基于小鼠肝细胞癌全转录组测序的Ighmbp2表达上调的机制.pdf

基金项目：国家自然科学基金资助项目（，）作者简介：陈峥宇，男，生，在读硕士，：收稿日期：基于小鼠肝细胞癌全转录组测序的 表达上调的机制陈峥宇，倪安妮，唐玉莲，孙丽双，李书，刘会婷，罗绿景，李根亮（右江民族医学院基础医学院生物化学与分子生物学教研室，百色 ；通讯作者，：）摘要：目的探讨免疫球蛋白 结合蛋白 （）在小鼠肝细胞癌（）中上调表达的可能机制。方法 只小鼠注射生理盐水，收集其肝组织作为 组。只小鼠注射 肝癌细胞系，分别收集注射 的小鼠的肝组织、未成瘤小鼠的肝组织及成瘤小鼠的癌旁组织和瘤组织，分别作为 组、组、组和 组。采用全转录组测序和生物信息学分析 基因在各组中的表达，并进一步采用华大基因多组学系统筛选差异表达的 相关基因，构建差异表达相关基因的 、以及 网络，分析其功能。结果与 组相比，组、组、组和 组 基因表达均上调，其中 组中表达最高；组间比较显示，仅 组与其他四组间 基因的表达差异具有统计学意义（）。、和 调控网络显示，与 存在密切关系的转录本有 个、基因编码蛋白有 个，互为竞争性 的分子有 个，其中 、和 在 组中的表达显著低于其他各组，转录本 大量表达于各组，并且在 组的表达远高于其他组。和 富集分析发现，及其相关基因共同参与的功能包括核苷酸结合、结合等，其中部分基因与 基因一样属于核、核仁等细胞组分。结论 基因的上调表达主要是转录本 的上调表达；、和 这 种 可能在瘤体组织中低表达从而减弱了抑制效应进而间接促进 在瘤体组织中的上调表达，其中 可能是影响 表达的关键因素，多种相关分子可能与以上 种 结合形成 调控机制进而进一步精细调控 的表达。关键词：肝细胞癌；全转录组测序中图分类号：文献标志码：文章编号：（）：，（，；，：）：（）（），（），：；肝细胞癌（，）是最常见的原发性肝癌，其预后差，致死率高，是最常见的恶性肿瘤，复发和转移率很高 。研究发现，部分基因在其发病和转移过程中发生了异常变化 ，。弄清这些基因异常表达的原因有利于更好地了解其在肝癌预防、发生和转移中的分子表达机制，为 的研究提供更多的研究思路。然而，大多数出现在肝癌组织及其相关的非病变组织的基因的异常表达机制尚不清楚。因此，研究出肝癌组织及其相关组织中基因的异常表达机制具有重要的研究意义，并且可能产生潜在的临床价值。免疫球蛋白 结合蛋白 （，），该基因编码是螺旋酶家族的成员，它与免疫球蛋白区域的特定 序列结合。该蛋白与 复制、前 剪接和转录有关系，并具有多态性 ，。是一种依赖 的 端 端的螺旋酶，这种螺旋酶主要分布在神经元和非神经元细胞的细胞质上，并与核糖体相关。已有研究表明，引起的氨基酸替代不会影响核糖体结合，但会严重损害 和螺旋酶的活性 。相关疾病可导致胃肠道自主功能障碍的严重外周神经病变 。可以通过心脏功能适应和物理修饰来改变 的过程，以应对负荷和呼吸需求的变化 。最近的研究表明，基因在许多癌症组织中上调表达，参与多种恶性瘤体的生长和发展而对预后产生负面影响 。然而，在肝细胞癌（）中过表达的可能机制有待进一步研究。在本研究中，通过全转录组测序以及生物信息学分析数据，分析 基因在 中的表达，进一步分析全转录组数据中各种 、和 与 基因的 、和靶向性等互作关系，并筛选出 的相关基因，分析其参与的生物学功能，探讨 基因在 组织中上调表达的可能调控机制。材料和方法 细胞株及实验动物小鼠 细胞系（上海中乔新舟生物科技有限公司）。