结核病防治规划 痰涂片镜检标准化操作及质量保证手册.pdf

中国结核病防治规划痰涂片镜检标准化操作及质量保证手册前言 3第一章绪论 6第二章痰涂片显微镜检查标准化操作 7第一节痰涂片检查的目的及优势.7一、诊断传染性肺结核.7二、评价化疗效果.7三、为流行病学疫情评价服务.7第二节痰涂片检查对象.8一、确定诊断.8二、疗效评价.8第三节痰标本的采集.9一、采集痰标本的容器.9二、痰标本的采集时间和采集次数.9三、对就诊者的留痰宣传教育.9四、采集痰标本地点.10五、痰标本评价.10第四节直接涂片抗酸染色显微镜检查标准化操作程序.11一、萋尔原尼尔逊染色显微镜检查法（ZiehLNeelson,简称萋尼染色法）.11二、荧光染色显微镜检查法.14三、玻片的保存.15四、抗酸菌痰检注意事项.15第五节显微镜的使用、维护和保养.17一、一般原则.17二、日常维护.18三、维修和保养.18第六节试剂和材料.19第三章痰涂片显微镜检查质量保证20第一节实验室网络及职能.20一、结核病实验室网络.20二、质量保证体系中各级实验室职能.21第二节室内质量控制.22一、痰标本收集.22二、抗酸染色液制备.23三、涂片制备.23四、染色.23五、镜检.24六、登记报告.24七、痰涂片保存.24第三节室间质量评估.25一、现场评价.25二、盲法复检.26三、批匕量测试.36第四章报表39一、盲法复检结果上报.39二、实验室基本情况上报.40参考文献 43附件 45附件1、结核病细菌学实验室登记本.45附件2、痰涂片镜检检验.47附件3、染色剂配制、保存.49附件4、结核病实验室痰涂片镜检督导清单.51附件5、督导报告参考模式.57附件6、盲法复检涂片抽取举例.59附件7、术语注释.62第一章概论在结核病控制工作中，通过实验室细菌学检查诊断传染性肺结核是DOTS策 略的重要要素之一，痰结核菌检查对于发现传染源、确定诊断和化疗方案、考核 疗效、评价防治效果具有重要意义。因此，结核病细菌学检查是国家结核病防治 规戈Li(National Tuberculosis Programme,NTP)的重要组成部分，在现代结核 病控制工作中起着不可缺少的重要作用。为了进一步加强结核病细菌学实验室质量控制，实现全国结核病控制规划目 标，必须具备完善、有效的结核病实验室网络，实验室必须能够提供准确可信的 试验结果，并且符合成本一效益原则。为此，只有通过实施有效的质量保证(QualityAssurance,QA)才能实现。完善的实验室质量保证系统依赖于国家 结核病防治规划对各级实验室工作的支持、培训和监督，并在具体实施过程中逐 步兀普。本手册目的是提供标准化操作程序，为评估实验室工作的质量和结果的可靠 性提供指南和方法。需要指出的是应用这些方法并不是为了校正每个病人的诊断 正确与否，而是为了发现实验室工作中可能存在的问题并提出相应的解决方案和 措施，从而确保整个实验室诊断服务的质量。第二章痰涂片显微镜检查标准化操作一、痰涂片检查的目的及优势在当前国家结核病防治规划的框架下，通过痰涂片显微镜方法检查抗酸杆菌(acid-fast bacilli,AFB)的目的是:(-)诊断传染性肺结核结核病的控制是以发现和控制传染源为主，而痰涂片AFB阳性的肺结核患者 是社会上最主要的传染源，故痰涂片AFB检结果对诊断传染性肺结核是一项重要 指标。