基因组dna的提取课件.ppt

基因组基因组dnadna的提取课的提取课件件 2 核酸是遗传信息的载核酸是遗传信息的载体，是最重要的生物信息体，是最重要的生物信息分子，是分子生物学研究分子，是分子生物学研究的主要对象。核酸样品的的主要对象。核酸样品的质量直接关系到实验的成质量直接关系到实验的成败。败。【原理原理】3DNADNA提取原则提取原则1 1：DNADNA片段长度（完整性）片段长度（完整性）DNADNA提取原则提取原则2 2：排除其它分子污染（纯度）：排除其它分子污染（纯度）4破碎细胞破碎细胞 提提 取取 纯纯 化化 5破碎细胞破碎细胞 提提 取取 纯纯 化化机机 械械 法法化化 学学 法法酶酶 法法 6破碎细胞破碎细胞 提提 取取 纯纯 化化沉淀法：沉淀法：异丙醇、无水乙醇异丙醇、无水乙醇介质吸附：介质吸附：硅基质硅基质:高盐低高盐低pH值值 结合核酸结合核酸 低盐高低盐高pH值值 洗脱洗脱 阴离子交换树脂阴离子交换树脂 磁珠磁珠 7破碎细胞破碎细胞 提提 取取 纯纯 化化沉淀法：沉淀法：晾干异丙醇或乙醇；适晾干异丙醇或乙醇；适 量量buffer溶解溶解介质吸附：介质吸附：硅基质硅基质:洗杂，空甩洗杂，空甩 2 min,晾晾干；干；低盐高低盐高pH值值 洗脱洗脱 8 9【试剂与器材试剂与器材】1.1.小白鼠（小白鼠（3 3人一组，每人一组，每2 2组一只）组一只）2.2.微量加样器微量加样器 3.3.匀浆器匀浆器4.4.动物组织基因组动物组织基因组DNADNA 提取试剂盒提取试剂盒5.5.生理盐水生理盐水 10小白鼠小白鼠肝肝脱颈处死脱颈处死脱颈处死脱颈处死 右手抓住鼠尾用力向后拉右手抓住鼠尾用力向后拉,同时左手拇指与食指用力向下同时左手拇指与食指用力向下按住鼠头。将脊髓与脑髓拉断，按住鼠头。将脊髓与脑髓拉断，鼠便立即死亡。鼠便立即死亡。【操作流程操作流程】11匀浆器匀浆匀浆器匀浆采用相应的蛋白变性剂和采用相应的蛋白变性剂和蛋白酶蛋白酶K进行处理，消化进行处理，消化蛋白蛋白【操作流程操作流程】沉淀核酸沉淀核酸消化去蛋白消化去蛋白 12 【操作流程操作流程I I】肝+2 mL 2 mL 生理盐水700700L匀浆液离心12000 rpm,12000 rpm,1 min,1 min,弃尽上清破碎细胞破碎细胞加加 GAGA 200 200 L L振荡至彻底悬浮加加 蛋白酶蛋白酶K K 20 20 L L56,60 min,56,60 min,裂解组织，消化蛋白短暂离心（5秒）加加 GBGB 200 200 L L充分混匀，70,10 min70,10 min短暂离心（5秒）标记！标记！上交上交，-20保存硅胶膜吸附法硅胶膜吸附法消化蛋白消化蛋白 13 14 【操作流程操作流程IIII】加加 乙醇乙醇 200 200 L L 混匀至少混匀至少15s15s 短暂离心短暂离心硅胶膜吸附法硅胶膜吸附法沉淀核酸沉淀核酸裂解的样本裂解的样本加入吸附柱加入吸附柱缓冲液冲洗缓冲液冲洗DNA洗脱收集洗脱收集注意：动作要轻柔注意：动作要轻柔 15 【操作流程操作流程IIII】硅胶膜吸附法硅胶膜吸附法沉淀核酸沉淀核酸裂解的样本裂解的样本加入吸附柱加入吸附柱缓冲液冲洗缓冲液冲洗DNA洗脱收集洗脱收集核酸吸附核酸吸附将上一步所得溶液和絮状沉淀都将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱加入一个吸附柱CB3CB3中；中；吸附柱放入收集管中吸附柱放入收集管中 ；12,000rpm12,000rpm离心离心30s30s；倒掉废液，将吸附柱倒掉废液，将吸附柱CB3CB3放回收集放回收集管中管中 注意：未完全消化注意：未完全消化的组织块不要加入的组织块不要加入吸附柱中！吸附柱中！16 【操作流程操作流程IIII】硅胶膜吸附法硅胶膜吸附法沉淀核酸沉淀核酸裂解的样本裂解的样本加入吸附柱加入吸附柱缓冲液冲洗缓冲液冲洗DNA洗脱收集洗脱收集核酸吸附核酸吸附漂洗去杂漂洗去杂漂洗液漂洗去蛋白片段，盐分和漂洗液漂洗去蛋白片段，盐分和其它杂质其它杂质向吸附柱中加入向吸附柱中加入500500L L GDGD，12,000rpm12,000rpm离心离心30s30s，弃废液，将吸，弃废液，将吸附柱放回收集管中；附柱放回收集管中；向吸附柱中加入向吸附柱中加入700 700 L LPWPW，12,000rpm12,000rpm离心离心30s30s，弃弃废液，将吸废液，将吸附柱放回收集管中；附柱放回收集管中；向吸附柱中加入向吸附柱中加入500 500 L LPWPW，12,000rpm12,000rpm离心离心30s30s，弃废液，将吸，弃废液，将吸附柱放回收集管中；附柱放回收集管中；17 