周雄性昆明小鼠 只（长沙市天勤生物技术有限公司，生产许可证：（湘），（湘），洁净级，体质量 。主要仪器及试剂二氧化碳培养箱（三洋有限公司，日本），超微量分光光度计（上海谱元仪器有限公司），罗氏 仪（罗氏企业有限公司，瑞士）。总 提取试剂盒（北京索莱宝科技有限公司），第一链 合成试剂盒（赛默飞世尔科技有限公司，美国），染料 预混液（广州易锦生物技术有限公司），基因 引物（上海生工生物工程有限公司）。小鼠模型的构建及样本的测序和数据分析首先对小鼠进行随机分 组：组、组、组、组、组，每组小鼠 只。其中 只小鼠在前腋下皮下注射 细胞后并按期进行组织收集，另外 只小鼠在前腋下皮下注射生理盐水后进行组织收集，构建方法参照本实验室之前的方法 。只小鼠注射生理盐水，收集其肝组织作为 组。只小鼠注射 肝癌细胞系，收集注射 的小鼠的肝组织作为 组，收集注射 未成瘤小鼠的肝组织作为 组，收集注射 成瘤小鼠的癌旁组织作为 组，收集注射 成瘤小鼠的瘤组织，作为 组。组作为实验组，其他 组作为对照组。取各样本组织 并各自进行 个生物学重复，使用 提取试剂盒提取总 ，然后由深圳华大基因股份有限公司进行各样本的全转录组测序和蛋白质组学测序。质量检测、逆转录、文库构建及测序数据的处理按常规程序进行，转录组数据分析通过深圳华大基因公司的 多组学交互系统（：?）完成。检测 基因的表达，内参基因为 ，引物序列见表 。基因及其转录本的表达分析通过华大基因的 多组学交互系统（：?）收集测序数据中 基因及其转录本的表达量，通过生物信息学方法分析并获得山西医科大学学报，年 月，第 卷 第 期表 基因引物设计序列 名称正向序列（）反向序列（）蛋白质组学数据中 蛋白的表达量数据，利用 转件自带的分析系统计算 基因和编码蛋白在不同组中表达的平均数和标准差，并利用 绘图。相关基因筛选通过深圳华大基因的 多组学交互系统构建 基因的蛋白互作网络（）、调控网络（）、竞争性 网络（），收集所有基因（包括 、和 ），筛选出 组织和对照组织之间的差异表达基因。差异表达的阈值为：（比值）（即二者间 的差异倍数大于 ）、（为校正的 ）、各基因表达的 、非编码 的 。指外显子模型每千个碱基的转录每百万映射读取的 ，即每 百万个比对上的 中比对到外显子的每千碱基上的 个数。相关基因的功能分析和互作网络图构建利用华大基因的 多组学交互系统分析数据，构建 相关基因的表达量聚类热图及包含 、的网络互作图，并对 相关基因进行 和 富集分析。统计学分析采用 统计软件分析，计量资料经正态分布和方差齐性检验后，采用 检验方法进行分析，以 为差异有统计学意义。结果 基因在各样本组织中的表达数据结果显示，相比 组，组、组、组和 组中 基因表达均上调，其中 组中表达最高；组间比较显示，组与 组、组与 组、组与 组、组与 组、组与 组、组与 组间 基因的表达差异均无统计学意义（），组与 组、组与 组、组与 组、组与 组间 基因的表达差异均有统计学意义（，见图 ）。与其他 组比较，；组：接种 细胞 小鼠的肝组织；组：接种 细胞 未成瘤小鼠的肝组织；组：接种 细胞 成瘤小鼠的癌旁组织；组：接种 细胞 成瘤小鼠的瘤组织；组：同法注射生理盐水的对照小鼠的肝组织图 各样本组织中 的相对表达量 另外，在 中存在 基因的 个转录本：、（见图 ）。它们在 组和各对照组中的表达量各不相同，除了 、的表达无统计学意义上的差异外，其他 个转录本的表达在 组与各对照组之间的差异都具有统计学意义（，见表 ），而各对照组之间差异无统计学上的意义（）。