基于宏基因组二代测序技术探讨重症肺炎患者病原体分布与其中医证候分型的关系.pdf

Cor论著中国中西医结合急救杂志2 0 2 3年6 月第30 卷第3期ChinJTCMWMCritCare，Ju n e2023,Vol.30,No.3277基于宏基因组二代测序技术探讨重症肺炎患者病原体分布与其中医证候分型的关系于国玮1李玉叶2王秋义1胡鹏？引张磊1赵春玲3任亚茹4刘美蓉11天津市天津医院感染疾病科，天津30 0 2 11；天津市滨海新区中医医院呼吸内科，天津30 0 451；天津市天津医院3内科ICU，4肾内科，天津30 0 2 11通信作者：刘美蓉，Email：l i u m e i r o n g h o t 16 3.c o m【摘要】目的分析重症肺炎患者病原体分布与中医证候分型之间的关系。方法选择2 0 2 1年10 月至2022年9 月天津大学天津医院收治的37 例重症肺炎患者作为研究对象。通过宏基因组二代测序（mNGS）进行病原体检测，分析不同中医证候分型重症肺炎患者的病原体分布情况。结果共纳入37 例重症肺炎患者，其中痰热雍肺证16 例（43.2 4%），热陷心包证6 例（16.2 2%），邪陷正脱证5例（13.51%），气阴两虚证4例（10.8 1%），痰湿阻肺证3例（8.11%）,肺脾气虚证3例（8.11%）；患者感染的病原体类型、病原体类型种数与中医证候分型之间差异无统计学意义（P0.05）；肺炎克雷伯菌感染与痰热雍肺证之间差异有统计学意义（x=9.306，P=0.003）。结论重症肺炎患者感染病原体类型及病原体类型数量与其中医证候分型无明显关系,肺炎克雷伯菌感染与痰热雍肺证型关系密切。【关键词】宏基因组二代测序；重症肺炎；病原体；口中医证候分型基金项目：天津市卫生健康委天津市中医药管理局中医中西医结合科研课题（2 0 2 1158）D01:10.3969/j.issn.1008-9691.2023.03.005The relationship between the distribution of pathogens and the traditional Chinese medicine syndromeclassification based on metagenomic next-generation sequencingYu Guowei,Li Yuye,Wang Qiuyi,Hu Peng,Zhang Lei,Zhao Chunling,Ren Yaru,Liu MeirongDepartment of Infectious Diseases,Tianjin Hospital,Tianjin 30021l,China;Department of Respiratory Medicine,BinhaiHospital of Traditional Chinese Medicine,Tianjin 300451,China,Department of Internal Medicine Intensive Care Unit,Department of Nephrology,Tianjin Hospital,Tianjin 300211,CAbstract Objective To analyze the relationship between pathogens distribution and traditional Chinesemedicine(TCM)syndrome classification in patients with severe pneumonia.Methods A total of 37 patients withsevere pneumonia admitted to Tianjin Hospital from October 2021 to September 2022 were selected as the researchsubjects.Pathogen detection was performed using metagenomic