总符合率为98.4%(12 6/12 8)。结果表明，本研究首次建立了检测A.pyogenes的基于钙黄绿素指示剂的可视化LAMP方法，为山羊和绵羊A.pyogenes感染的检测提供了一种可视化快速的技术手段。关键词：化脓隐秘杆菌；环介等温扩增；可视化现场检测中图分类号：S852.61文献标识码：A文章编号：10 0 8-0 58 9(2 0 2 3)12-12 58-0 6Development of a visual loop-mediated isothermal amplificationassay of Arcanobacterium pyogenesLI Fu-xiang,ZHU Pei,ZHAO Wen-hua,SONG Jian-ling,GAO Hua-feng(Yunnan Tropical and Subtropical Animal Virus Diseases Laboratory,Yunnan Animal Science and Veterinary Institute,Kunming 650224,China)Abstract:In order to establish a visual LAMP method for the detection of Arcanobacterium pyogenes(A.pyogenes),twopairs of LAMP primers,based on the specific conserved nucleotide sequence of the 16S rRNA gene of A.pyogenes,weredesigned,and the visual LAMP detection method was developed by optimizing the reaction system and reaction conditions,evaluating the specificity and sensitivity and testing the clinical sample of goats and sheep.The results showed that the optimalreaction condition of LAMP method was 62 f o r 7 0 m i n.D NA s a m p l e s o f 16 c o m m o n b a c t e r i a l s p e c i e s i n g o a t s a n d s h e e p,s u c has Staphylococcus aureus,Corynebacterium pseudotuberculosis and A.pyogenes,were detected by the established LAMP methodand the results showed that only A.pyogenes DNA sample was positive and the other bacterial species DNA samples and negativecontrol were negative,which indicated that this method has strong specificity.Positive plasmid standard pMD19T-Arc samples atdifferent dilutions were detected by the established LAMP method and the results showed that the minimum detected concentration*Corresponding author收稿日期：2 0 2 3-0 3-15基金项目：云南省重大科技专项计划资助项目(2 0 2 10 2 AE090039)；云南省农业厅畜禽种质创新及标准化养殖技术推广专项资助项目作者简介：李富祥(197 9-)，男，云南曲靖人，硕士，研究员，主要从事畜禽细菌病研究.*通信作者：E-mail：k mg h f h o t ma i l.c o m第12 期李富祥，等.