不过，除了 基因的转录本 在各样本中的表达量都相对较高外，其他 个转录本表达量在各样本中都相对较低。也就是说，基因在 组织中的过表达主要是转录本 在 组织中的过表达。相关基因的 互作网络分析及不同组间样品间表达对 相关基因进行分析的结果显示，存在大量与 具有互作关系的基因 蛋白，其中与 基因存在密切相关关系的基因 蛋白有 个（见图 ）。，与 组相比，；与 组、组比较，图 基因的不同转录本在 组织及对照组织中的表达 表 组和对照组中 基因表达有差异的转录本的表达量比较（）（）对照组织 （对照组 ）为校正的 为 相关基因的个数；的深浅为基因与基因之间的关联度图 相关基因的互作网络图 山西医科大学学报，年 月，第 卷 第 期聚类热图显示，这 个基因的表达量在不同样本间及组间的表达与 基因总体上一致，仅小部分基因的表达在不同组间具有一定的差异性（见图 ）。本图中的表达量指 值；组用 表示，组用 表示，组用 表示，组用 表示，组用 表示图 相关基因表达量的样品间聚类热图和组间聚类热图 相关基因编码蛋白的功能通过对 相关基因编码蛋白的功能富集分析发现，它主要分布在细胞核、核质、剪接复合体、外显子与外显子连接复合体、细胞质、线粒体等细胞组分中，通过 的加工、剪接、剪接复合体组装、凋亡调控等生物学过程，发挥蛋白结合、类泛素化、（）结合、核酸结合、核苷酸结合等功能，参与 监测、转运、剪接、信号通路、细胞凋亡、泛素介导的蛋白水解等途径（见图 ）。相关 及 相关基因的 、和 分析结果表明，相关基因不仅与 密切相关，这些基因之间也有着密切的相关性。在这些相互作用中，既有多个相关基因 或（和）与 的 互为 ，也有不同 相关基因编码蛋白之间的相互作用或 与 基因及其他相关基因的靶标关系（见图 ）。其中，、和 在 组和各对照组中的表达量各不相同，并且它们在 组中的表达显著低于其他各组（见表 ）。，图 及相关基因的 和 富集分析 山西医科大学学报，年 月，第 卷 第 期红色圆形为 基因；蓝色图形为 基因的相关分子；黄色、红色、橙色线条分别为有关联的 、具有互作关系的分子及具有靶向关系的分子图 中 相关基因的网络互作图 表 组和对照组 基因相关 的表达 组别 组 组 组 组 组 讨论 是一种能与核糖体和多聚体结合的细胞溶性蛋白质，与 复制、前 剪接和转录有关，在 代谢中起作用 ，。研究表明，该分子广泛分布于子宫内膜、皮肤、骨髓、肌肉等多种组织和器官中 ，。研究结果表明，基因在 组织中过表达而在对照组织中低表达，它的表达量与各阶段对照组织的表达量存在统计学意义上的差异。但是，在注射 肝癌细胞 和 均未成瘤小鼠的肝组织中表达差异并不明显，且注射 成瘤小鼠的肝组织比注射 和 未成瘤小鼠中的表达量还要低，这可能与机体对肿瘤异物的免疫有关。肿瘤细胞进入机体后，肿瘤微环境分泌大量细胞因子等相互作用，引起肝脏组织中 高表达；当肿瘤细胞战胜机体免疫快速生长，肝细胞受到极大的损伤，成瘤小鼠癌旁肝脏组织中 表达量减低，肿瘤组织分泌 增多。另外，肿瘤的发展不仅受限于细胞增殖和死亡之间的平衡，还受限于肿瘤抑制基因和凋亡信号致癌之间的平衡。等 就曾报道凋亡细胞死亡的缺陷可以促进癌症的发生，并损害恶性细胞对抗癌治疗的反应。和 通过控制 和 水平促进 细胞增殖，从而防止细胞凋亡和细胞周期停滞 。当然，这其中不排除 相关基因在其中起着重要作用。基因在各样本中都存在 个转录本，且这些转录本在各样本的表达变化趋势大致相同，且在瘤体组织中的表达都高于各对照组织，其中只有转录本 和 的差异表达具有统计学意义，尤其转录本 在 组织中的表达量远超其他转录本。