【操作流程操作流程IIII】硅胶膜吸附法硅胶膜吸附法沉淀核酸沉淀核酸裂解的样本裂解的样本加入吸附柱加入吸附柱缓冲液冲洗缓冲液冲洗DNA洗脱收集洗脱收集核酸吸附核酸吸附漂洗去杂漂洗去杂洗脱洗脱DNA洗脱前要充分空甩，以除去乙醇的洗脱前要充分空甩，以除去乙醇的影响；影响；采用合适的缓冲液采用合适的缓冲液注意注意:将吸附柱放回收集管中，将吸附柱放回收集管中，12,000rpm，离心，离心2min，倒掉废液，倒掉废液:将吸附柱开盖放置将吸附柱开盖放置5min，以彻底晾，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液干吸附材料中残余的漂洗液;将吸附柱转入干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加100uL洗脱缓冲液TE，室温放置5min；12,0OOrpm离心2min，将DNA溶液收集到离心管中 洗洗脱脱缓缓冲冲液液体体积积不不应应少少于于50L，体体积过小影响回收效率；积过小影响回收效率；为为增增加加基基因因组组DNA的的得得率率，可可将将离离心心得得到到的的溶溶液液再再加加入入吸吸附附柱柱CB3中中，室室 温温 放放 置置 2min，12,000rpm离离 心心2min；洗洗脱脱液液的的pH值值对对于于洗洗脱脱效效率率有有很很大大影响，应在影响，应在7.0-8.5范围内；范围内；DNA产物应保存在产物应保存在20。18 【操作流程操作流程】(总结总结)溶液和絮状沉淀转入加加 PWPW 700 700 L L加加 GDGD 500 500 L L12,000rpm,12,000rpm,离心30s 30s，弃废液加加 PWPW 500 500 L L充分混匀短暂离心勿加入组勿加入组织块！织块！检测样品浓度和纯度，检测样品浓度和纯度，余下样品，余下样品，-20-20保存保存加加 乙醇乙醇 200 200 L L12,000rpm,12,000rpm,离心30s 30s，弃废液12,000rpm,12,000rpm,离心30s 30s，弃废液12,000rpm,12,000rpm,离心30s 30s，弃废液12,000rpm,12,000rpm,离心2min2min，去乙醇晾干晾干5min5min加加 TE TE 100 100 L L加在膜中加在膜中心！心！吸附柱套入吸附柱套入新新离心管离心管，室温，室温放置放置5min5min12,000rpm,12,000rpm,离心2min2min，收集滤液可重复洗脱可重复洗脱动作动作轻柔轻柔 19纯度（纯度（OD260/OD280OD260/OD280）紫外分光光度计进行测量（选择正确的稀释倍数）紫外分光光度计进行测量（选择正确的稀释倍数）OD260/OD280 1.7 OD260/OD280 1.9 OD260/OD280 1.9 说明有部分降解或有说明有部分降解或有RNARNA污染污染得率得率 紫外分光光度计进行测量紫外分光光度计进行测量YieldYield OD26050ng/OD26050ng/LL稀释倍数（双链稀释倍数（双链DNADNA）DNA检测方法检测方法紫外分光光度法紫外分光光度法 20DNA检测方法检测方法电泳检测电泳检测取取5L5L洗脱液洗脱液1%1%琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳,检检测测DNADNA分子大小，纯度以及完整性分子大小，纯度以及完整性电泳检测要控制上样量。上样量过大会导致泳道过亮、拖尾等现象，电泳检测要控制上样量。上样量过大会导致泳道过亮、拖尾等现象，影响正确判断。影响正确判断。如果加样孔里有亮带，说明有蛋白污染。如果加样孔里有亮带，说明有蛋白污染。若上样量合适，泳道有弥散、拖尾现象，说明基因组若上样量合适，泳道有弥散、拖尾现象，说明基因组DNADNA有降解。有降解。21浓度：浓度：100100300ng/uL300ng/uL纯度：任何杂质都可能导致纯度：任何杂质都可能导致DNADNA在储存过程中的降解，在储存过程中的降解，因此要确保纯化得到的核酸的纯度。因此要确保纯化得到的核酸的纯度。温度：纯化得到基因组温度：纯化得到基因组DNADNA之后需将之后需将DNADNA溶液分装保存到溶液分装保存到-20-20，反复冻溶会导致，反复冻溶会导致DNADNA的降解。的降解。溶解溶解DNA BufferDNA Buffer：纯化得到的基因组：纯化得到的基因组DNADNA最好溶解在最好溶解在TrisTris缓冲液（缓冲液（pH8.0)pH8.0)里，因为大片段的基因组里，因为大片段的基因组DNADNA在酸在酸性水溶液中不稳定，易水解。性水溶液中不稳定，易水解。核酸保存核酸保存 22 23 24