(二)评价化疗效果结核病是由结核分枝杆菌引起的，现行化疗方案的制定也主要以结核分枝杆 菌的生物学特性为依据,所以对化疗效果的评价，也将细菌学检查结果作为根据。(三)为流行病学疫情评价服务由于传染性结核病在流行病学中有着特殊的意义，因此，在反映某一国家或 地区结核病疫情的严重程度的指标中，涂阳患病率、涂阳发病率被更多关注。根据世界卫生组织(World Health Organization,WHO)和国际防爆及肺部 疾病联合会(International Union Against Tuberculosis and LungDisease,UNION)针对低收入且结核病疫情严重的发展中国家所制定的技术指 南，痰涂片镜检是相应国家开展结核病控制项目时非常符合成本效益原则的细菌 学实验技术。相对于临床和实验室经常采用的其它诊断和检查项目，高质量的痰 涂片镜检有其自身特有的优势：1、作为诊断手段，对传染性肺结核的诊断比X线的准确性高；2、技术相对简单，容易标准化和完成操作；3、建立AFB检查时需设备投入少；4、检查成本低，易于接受；5、从收到标本到报告结果的时间短，能够满足临床诊断的需要；6、对涂阳患者的治疗效果，能够作出及时和准确的评价。二、痰涂片检查对象根据国家结核病防治规划指南的有关规定，检查对象根据检查目的分为 两类：确定诊断（发现传染源）、疗效评价（作为确定化疗方案和治疗效果评价 的指标）。（一）确定诊断凡因结核病症状求诊及转诊的可疑肺结核患者，均应进行痰涂片检查。确定 诊断的涂片检查应采集3个合格的痰标本。就诊当时在门诊留一份“即时痰”标 本，同时给患者2个痰盒，嘱患者留取“夜间痰”和“晨痰”，于次日交验。（二）疗效评价凡已确诊、登记、治疗的肺结核患者，在化疗期间按照规定应定期查痰：1、初治涂阳患者在疗程强化期末、治疗5个月末和继续期结束时（一般为治疗后 的第2、5和6个月）；复治涂阳患者在疗程强化期末、治疗第5个月末和继续期结 束时（一般为治疗后的第2、5和8个月），分别收集1份晨痰和即时痰进行涂片检 查。2、初、复治涂阳患者在疗程强化期结束时，痰菌仍为阳性者，应在治疗第3个月 末增加痰涂片检查1次。3、确诊、登记的涂阴肺结核患者，即使患者因故未接受治疗，也应在登记后满2 个月和6个月时进行痰菌检查。三、痰标本的采集（-）采集痰标本的容器必须采用可密封的、带螺旋盖的容器（图1）收集痰标本。容器的参考规格 为：直径4厘米，高度2厘米。痰容器应标明病人姓名、编号（初诊病人门诊序号 或随访病人登记号）、检查项目和痰标本序号1、2、3（“1”为当日即时痰，“2”为夜间痰，“3”为次日晨痰）。图1标本容器（二）痰标本的采集时间和采集次数1、根据痰标本采集的时间，可将标本分为三类：即时痰：就诊时深呼吸后咳出的痰液 晨 痰：患者晨起立即用清水漱口后，咳出的第2 口、第3 口痰液 夜间痰：送痰前一日，患者晚间咳出的痰液2、痰标本采集的数量：初诊患者应收集3份痰标本（当日即时痰、夜间痰、次日晨痰）；治疗或随访患者应按期留取2份标本（晨痰、即时痰）。进行AFB检查的医疗机构应提供符合要求的并作了标记的痰盒给患者。三、对就诊者的留痰宣传教育对疑似肺结核病者，临床医护人员应通过解释，使其充分了解标本质量对涂 片显微镜检查的重要性，示范并指导其掌握从肺部深处咳痰的方法；还要告知患 者获得理想的痰标本有时需要反复数次才能获得。