next-generation sequencing(mNGS),and the pathogendistribution of severe pneumonia patients with different TCM syndromes classification was analyzed.Results Amongthe 37 patients with severe pneumonia,there were 16 cases of lung phlegm heat syndrome(43.24%),6 cases of heat-trapping pericardial syndrome(16.22%),5 cases of interior invasion of pathogen and vital qi collapse syndrome(13.51%),4 cases of qi-yin deficiency syndrome(10.81%),3 cases of phlegm-dampness accumulated in the lung syndrome(8.11%),and 3 cases of lung-spleen qi deficiency syndrome(8.11%).There was no statistically significant differencein the type and number of pathogen infections among different TCM syndromes classification(P 0.05).However,there was a statistically significant difference between Klebsiella pneumoniae infection and phlegm-heat obstructingthe lung syndrome(x?=9.306,P=0.003).Conclusion There is no significant relationship between the type andnumber of pathogen infections and TCM syndrome classification in patients with severe pneumonia.However,Klebsiellapneumoniae infection is closely related to lung phlegm heat syndrome.Key words Metagenomic next-generation sequencing;Severe pneumonia;Pathogen;Traditional Chinesemedicine syndrome classificationFund program:Research Project of Tianjin Municipal Health Commission on Integrated Traditional Chinese anWestern Medicine of Tianjin Administration of Traditional Chinese Medicine(2021158)D0I:10.3969/j.issn.1008-9691.2023.03.005尽管近年来我国对于重症肺炎的诊疗不断完善，但由于免疫抑制剂和广谱抗菌药物的应用及细菌耐药性的变异等多种因素的影响,重症肺炎及其导致的多器官衰竭仍是我国医学面临的棘手问题之重症肺炎诊疗的关键是早期明确病原体类型并根据病原体类型合理选择抗菌药物及给药途径。传统的病原学检测手段不仅耗时长、阳性检出率低，而且检测范围较为局限。宏基因组二代测序(metagenomic next-generation sequencing,mNGS）是近年来逐渐兴起的微生物鉴定手段，较传统病原学中国中西医结合意救杂志2 0 2 3年6 月第30 卷第3期ChinJTCMWMCritCare，Ju n e2023,Vol.30,No.3278检测手段具有检测周期短、敏感度高和准确性高、检测范围宽等优点，目前已经广泛应用于重症肺炎的诊治中。