化脓隐秘杆菌可视化LAMP检测方法的建立1259was 8.2 copies/L,which indicated that this method has strong sensitivity.One hundred and twenty-eight goat and sheepsubcutaneous abscess samples were detected by the established LAMP method and conventional PCR method simultaneously,andthe results showed that the positive rates were 18.8%(24/128)and 17.2%(22/128),respectively,and the total coincidence rate ofthe two methods was 98.4%(126/128).The results indicated that the established visual LAMP can be used for the fast visual fielddiagnosis of A.pyogenes infections in goats and sheep.Key words:Arcanobacterium pyogenes;loop-mediated isothermal amplification;visual field detection化脓隐秘杆菌(Arcanobacterium pyogenes，A.p y-ogenes)原称为化脓隐秘菌(Trueperella pyogenes)、化脓棒状杆菌(Corynebacterium pyogenes)和化脓放线菌(Actinomyces pyogenes)，是一种重要的人畜共患条件致病菌，常感染猪、牛、绵羊、山羊、鹿和鸡等多种家养和野生动物，引起子宫内膜炎、肺炎、乳房炎、关节炎、心内膜炎、骨髓炎、脓肿和败血症等疾病1-3；偶尔也能感染人，引起心内膜炎和软组织感染等多种疾病45。在这些疾病中，山羊和绵羊A.pyogenes的感染率较高并且主要引起皮下脓肿和乳房炎6 7 ，导致产奶量、躺体品质以及生长和繁殖性能的下降，严重危害世界养羊业的发展，因此建立A.pyogenes的快速检测方法对A.pyogenes感染的检测具有重要意义。环价导等温扩增技术(Loop-mediated isothermalamplification，LA M P)是日本Notomi等于2 0 0 0 年研发的新型等温核酸扩增技术8 ，由于其具有特异性强、敏感性高、快速(反应完成只需约1h)、不需昂贵设备(只需水浴锅等简单的恒温设备）、检测成本低、操作简便、反应结果判定简单(根据反应前后反应液颜色变化即可对检测结果做出准确判定)等诸多优点而成为畜禽疫病现场快速诊断技术研究的热点。LAMP指示剂主要有钙黄绿素、SYBRGreen和羟基萘酚蓝3种9，其中钙黄绿素具有以下优点：钙黄绿素是在LAMP反应前加入到反应体系中，极大避免了反应后加入而造成气溶胶污染的可能性；钙黄绿素作为指示剂其颜色变化更加明显，更有利于通过颜色变化对LAMP检测结果做出准确判断。目前，国内外A.pyogenes LAMP检测方法有基于溶血素plo基因的LAMP检测方法10 1 和基于伴侣蛋白基因cpn60的LAMP检测方法2 ，未见国内外基于16 SrRNA基因的LAMP检测方法的报道，也未见基于钙黄绿素指示剂的LAMP检测方法的报道。因此，本研究根据A.pyogenes16S rRNA基因的特异性保守核苷酸序列设计2 对LAMP引物，通过反应体系和反应条件的优化、特异性和敏感性评估以及临床样品的检测，在国内外首次建立了基于钙黄绿素指示剂的A.pyogenes特异性可视化LAMP检测方法，为山羊和绵羊A.pyogenes感染的快速诊断提供技术支撑。1材料与方法1.1菌株和临床样品A.pyogenes、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus)、伪结核棒状杆菌(Corynebacterium pseudotuberculosis)、大肠杆菌(Es-cherichia coli)、肠炎沙门氏菌(Salmonella enteritis)、奇异变形杆菌(Proteus mirabilis)、费氏志贺氏菌(Shigella flexneri)、多杀性巴氏杆菌(Pasteurella mul-tocida)、海藻百伯史坦菌(Bibersteinia trehalosi)、溶血性曼氏杆菌(Mannheimia haemolytica)、产气荚膜梭菌（Clostridium perfringens)、英诺克李斯特氏菌(Listeria innocua)、山羊莫拉菌(Moraxella caprae)、山羊支原体(Mycoplasmacapricolum)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)和鲁氏不动杆菌(Acinetobac-ter lwoffi)共16 种细菌，均由云南省畜牧兽医科学院分离鉴定和保存。