如患者识字，可提供宣教材料。正确地收集痰液的方法：1、深吸气2-3次，每次用力呼出。2、从肺部深处咳出。3、将打开盖的痰盒靠近嘴边收集痰液。4、拧紧盒盖。注：如果患者刚吃过东西，应先用清水漱口。装有义齿的患者在留取痰标本之前 应先将义齿取出。四、采集痰标本地点当患者咳嗽、咳痰时，易产生含有结核菌的气溶胶，感染周边人群的机率较 高，故采集痰标本时应在远离人群的开放空间，或通风良好的留痰室内进行。五、痰标本评价患者留取的痰标本，应由检验人员或经培训的专人目视检查标本质量（特别 是用于初次诊断的痰标本）：标本量一般在35 ml,标本性状属于干酪痰、褐 色血痰或含少量新鲜血液的血痰、粘液痰者为合格的标本；痰标本不合格者，应 予以进一步指导并要求其重新送检。进行细菌学检查时应在结核病细菌学实验室 登记本（附件1）和痰涂片镜检检验报告单（附件2）上注明标本性状，以供分析 结果时参考。合格的痰标本应是患者深呼吸后，由肺部深处咳出的分泌物。按性状痰标本 可分为以下几种：干酪痰：标本外观以黄色（或奶酪色）、脓样、团块状的肺部分泌物为主，粘度较粘液痰低，制片时较易涂抹；涂片染色后镜检，可发现大量脓性炎症 细胞、肺上皮脱落细胞。由于此类标本是由肺部深处咳出，对肺结核的诊断 最有价值，故AFB的检出率较高。血痰：此类标本是因黏液痰或干酪痰标本中混有血液而形成，颜色为褐色或 深褐色、鲜红色或伴有血丝；涂片染色后镜检除能够观察到粘液痰或干酪痰 的细胞特征外，含新鲜血液的标本中可见到被染色的血细胞。由于含血标 本易干扰AFB镜检的结果，故在制片时应尽量避免挑取含血标本。黏液痰：标本外观以白色、粘稠度较高的肺部和支气管分泌物为主，制片时 需仔细涂抹；涂片染色后镜检时，镜下可见支气管内膜纤毛柱状上皮细胞（细 胞较长且形态不规则、细胞核和细胞质着色均较深，细胞一端可见着色较浅 的纤毛），伴有少量肺上皮脱落细胞（多数为圆形、细胞核较小且着色较细 胞质深，核质比大于1：3）、脓性炎症细胞（卵圆形、细胞核占细胞比例较 大且着色较深，核质比低于1：1）、口腔脱落细胞及口腔寄生菌。此类标本 的AFB检出率较唾液高。唾液：目视观察标本整体外观，以透明或半透明水样、粘度较低的口腔分泌 物为主，标本中有时伴有气泡；涂片染色镜检时，镜下可见少量口腔上皮脱 落细胞（形态不规则、细胞核着色较细胞质深，核质比接近或大于L 2）和 口腔内寄生菌，有时可见食物残渣。由于此类标本进行AFB检查时的检出率 很低，是不合格的标本。四、直接涂片抗酸染色显微镜检查标准化操作程序（）萋尔尼尔逊染色显微镜检查法（ZiehLNeelson,简称 萋尼染色法）1、涂片制备（1）使用一端有磨砂面的无划痕的新玻片，经脱脂干燥、清洁后备用；（2）用2B铅笔在磨砂面上注明实验序号及标本序号；（3）确保玻片上的编号与痰盒上的编号相同。（4）小心打开承载痰标本的容器，防止产生气溶胶或使标本外溢。（5）仔细观察标本，使用折断的竹签茬端，挑取痰标本中干酪样、脓样或可疑 部分约0.05 ml,于玻片正面均匀涂抹成1 0X20 mm的卵圆形痰膜（见图 2）o（6）痰膜朝上静置自然干燥后（一般约需要30分钟）进行染色镜检。（7）为保证检验人员的安全，严禁在涂抹痰标本的同时对载玻片进行加热。涂 抹完毕后的痰标本，在结果报告前应暂时保留。