近年来，中医学对于重症肺炎的诊疗也在进一步深人和细化，社区获得性肺炎中医诊疗指南（2 0 18 年修订版）2 中已经指出了几种常见重症肺炎的中医证型及其治法。大量研究表明，中医药干预及中西医结合治疗有助于改善重症肺炎患者的预后 3-6 1。鉴于此，本研究基于mNGS技术探讨重症肺炎患者病原体分布与其中医证候分型的关系，根据其相关性进一步探究重症肺炎的中医药治疗方案，做到早期对重症肺炎患者进行中西医结合干预，从而最大程度改善患者预后，降低患者病死率。1资料与方法1.1研究对象：选取2 0 2 1年10 月至2 0 2 2 年9 月本院收治的37 例重症肺炎患者,其中男性2 1例（56.7 6%），女性16 例（43.2 4%）；年龄2 6 9 9 岁，平均(6 2.0 317.8 5)岁。1.1.1纳入标准：年龄18 岁；符合社区获得性肺炎中医诊疗指南（2 0 18 年修订版）2 和中国成人社区获得性肺炎诊断和治疗指南（2 0 16 年版)7 中重症肺炎诊断标准；有血培养、痰培养、胸腔积液培养、经支气管镜肺泡灌洗液(bronchoalveolarlavagefluid,BALF）培养、刷检培养、血清学抗体、鼻咽拭子聚合酶链反应（polymerasechainreaction，PCR）体液胶体金检测结果及mNGS检测结果。1.1.2排除标准：有严重精神疾病；住院时间 2 4h；无明确病情转归；临床病例资料收集不全。1.1.3伦理学：本研究符合医学伦理学标准，并经天津医科大学天津医院院医学伦理委员会批准（审批号：2 0 2 1-143),对患者采取的检测和治疗均获得患者或家属的知情同意1.2方法及步骤：收集患者痰液、血液、胸腔积液、尿液、BALF并送检。1.2.1痰液：患者清晨清理口腔后咳出气道深部痰液，留于无菌痰盒中，30 min内送检实验室行痰涂片革兰染色，如果痰涂片提示为合格标本同时提示为链状排列阳性球菌，痰培养时行奥普托欣试验胆汁溶菌试验鉴定菌种，菌种确诊为肺炎链球菌后行荚膜肿胀试验或凝集试验鉴定菌型；患者晨起清理口腔后咳出气道深部痰液3 5mL留于NGS标本盒中，使用Miniseq和Nextseq平台桥式PCR技术进行mNGS检测，必要时可与其他体液标本提取遗传物质后合并上机测序（鸡尾酒方式）。1.2.2血液：患者体温升高至38.5以上或寒战初起时取静脉血2 0 mL，注人全自动微生物培养系统培养瓶中（标准需氧瓶和含溶血素厌氧瓶）送实验室进行菌种鉴定；取血8 10 mL,采用双向晶闸管（bidirectional thyristor，BCT)送检，使用Miniseq和Nextseq平台桥式PCR技术进行mNGS检测。1.2.3胸腔积液：胸腔穿刺后抽取胸腔积液量20mL注人BACTECTMFX全自动微生物培养系统培养瓶（标准需氧瓶和含溶血素厌氧瓶）,送实验室进行菌种鉴定；患者胸腔穿刺后抽取胸腔积液量5 10 mL放置至室温时立即进行肺炎链球菌尿抗原检测，使用肺炎链球菌抗原检测试剂盒BinaxNOW-ICT，15m i n 后读取结果；抽取胸水8 10mL，采用BCT送检，使用Miniseq和Nextseq平台桥式PCR技术进行mNGS检测，必要时与其他体液标本提取遗传物质后合并上机测序（鸡尾酒方式）。1.2.4尿液：取即时尿液量5 10 mL放置至室温时立即进行肺炎链球菌尿抗原检测，使用BinaxNOW-ICT试剂盒，15min后读取结果。1.2.5BALF：不可对靶病灶直接进行灌洗，但可以对靶病灶的上级引流气道进行灌洗，单靶部位的灌洗液量不少于10 mL；取BALF510mL放置到室温后立即使用BinaxNOW-ICT试剂盒进行肺炎链球菌尿抗原检测，15min后读取结果；单靶部位灌洗液量不少于3mL送检mNGS检测，必要时可与其他体液标本提取遗传物质后合并上机测序（鸡尾酒方式）。