12 8 份山羊和绵羊皮下脓肿的脓液样品采自云南省4个县的8 个山羊和绵羊养殖场。1.2主要试剂EasyPure Bacteria Genomic DNAKit、Ea s y Pu r e PCR Pu r i f i c a t i o n K i t、2 x Ea s y T a q PCRSuperMix 和 Trans2K DNA Marker 均购 自 TransGenBiotech公司；质粒小提试剂盒购自TIANGEN公司；Bst 2.0 WarmStart DNA polymerase 购自NEB公司;dNTPMixture和pMD19-T载体购自TaKaRa公司；氯化锰(MnCl)、硫酸镁(MgSO4)和甜菜碱(Betaine)均购自Solarbio公司；钙黄绿素(Calcein)购自合肥巴斯夫生物科技有限公司。1.3引物设计从NCBI数据库中下载A.pyogenes的16 S rRNA基因序列，利用DNAStar软件包中的Me-1260中国预防兽医学报2023年gAlign软件进行基因序列比对分析后，以A.pyo-genes日本分离株DAT1453(随机选择)的16 S rRNA基因序列(LC500013.1)5端8 0 0 bp的核苷酸序列为靶序列，利用在线软件PrimerExplorer 4(http:/primerex-plorer.jp/elamp4.0.0/index.html)设计1对LAMP外引物Arc-F3/B3（目的基因片段大小为2 0 3 bp)和1对LAMP内引物Arc-FIP/BIP。按照Silva等13 的报道合成A.pyogenes的普通PCR检测引物Arc-Fw/Rv(退火温度为62，目的基因片段大小为150 bp)。LA M P引物和普通PCR引物均由北京擎科生物科技有限公司公司合成(表1)。表1LAMP 和PCR引物序列Table 1The primers sequences of LAMP and PCR引物名称Primer nameArc-F3Arc-B3Arc-FIPArc-BIPArc-FwArc-Rv1.4细菌基因组DNA的提取利用EasyPure Bacte-ria Genomic DNAKit分别提取A.pyogenes、金黄色葡萄球菌、伪结核棒状杆菌等16 种细菌和12 8 份山羊和绵羊脓液样品的基因组DNA，-2 0 保存用于后续试验。1.5重组质粒标准品的构建与鉴定以A.pyogenes基因组DNA为模板，利用引物Acr-F3/B3经PCR扩增16SrRNA基因片段，PCR反应条件：945min；9430 s、59 30 s、7 2 45s，35个循环；7 2 5min。利用EasyPure PCR Purification Kit回收目的基因片段，将其与pMD19-T载体连接构建重组质粒pMD19T-Arc并测序鉴定。利用分光光度法测定质粒的质量浓度，再利用质粒拷贝数计算公式(拷贝/L=(6.021023)(ng/L10)/(DNA序列大小6 6 0)将质量浓度换算为拷贝数浓度，作为LAMP方法的标准品。1.6LAMP反应体系及反应条件的优化按照李富祥等的报道建立2 5LLAMP基础反应体系4：ddH,O8.5 L、Be t a in e (10 m o l/L)2 L、10 x I s o t h e r m a l a m-plification buffer 2.5 L、d NT P M ix t u r e (10 m m o l/L)1.5 L、Bs t 2.0 W a r m St a r t D NA p o l y m e r a s e (8 U/L)1 L、C a lc e in (2 0 0 mol/L)5 L、M n C l(25 mmol/L)0.8 L、M g SO 4(10 0 m m o l/L)1.5 L、A r c-F3/B3(20 mol/L)各0.3 L、A r c-FIP/BIP(2 0 mol/L)各0.3 L以及A.pyogenes DNA 1 L。在基础反应体系和基础反应条件(6 0 1 h)下，利用棋盘法对MnCl,浓度(25mmol/L的原液作2 2 稀释）、MgSO4浓度(100 mmol/L的原液作2 2 稀释)、内外引物比例1:1、2:1、3:1、4:1、5:1和6:1)进行优化，确定最佳反应体系。在最佳反应体系下分别优化退火温度(56、58、6 0、6 2、6 4、6 6 和6 8)和退火时间(40 min、50 mi n、6 0 mi n、7 0 mi n、8 0 mi n、90min和10 0 min)，确定最佳反应条件。