图2制备好的痰涂片示例2.染色（1）涂片自然干燥后，放置在染色架上，玻片间距保持10 mm以上的距离；加热固定（在5秒钟内将玻片经过火焰加热4次）。（2）滴加石碳酸复红染液盖满玻片，加热至出现蒸汽后，停止加热，保持染色 5分钟。染色期间应始终保持痰膜被染色液覆盖，必要时可续加染色液。加热时勿使染色液沸腾。高海拔地区应适当增加加热次数和染色时间。（3）流水自玻片一端轻缓冲洗，冲去染色液，沥去标本上剩余的水。（4）自痰膜上端外缘滴加脱色剂盖满玻片，脱色1分钟；如有必要，流水洗去 脱色液后，再次脱色至痰膜无可视红色为I匕（5）流水自玻片一端轻缓冲洗，冲去脱色液，沥去玻片上剩余的水。（6）滴加亚甲蓝复染液，染色30秒钟。（7）流水自玻片一端轻缓冲洗，冲去复染液，然后沥去标本上剩余的水。待玻 片干燥后镜检。（8）一张染色合格的玻片，痰膜肉眼观为亮蓝色，无红色斑块。（9）染色液配制见附件3。3.显微镜检查（1）使用1 0X目镜双目显微镜读片。（2）取染色完毕且已干燥的玻片，痰膜向上放置在玻片台上并以卡尺固定。（3）首先使用40X物镜，转动卡尺移动玻片至痰膜左端，将光线调节至适当 亮度，调节焦距至可见细胞形态。（4）移开40X物镜，在玻片上滴12滴镜油，使用1 00X油镜进行细致观察。但应避免油镜镜头直接接触玻片上的痰膜。（5）读片时，首先应从左向右观察相邻的视野；当玻片移动至痰膜一端时，纵 向向下转换一个视野，然后从右向左观察，依此类推（图3）。通常20 mm 的痰膜，使用1 00X油镜，每横行约有100个视野。(6)在淡蓝色背景下，抗酸菌呈红色；其它细菌和细胞呈蓝色。(7)仔细观察完300个视野，一般需要5分钟以上；每个工作日，一位镜检人 员的玻片阅读量不要超过25张，且连续阅读1012张玻片后，应休息 20分钟左右。图3镜检读片移动方式4.镜检结果报告(1)结果分级报告标准:抗酸杆菌阴性：连续观察300个不同视野，未发现抗酸杆菌。抗酸杆菌阳性 抗酸杆菌菌数：18条/300视野。抗酸杆菌阳性(1+)：39条/100视野，连续观察300个视野;抗酸杆菌阳性(2+)：19条/10视野，连续观察100个视野;抗酸杆菌阳性(3+)：19条/I视野;抗酸杆菌阳性(4+)：210条/I视野。(2)报告1+时至少观察300个视野，报告2+至少观察100个视野，3+、4+时至 少观察50个视野。5.分枝杆菌的分类、萋尼氏染色原理及显微镜下形态结核菌的生物分类学名称为结核分枝杆菌，按照分类学单位门、纲、目、科、属、种的分类单位，结核菌属于厚壁菌门、裂殖菌纲、放线菌目、分枝 杆菌科、分枝杆菌属。通过对细菌所属的种、属进行的分类学定义为结核分枝杆菌。结核分枝杆菌、牛分枝杆菌、非洲分枝杆菌、田鼠分枝杆菌的生物学性状、对大多数抗结核药物的自然耐受性相近，故将这四种菌统称为结核分枝杆菌复合 群(M.tuberculosis complex,MTC)。临床上结核病的病原菌多为结核分枝杆菌、其次为牛分枝杆菌。除去这四种以外的其它分枝杆菌，生物学性状、对抗结核药 物的自然耐受性与结核分枝杆菌复合群相差很大，统称这些菌为非结核分枝杆菌 owtuberculosis mycobacterium,NTM）,大多数存在于自然环境中,属于条 件致病菌。