1.2.6经支气管镜刷检：不可使用支气管镜刷头直接对靶病灶进行刷检，但可以对靶病灶的上级引流气道进行刷检，支气管镜刷头可以作为样本送检微生物实验室，单靶部位单次送检不少于1枚刷头；支气管镜刷头也可以作为样本送检mNGS，单靶部位单次送检不少于1枚刷头。1.3观察指标：观察重症肺炎患者病原体类型分布、病原体类型种数的分布、中医证候分型分布，分析病原体类型与中医证候分型的关系、感染病原体类型种数与中医证候分型的关系、不同病原体与中医证候分型的关系。1.4统计学方法：采用IBMSPSS23.0软件进行统计分析。若计量资料符合正态分布以均数土标准中国中西医结合急救杂志2 0 2 3年6 月第30 卷第3期ChinJTCMWMCritCare，Ju n e2023,Vol.30,No.3279差（元土s）表示，以方差齐性进行单因素方差分析；计数资料以株（%）表示，采用检验。P0.05,重症肺炎患者病原体类型与其中医证候分型之间差异无统计学意义。8,11%13.51%痰湿阻肺证痰热垂肺证16.22%肺牌气虚证气阴两虚证43.24%热陷心包证10.81%邪陷正脱证8.11%图2 37 例重症肺炎患者的中医证候分型分布表137 例重症肺炎感染不同病原体类型患者的中医证候分型分布病原体痰湿阻肺 痰热雍肺肺脾气虚气阴两虚热陷心包邪陷正脱类型【例(%)【例(%)【例(%)例(%)【例(%)【例(%)革兰阴性菌1(4.17)13(54.17)2(8.33)1(4.17)5(20.83)2(8.33)革兰阳性菌2（9.09)9(40.91)1(4.55)3(13.64)3(13.64）4(18.18)真菌1（6.25)8(50.00)0(0.00)16.25）4(25.00)2(12.50)病毒00.0011(45.83)1(4.17)28.33)5（2 0.8 3）5(20.83）非典型病原体1(33.33)2(66.67)0（0.0 0)0（0.00)0(0.00)0(0.00)2.5感染不同病原体类型种数患者中医证候分型（表2）：纳入研究的37 例重症肺炎患者,经mNGS检测出的病原体类型数量与其中医证候分型经Kruskal-WallisH检验提示P0.05，即重症肺炎感染病不同原体类型种数患者中医证候分型差异均无统计学意义（P0.05）。表2 37 例重症肺炎感染病原体类型种数患者中医证候分型分布病原体类型痰湿阻痰热雍肺脾气气阴两热陷心邪陷正种数（种）肺（例）肺（例）虚（例）虚（例）包（例）脱（例）11322002231133306011140400212.6不同类型病原体与中医证候分型的关系（表3 4)：纳人研究的37 例重症肺炎患者中，15例（40.54%）检测出肺炎克雷伯菌，2 3例（6 2.16%）经mNGS检测出人类疱疹病毒,其余病原体检出不足表337 例重症肺炎患者感染病原体的分布构成比构成比构成比构成比构成比病原体病原体病原体病原体病原体%(株)%(株)【%(株)%(株)%（株)革兰阴性菌豪氏变形菌2.70(1)粪肠球菌10.81(4)人血链球菌2.70(1)小孢根霉5.41(2)肺炎克雷伯菌40.54(15)斯尼斯菌2.70(1)溶血葡萄球菌8.11(3)佩氏葡萄球菌2.70(1)病毒嗜麦芽窄食单胞菌18.92(7)军团杆菌2.70(1)结核分枝杆菌8.11(3)枯草芽孢杆菌2.70(1)人类疱疹病毒62.16(23)不动杆菌16.22(6)卡他莫拉菌2.70(1)表面葡萄球菌5.41(2)真菌细环病毒8.11(3)铜绿假单胞菌8.11(3)阴沟肠杆菌2.70(1)纹带棒状杆菌5.41(2)白色念珠菌21.62(8)细小病毒2.70（1)大肠埃希菌5.41(22)革兰阳性菌异常球菌2.70(1)耶氏肺孢子菌13.51(5)非典型病原体伯克霍尔德菌2.70(1)金黄色葡萄球菌16.22(6)大芬戈尔德菌2.70(1)光滑念珠菌8.11(3)支原体8.11(3)二氧化碳嗜纤维菌2.70(1)屎肠球菌16.22(6)黏液罗氏菌2.70(1)曲霉菌5.41(2)细小脲原体2.70(1)霍氏肠杆菌2.70(1)中国中西医结合急救杂志2 0 2 3年6 月第30 卷第3期ChinJTCMWMCritCare,June2023,Vol.30,No.328010例。