以A.pyo-genes基因组DNA为模板，利用优化的反应体系和反应条件经LAMP扩增(以ddH,O作为阴性对照)，观察反应产物(反应液)颜色变化并进行琼脂糖凝胶电泳引物序列(5-3)检测，评价可视化结果。Primer sequences(5-3)1.7特异性试验利用建立的LAMP方法检测GCCGCGGTAATACGTAGGGCCATCGGTGTTCCTCCTCGGTCTTTCACAGCAGGCGCTTGTCCGGAATTATTGGGCGTTAACTTCGGGGTTGCAGTGGGTTCCACCGCTACACCAGGTCATCAACAATCCCACGAAGAGTTGCCTCCAGTTGACGCTTTA.pyogenes、金黄色葡萄球菌和伪结核棒状杆菌等16种细菌的DNA样品以及阴性对照(ddH,O)，评价该LAMP方法的特异性。1.8敏感性试验利用TE缓冲液将pMD19T-Arc10倍倍比稀释为10 个稀释度(10 l10 10)后作为模板，利用建立的LAMP方法检测，评价该LAMP方法的敏感性。1.9临床样品检测利用建立的LAMP和普通PCR13两种方法检测1.4中提取的12 8 份山羊和绵羊脓液样品的DNA，计算A.pyogenes阳性率并且比较两种检测方法的阳性符合率、阴性符合率以及总符合率。2结果2.1重组质粒标准品的构建与鉴定以A.pyogenes基因组DNA为模板，利用引物Arc-F3/B3经PCR扩增A.pyogenes16S rRNA基因，得到约2 0 0 bp的目的片段，与预期2 0 3 bp相符。将目的基因片段克隆于pMD19-T载体中构建重组质粒pMD19T-Arc，经测序鉴定正确。利用分光光度法测定其质量浓度为26.0ng/L，换算为拷贝数浓度为8.2 10 拷贝/L。2.2LAMP反应体系及反应条件的优化结果利用棋盘法依次优化MnCl,和MgSO.浓度以及内外引物比例，得到MnCl和MgSO的最佳浓度分别为12.5mmol/L和6.3mmol/L；内外引物最佳比例为3:1；因此，最佳反应体系为ddH,O 8.5 L、Be t a i n e（10 mo l/L)2 L、10 I s o t h e r m a l a m p l i f i c a t i o n b u f f e r 2.5 L、第12 期李富祥，等.化脓隐秘杆菌可视化LAMP检测方法的建立1261dNTP Mixture(10 mmol/L)1.5 L、Bs t 2.0 Wa r m-Start DNA polymerase（8 U/L）1 L、c a l c e i n(200 mol/L)5 L、M n C l(12.5 mmol/L)0.8 L、MgSO4(6.3 mmol/L)1.5 L、A r c-F3/B3(2 0 mol/L)各 0.3 L、A r c-FI P/BI P(2 0 mol/L)各0.3 L 以及DNA模板1L。最佳反应条件为6 2 反应7 0 min。以A.pyogenes基因组DNA为模板，利用优化的反应体系和反应条件经LAMP扩增，结果显示，A.pyo-genes DNA样品检测为阳性(反应液颜色由橘黄色变为黄绿色，并且反应产物经琼脂糖凝胶电泳出现LAMP特异性梯度条带)，A.pyogenes DNA阴性样品(ddH,O)检测为阴性(反应液颜色保持橘黄色不变,并且反应产物琼脂糖凝胶电泳无LAMP特异性梯度条带）（图1)，表明用于检测A.pyogenes的LAMP方法初步建立，且可视化检测结果较好。12MAB(8.2101拷贝/L的pMD19T-Arc作10 l稀释）（图3)，表明建立的LAMP方法的敏感性较高。1 23 4 5 6 7 8 9 10 11 12 1314 15 16 17 MABA：反应液颜色变化；B：反应产物的琼脂糖凝胶电泳1：金黄色葡萄球菌；2：伪结核棒状杆菌；3：大肠杆菌；4：肠炎沙门氏菌；5：奇异变形杆菌；6：费氏志贺氏菌；7：多杀性巴氏杆菌；8：海藻百伯史坦菌；9：溶血性曼氏杆菌；10：产气英膜梭菌；11：英诺克李斯特氏菌；12：山羊莫拉菌；13：山羊支原体；14：铜绿假单胞菌；15：鲁氏不动杆菌：16：阴性对照(ddHO)：17：化脓隐秘杆菌；M：T r a n s 2 K D NA M a r k e rA:Color change of reaction liquid;B:Agarose gel electrophoresis of reaction productl:Staphylococcus aureus;2:Corynebacterium pseudotuberculosis;3:Escherichia coli;4:Salmonella enteritis;5:Proteus mirabilis;6:Shigella flexneri;7:Pasteurella