分枝杆菌属的细菌由于细胞结构和细胞成分的特殊性，具有经碱性染料染 色后，能够耐受酸性介质脱色的特征，具备相应染色特征的细菌习惯上被称为抗 酸菌（acid-fast bacillus,AFB）。目前，除结核分枝杆菌以外（临床上最常见的 分枝杆菌），发现的分枝杆菌种类已达100余种。当然，除分枝杆菌属的细菌以 外，还有少数细菌具有抗酸染色特征，但抗酸性较弱。萋尼氏（Z-N）染色法基本原理是：抗酸菌具有耐受酸性介质脱色的生物性 状。此类细菌在石炭酸（苯酚）的协同作用下，被复红染色剂着色，能够耐受酸 性酒精脱色，显微镜观察时保持红色；而其它脱落细胞或标本中的非抗酸菌被酸 性酒精脱色后，可被复染剂亚甲兰染为蓝色。AFB抗酸染色特性还与菌体细胞结 构的完整性有着密切联系。当患者标本直接进行涂片镜检时，能够发现分枝杆菌形态变化较多。结核 分枝杆菌多数为杆状、稍弯曲；菌体宽度0.30.6 um；菌体长度不一，在0.5 8um之间，多数在1.53.5um；少数菌体较长者可呈螺旋状；染色良好的结核分 枝杆菌菌体内，能够发现着色较深的异染颗粒。含结核分枝杆菌较多的新鲜标本 经萋尼氏染色，1 00X油镜观察，既能发现单个存在的细菌、也能看到聚集成簇 或分枝状排列的细菌。（二）荧光染色显微镜检查法1.涂片制备：同萋一尼染色显微镜检查法。2.染色（1）玻片经火焰固定后，滴加染色剂盖满玻片，染色30分钟；流水自玻片一 端轻缓冲洗，洗去染色液，沥去玻片上剩余的水。（2）痰膜上端外缘滴加脱色剂，垂懑玻片，脱色3分钟或至无色，流水自玻片 一端轻洗，洗去脱色剂。（3）加复染剂复染1分钟，沥去复染液，流水自玻片一端轻洗，自然干燥后镜检。(4)染色液配制方法详见附件3。3.显微镜检查玻片放置在玻片台上并以卡尺固定后，首先以1 0X目镜、20X物镜进行镜检,发现疑为AFB的荧光杆状物质，使用40X物镜确认。在暗背景下，抗酸菌发出黄 色荧光，呈杆状略弯曲。4.荧光染色镜检结果分级报告标准：(1)结果分级报告标准：荧光染色抗酸杆菌阴性 H：。条/50视野；荧光染色抗酸杆菌阳性(报告抗酸菌数)：19条/50视野；荧光染色抗酸杆菌阳性(1+)：1049条/50视野；荧光染色抗酸杆菌阳性(2+)：19条抗酸菌/I视野；荧光染色抗酸杆菌阳性(3+)：1 0-99条抗酸菌/I视野；荧光染色抗酸杆菌阳性(4+)：100条及以上抗酸菌/I视野。(2)、报告2+至少观察50个视野，3+及以上的阳性结果至少观察20个视野。(三)玻片的保存萋尼氏染色玻片阅读完毕后，应及时用擦镜纸轻轻在涂片上揭取数次，彻底 去除玻片上的镜油。经脱油、干燥后的玻片，按实验室序号及涂片编号放置在玻 片盒中，存放在阴凉干燥的环境中避光保存，以备复检或质控抽检。荧光染色的玻片，玻片盒中放置干燥剂后密封放置在4冰箱避光保存。荧光染色的涂片进行盲法复检复核时，应首先将复检涂片脱色后进行萋尼氏 染色后，重新阅读。四、抗酸菌痰检注意事项(-)涂片染色镜检制备注意事项1.一张载玻片上只能涂抹一份痰标本。2.每张载玻片只能使用一次，不得清洗后再次用于AFB涂片检查。3.涂抹后的痰膜不能太厚或者太薄，透过痰膜看报纸上的5号字时，字迹较模糊为适宜的厚度；看不见5号字或很清晰，则表明该玻片涂抹过厚或过薄。4.由于香柏油（cedarwood oil）能够溶解复红染料，使萋尼氏染色褪色，并且容易干燥凝结，对油镜头造成损害；故禁止使用香柏油，必需使用显微镜专 用的镜油（英文名：Immersion oil,for microscopy）o镜油折射系数（RI）应大于1.5,20黏度系数应在1 00T20mPas之间。