2 3例检测出人类疱疹病毒的重症肺炎患者中，10 例为痰热雍肺证，5例为热陷心包证，5例为邪陷正脱证，2 例为气阴两虚证，1例为肺脾气虚证。是否检测出人类疱疹病毒与各中医证型之间差异无统计学意义（均P0.05）。15例检测出肺炎克雷伯菌的患者中，11例为痰热雍肺证，2 例为热陷心包证，2 例为邪陷正脱证。重症肺炎患者是否经mNGS检测出肺炎克雷伯菌与是否为痰热雍肺证候之间差异有统计学意义（x=9.306，P=0.0 0 3）。表437 例重症肺炎患者是否经mNGS检测出肺炎克雷伯菌与是否为痰热雍肺证的比较例数痰热雍肺其他中医mNGS结果X值P值（例）证（例）证型（例)检测出肺炎克雷伯菌151149.306 0.003没有检测出肺炎克雷伯菌225173讨论研究显示,纳人的37 例重症肺炎患者中,检测出革兰阴性菌感染的概率略高于革兰阳性菌，远高于真菌感染和非典型病原体感染。重症肺炎患者检测出病毒感染的概率虽然也很高，但病毒毒株多为人类疱疹病毒。人类疱疹病毒虽然分布广且感染性强，但其感染后多潜伏在人体，并不引起临床症状或仅引起轻微临床症状，很少能成为导致患者获得重症肺炎的关键性致病病原体8 。由此得出结论,重症肺炎患者的致病病原体多为细菌、致病病原体为革兰阴性菌的概率略高于革兰阳性菌进一步对重症肺炎患者的致病病原体进行分析显示,本研究纳人的37 例重症肺炎患者中,经mNGS检测出的革兰阴性菌多为肺炎克雷伯菌、嗜麦芽窄食单胞菌、不动杆菌和铜绿假单胞菌；革兰阳性菌多为金黄色葡萄球菌、屎肠球菌和粪肠球菌。既往有研究显示,重症肺炎患者检测出的致病菌以肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌最为常见9-1,总体趋势与本研究相符。纳入研究的37 例重症肺炎患者中，16 例为痰热雍肺证患者，占病例总数的43.2 4%，提示痰热雍肺是重症肺炎患者最常见的中医证候类型，这也与既往的研究结果一致 12-13。本研究对痰热雍肺证患者的资料进一步分析显示，16 例痰热雍肺证患者中13例检测出革兰阴性菌感染，提示痰热肺证与革兰阴性菌感染密切相关。有研究显示,中医证候分型与炎症指标具有一定相关性，其中痰热雍肺证的白细胞计数（whitebloodcellcount，W BC)、C-反应蛋白（C-reactiveprotein，CRP）、降钙素原（p r o c a l c i t o n i n，PCT）等炎症细胞因子水平较其他证型明显升高14-17 。而既往多项研究结果显示，革兰阴性菌感染患者的CRP、PCT、I L-6 等炎症指标水平显著高于革兰阳性菌感染者18-2 0 。本研究显示，检测出肺炎克雷伯菌感染的患者大多为痰热雍肺证。肺炎克雷伯菌是一种常见的医院获得性肺炎致病菌,且耐药率逐年升高,其中耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌已经成为目前最常见耐药菌之二2 1-2 3。胡崇静等2 4 的研究提出,肺炎克雷伯菌感染以痰热雍肺证、气阴两虚证为主。有研究表明，耐药菌感染的肺炎患者常有咳嗽、咳痰、痰液黏稠或拉丝样痰、舌苔黄腻、便秘等特点2 5,且耐药菌感染患者的炎症指标会出现明显升高，基于此，我们认为肺炎克雷伯菌感染常表现为痰热雍肺证。重症肺炎的常见致病病原体除肺炎克雷伯菌外,还包括鲍曼不动杆菌、大肠埃希菌等2 3。有研究表明，鲍曼不动杆菌感染患者的证候多为虚实夹杂证，实证以痰热雍肺证为主，虚实夹杂证以气阴两虚、痰热阻肺证为主2 6 。本研究中并未得出相似的结果，考虑与样本量不足有关，后续研究中需加大样本量,进一步探讨重症肺炎常见致病病原体与其中医证候分型的关系。国内有研究显示，治疗痰热雍肺证的药物有清金化痰汤等，对包含肺炎克雷伯菌在内的革兰阴性菌肺炎有显著疗效2 7 。传统中药方剂治疗正在逐步显示出其优越性，尤其在重型新型冠状病毒（新冠病毒）感染的治疗中，中医药治疗显示出了其独特的优势。