multocida,8:Bibersteinia trehalosi;9:Mannheimia haemolytica,10:Clostridium perfringens;11:Listeriainnocua;12:Moraxella caprae;13:Mycoplasma capricolum;14:Pseudomonas aeruginosa;15:Acinetobacter Iwoffi;16:Negativecontrol(ddH,O);17:A,pyogenes;M:Trans2K DNA Marker2000bp1000bp750bp500bp250bp100bp2000bp1000bp750bp508bP2506P1o0bp图2 LAMP方法的特异性试验结果Fig.2 Specificity test results of LAMP12345678910NCMABA：反应液颜色变化；B：反应产物的琼脂糖凝胶电泳1：化脓隐秘杆菌；2：阴性对照(ddH,O);M:Trans2K DNAMarkerA:Color change of reaction liquid;B:Agarose gel electrophoresis of reaction product1:A.pyogenes;2:Negative control(ddH,O);M:Trans2K DNA Marker图1最佳反应体系和反应条件下的LAMP反应结果Fig.1 The reaction results of LAMP under optimal systemand conditions2.3特异性试验结果利用建立的LAMP方法检测A.pyogenes、金黄色葡萄球菌和伪结核棒状杆菌等16种细菌的DNA样品，结果显示仅A.pyogenes检测为阳性，其它细菌样品和阴性对照检测结果均为阴性(图2)，表明建立的该LAMP方法特异性较强。2.4敏感性试验结果采用建立的LAMP方法检测各稀释度的pMD19T-Arc，结果显示，该检测方法对重组质粒标准品pMD19T-Arc的检测限为8.2 拷贝/L2000bp1000bp750bp500bp250bp100bpA：反应液颜色变化；B：反应产物的琼脂糖凝胶电泳110：8.2 10*拷贝/L8.2 10 拷贝/L的质粒标准品pMD19T-Arc;NC:阴性对照(ddH,O);M:Trans2K DNA MarkerA:Color change of reaction liquid;B:Agarose gel electrophoresis of reaction product1-10:Plasmid standard pMD19T-Arc with concentrations of8.210copies/L to 8.210-l copies/L,respectively;NC:Negative control(ddH,O);M:Trans2K DNA Marker图3LAMP方法的敏感性试验结果Fig.3 Sensitivity test results of LAMP2.5临床样品检测结果利用建立的LAMP和普通PCR13两种方法分别检测12 8 份山羊和绵羊皮下脓肿1262中国预防兽医学报2023年的脓液样品DNA，结果显示，LAMP和普通PCR两种方法对A.pyogenes的阳性检出率分别为18.8%(24/128)和17.2%（2 2/12 8)；两种方法对12 6 份脓液样品的检测结果相同，另外两份脓液样品的LAMP检测结果为A.pyogenes阳性，但普通PCR检测结果为A.pyogenes阴性，因此两种方法的阳性符合率、阴性符合率和总符合率分别为10 0%(2 2/2 2)、98.1%(104/106)和9 8.4%(12 6/12 8)。表明两种检测方法的符合率较高，所建立的该LAMP检测方法可以用于临床样品检测。3 讨 论A.pyogenes是一种重要的人畜共患条件致病菌，其16 S rRNA基因序列高度保守，菌株间16 SrRNA基因序列相似性高达99.0%10 0%15，因此本研究根据A.pyogenes16SrRNA基因5 端8 0 0 bp的特异性保守核苷酸序列设计两对LAMP引物，在国内外首次建立基于钙黄绿素指示剂的A.pyogenes可视化LAMP检测方法，对A.pyogenes的感染，尤其是致山羊和绵羊皮下脓肿病原的快速检测具有重要意义。MnCl,和MgSO4浓度的优化是基于钙黄绿素指示剂的可视化LAMP方法建立的关键16 。