这说明该基因在 中的作用可能主要通过转录本 起作用，而其他的转录本可能只是从旁协助。通过深圳华大基因的 多组学交互系统分析，获得了大量与 具有互作关系的基因，表明该基因功能的复杂性和作用机制的多样性。虽 ，然 相关基因种类众多，但仅有 种差异表达于 组织和对照组织之间。相关基因既有 ，也有 和 ，其中 、和 这 种 高表达于对照组织而低表达于 瘤体组织，而 恰恰相反，其高表达于瘤体组织而低表达于对照组织。由此推测，这 种 可能在对照组织中过表达从而抑制 的表达，而在瘤体组织中低表达导致抑制效应的减弱进而促使 在瘤体组织中上调表达，其中 在 瘤体组织与对照组织中的差异表达也远高于其他 种 ，说明作为其靶标分子的 基因的表达受到 的影响可能远大于受到其他 种 的影响。而各种 及多种相关基因的 可能通过与 基因的 互为 而进一步精细调控 基因的表达。如造血干细胞释放的 通过 轴加重了 细胞的恶性行为 。通过 轴促进细胞增殖、迁移、侵袭和有氧糖酵解，抑制细胞凋亡，从而促进 的进展 。基因功能很多，但主要集中在核功能方面，如 聚合酶对转录的调节（：）、聚合酶对转录的负调节（：）、蛋白质同源寡聚化（：）等生物学过程。在翻译和 代谢等细胞过程中发挥作用 ，其突变会导致 运动神经元的缺失，进而导致肌肉萎缩，尤其是远端肌肉的萎缩 。这与该基因所编码的蛋白质存在的细胞部位及其所具有的分子功能相关。基因编码蛋白存在部位包括细胞质核周区（：）、细胞质（：）、核糖核蛋白复合体（：）、核（：）等。其分子功能包括螺旋酶活性（：）、结合（：）、解旋酶活性（：）、核糖体结合（：）、富含 的单链 结 合（：）、结 合（：）、核苷酸结合（：）等。及其相关基因的功能富集结果还表明，该基因与其相关基因通过互为 、或作为靶标，可能主要通过解旋酶活性、核苷酸结合、结合和 依赖性 解旋酶活性等分子功能，在核、核仁、核糖核蛋白复合物和突触后细胞质等亚细胞部位，参与细胞大小的负调节、端粒维持的负调控、中性粒细胞凋亡的正调控等生物学过程，如 与 的结合提高了 和螺旋酶的活性以及 的处理能力 。实现 基因对 发生、发展和迁移的促进作用。综上所述，基因在 组中的表达高于其他对照组可能主要通过以下几个方面实现：一是 基因在 组织以转录本 的过表达为主，转录本 过表达为辅，进而参与 的病理过程；二是原来在对照组织中高表达而在 瘤体组织中低表达的种 ，尤其 ，与 和 等分子形成 调控机制在 瘤体组织中异常表达，从而抑制了 中 及其他 种 的表达，进而间接促进了 基因的表达；三是 与其相关基因的异常表达从而使细胞内的多个细胞组分出现异常，进而通过影响对细胞大小的负调控，对端粒维持的负调控，对中性粒细胞凋亡的正调控等生物学过程而促进 的病理过程。另外，相关基因还可能在肝癌、细胞衰老、细胞凋亡，甚至 和趋化因子等信号通路中相互协同，共同调控机体的 的病理过程，但分析结果中未发现 基因参与这些 通路，表明这些功能虽然也可能参与 的病理过程，但可能与 基因过表达及参与调控 的作用机制不同。参考文献：，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：，：，（）：，山西医科大学学报，年 月，第 卷 第 期 ，（）：，（）：，（），（）：，（）：，（）：，：，（）：，（）：，（）：，：，：，：（），：，（），（）：，（）：，：，（）：，：，（）：，：，（）：，（）：，（）：，（）：，：，（）：，