针对新冠病毒感染的治疗因缺乏特效药，西医尚缺乏有效的治疗手段。而中医药因其能改善人体自身内环境，提高机体免疫应答，从而达到改善临床预后的效果2 8 1,所以在新冠病毒感染的治疗中显示出特有的效果，如小承气汤、血必净注射液等2 9-30 。多篇文献报告，应用中西医结合方法治疗重型新冠病毒感染，可以明显改善患者临床症状及生活质量，缩短核酸转阴的时间731-33利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突参考文献1赵晶晶，周小妹，姚莉.ICU重症肺炎患者进展为急性呼吸窘迫综合征的危险因素分析.中国呼吸与危重监护杂志，2018,17(6):561-564.D01:10.7507/1671-6205.201801035.2 中华中医药学会内科分会，中华中医药学会肺系病分会，中国民族医药学会肺病分会.社区获得性肺炎中医诊疗指南（2 0 18修订版）J.中医杂志，2 0 19,6 0（4)：350-36 0.D0I:10.13288/j.11-2166/r.2019.04.019.【3胡靓，金月娥，陈彩.清热化痰宣肺汤治疗痰热雍肺型重症编者读者作者（责任编辑：邸美仙）中国中西医结合急救杂志2 0 2 3年6 月第30 卷第3期ChinJTCMWMCritCare，Ju n e2023,Vol.30,No.3281肺炎47 例观察J.浙江中医杂志，2 0 2 2,57(3)：18 9-19 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汪晖，张国强.解毒祛瘀代表中成药血必净注射液辅助治疗重症肺炎临床疗效的Meta分析J.中国中西医结合急救杂志，2021,28(1):24-30.D01:10.3969/j.issn.1008-9691.2021.01.007.31李春艳，倪菁，李国妮，等.延安市4例新型冠状病毒肺炎患者中西医结合治疗分析J.中国中西医结合急救杂志，2 0 2 0,27(2):206-209.D01:10.3969/j.issn.1008-9691.2020.02.019.32 龙坤兰，翁祥文，高培阳.早期中医干预治疗新型冠状病毒肺炎患者分析J.中国中西医结合急救杂志，2 0 2 0,2 7(2):2 36-2 38.D0I:10.3969/j.issn.1008-9691.2020.02.028.【33兰俊，樊恭春，孟龙.祛湿排毒扶正方治疗寒湿郁肺证和疫毒闭肺证新型冠状病毒肺炎的临床疗效及机制探讨J.中国中西医结合急救杂志，2 0 2 0,2 7(3)：2 6 2-2 6 6.D0I:10.3969/j.issn.1008-9691.2020.03.002.（收稿日期：2 0 2 3-0 4-2 3）中国中西医结合急救杂志关于统计学方法的写作要求尽可能详细描述，补充有关统计研究设计、资料的表达与描述、统计分析方法的选择、统计结果的解释和表达等要求。应写明所用统计分析方法的具体名称（如成组设计资料的t检验、两因素析因设计资料的方差分析等）和统计量的具体值（如t=3.45),并尽可能给出具体的P值（如P=0.023）；当涉及总体参数时，在给出显著性检验结果的同时，还应给出9 5%可信区间。对于服从偏态分布的定量资料，应采用中位数（四分位数间距或四分位数）【M（Q R）或M（Q L，Q u）)方式表达，不应采用均数土标准差（元土s）方式表达。对于定量或定性资料，应根据所采用的设计类型、资料所具备的条件和分析目的，选用合适的统计分析方法，前者不应盲目套用t检验和单因素方差分析，后者不应盲目套用检验。要避免用直线回归方程描述有明显曲线变化趋势的资料。不宜用相关分析说明两种检测方法之间吻合程度的高低。对于多因素、多指标资料，要在一元分析的基础上，尽可能运用多元统计分析方法，以便对因素之间的交互作用和多指标之间的内在联系作出全面、合理的解释。使用相对数时，分母不宜小于2 0；要注意区分百分率与百分比的不同。统计学符号按CB/T3358.1-2009统计学词汇及符号第1部分：一般统计术语与用于概率的术语的有关规定书写，一律用斜体。