在固定MnCl2浓度1.6 mmol/L(25mmol/L的原液作2 4稀释）优化MgSO4浓度的试验中，当MgSO4浓度2 5.0 mmol/L(100mmol/L的原液作2 2 稀释)时，LAMP反应完全被抑制；当MgSO4浓度12.5mmol/L（10 0 m m o l/L的原液作2 3稀释)时，LAMP反应产物的琼脂糖凝胶电泳均出现LAMP特异性梯度条带，为保证足量的MgSO4激活BstDNA聚合酶，同时保证MgSO4不过量(过量的MgSO4会导致LAMP反应前后反应液颜色保持黄绿色不变而不能实现可视化)，因此选择6.3mmol/L(100 mmol/L的原液作2 4稀释)作为最佳MgSO4浓度。在固定MgSO4浓度6.3mmol/L优化MnCl浓度的试验中，当MnCl浓度为2 5mmol/L时，LAMP反应完全被抑制，表明过高浓度的MnCl会抑制LAMP反应；当MnCl,浓度12.5mmol/L(25mmol/L的原液作2 稀释)时，LAMP反应产物的琼脂糖凝胶电泳均出现较好的LAMP特异性梯度条带，但只有当MnCl,浓度为12.5mmol/L时，反应液颜色由反应前的橘黄色变为黄绿色，因此选择12.5mmol/L作为最佳MnCl,浓度。在固定MgSO4浓度6.3mmol/L和MnC12浓度12.5mmol/L优化内外引物比例时，当内外引物比例3:1时，LAMP反应液颜色由反应前的橘黄色变为鲜艳的黄绿色，为节约内引物的用量，因此选择3:1作为内外引物最佳比例。在最佳反应体系和最佳反应条件下，LAMP反应后反应液颜色变化与反应产物的琼脂糖凝胶电泳出现LAMP特异性梯度条带一致，因此可通过反应前后颜色变化对反应结果做出准确判断，最终建立了A.pyogenes可视化LAMP检测方法。在特异性试验中，该LAMP方法与山羊和绵羊常见的溶血性曼氏杆菌、金黄色葡萄球菌和伪结核棒状杆菌等15种细菌均无交叉反应，证实本研究所建立的LAMP检测方法具有较强的特异性。12 8 份山羊和绵羊脓液样品检测结果显示，LAMP方法和普通PCR方法对A.pyogenes的阳性检出率分别为18.8%(24/128)和17.2%(2 2/12 8)，表明本研究建立的LAMP检测方法较普通PCR方法敏感。另外，本研究建立的LAMP方法对重组质粒标准品pMD19T-Arc的检测限为8.2 拷贝/L，低于唐婕等报道的基于SYTO-9荧光指示剂的A.pyogenes可视化LAMP检测方法对阳性基因组DNA的检测限2 1.8 拷贝/L10、张文龙等报道的基于SYTO-9荧光指示剂的A.pyogenes可视化LAMP检测方法的检测限为35.5拷贝/LI以及Ab-dulmawjood等报道的A.pyogenes的非可视化LAMP检测方法的检测限2 1.6 拷贝/L12，因此本研究所建立的LAMP检测方法的敏感性高于国内外现有的A.pyogenes LAMP检测方法，可以用于A.pyogenes的检测。在临床样品的检测中，由于目前我国尚无A.pyogenes核酸检测的标准方法，本研究利用建立的LAMP方法和Silva等13 报道的普通PCR方法同时对临床样品进行检测，结果表明本研究所建立的LAMP方法与普通PCR的符合率较高，可以用于山羊和绵羊A.pyogenes感染的灵敏、快速可视化现场检测。参考文献：1 FRZEWUSKA M,KWIECIEN E,CHROBAK-CHMIEL D,et al.Pathogenicity and virulence of Trueperella pyogenes:A reviewJ.Int J Mol Sci,2019,20(11):2737.2ZHANG DE-XIAN,ZHAO JING-CUI,WANG QIU-XIA,et al.Trueperella pyogenes isolated from dairy cows with endometritis第12 期李富祥，等.化脓隐秘杆菌可视化LAMP现场检测方法的建立1263in Inner Mongolia,China:Tetracycline susceptibility and tetracy-cline-resistance gene distribution J.Microb Pathog,2017,105:51-56.3 DA SILVA A P,SHIVAPRASAD H L,JERRY C,et al.An un-common case of Trueperella pyogenes infection in an adultbackyard rooster and a retrospective study;2000-2020 J.AvianDis,2021,65(1):171-176.4 CHESDACHAI S,LARBCHAROENSUB N,CHANSOON 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