5.采用荧光染色法镜检AFB,只限于那些工作量较大（每人日读片数超过25张）、具备荧光显微镜、且镜检人员接受过荧光染色镜检培训的实验室开展。6.采用荧光染色时，荧光随着时间而衰减。故荧光染色后的涂片应于当日镜检;如果玻片数量过多，应将涂片放置于4避光保存，次日必须完成镜检。（二）AFB痰检假阳性结果的预防措施1.必须使用新玻片进行涂片检查。2.每个标本均使用一个新竹签完成制片涂抹。3.所有染液均经过滤。4.染色时玻片彼此保持一定距离，相互彻底分隔开。5.严禁使用染色缸染色。6.染色时勿使玻片上的染液干燥。7.滴加染色液或镜油时，避免容器滴口直接接触痰膜。8.严禁物镜镜头直接接触痰膜。9.作为对照，可采用已知结果为阴性的玻片完成染色镜检过程。1 0.完整、准确的标注痰盒、玻片和登记实验登记本。1 1.登记前、后对检验单和标本盒上的标注进行仔细核对。1 2.准确记录和报告结果。（三）AFB痰检假阴性结果的预防措施1、确认标本是痰而非唾液。2、确认每份标本至少有3ml。3、选择脓样、干酪样、粘液分泌物涂抹制备玻片。4、制备玻片时标本涂抹均匀，不要太厚或太薄。5、使用高质量染料、严格按照配方配制染液。6、严格按照操作程序完成染色过程。7、判断结果为“阴性”前，必须阅读规定要求的视野数。8、作为对照，可采用已知结果为阳性的玻片，完成染色镜检过程。9、完整、准确的标注痰盒、玻片和实验登记本。10、登记前对检验单和标本盒上的标注进行仔细核对。11、准确记录和报告结果。第五节显微镜的使用、维护和保养显微镜作为结核病防治工作中的重要设备，实验室工作人员应正确使用并给 予日常维护，以保证其正常工作和延长使用寿命。在使用和维护显微镜时应特别 遵守下列要点：一、一般原则（一）显微镜是精密仪器，所以应注意1、小心操作，避免任何撞击。2、移动显微镜使用双手，一手托于显微镜底部，一手握显微镜臂。3、不要自行拆开显微镜。4、不要将可拆卸的目镜或其他光学部件摔落。5、避免振动、过热、日光直射、潮湿以及灰尘。（二）如有灰尘或有溅出的镜油弄脏显微镜，应立即清理1、清洁显微镜表面：用柔软的纱布沾少量中性清洁剂清洁。2、清洁目镜内部的镜头或聚光器：用镜头纸或柔软的干布擦拭。（这些镜 头经常是用光学塑料做成，溶剂可能会使镜头变得模糊）。3、清洁物镜：使用镜头纸或柔软的干布清洁（使用溶剂可能会使粘附镜片 的胶溶解）。4、只有当清洁诸如目镜外部镜头等玻璃部件时，可以用柔软的纱布沾取少 量溶剂（乙醛与乙醇的混合物，体积比为8：2或7：3）擦拭。必须注 意：目前光学塑料被用于越来越多的部件中，所以在显微镜的清洁中不 使用溶剂是最安全的。5、应该特别注意灰尘，可以用橡皮吸球轻轻吹掉，也可以使用柔软的刷子 清洁。（三）在潮热地区，可能会生长霉菌，破坏显微镜的光学部件。为了避免霉菌生 长，可以将显微镜罩好，再将其放在用1 2个40瓦灯泡加热的柜橱内或放置在空 气流通处。在这样的地区，显微镜不能放在木箱中过夜。近来某些品牌的显微镜 附带抗真菌装置，安装在显微镜的内部。（四）为避免划痕或留下纤维，只能使用镜头纸或软布清洁光学部分，而不能使 用普通纸巾或棉花。（五）显微镜只能由接受过专门培训的技术人员拆卸。不能常规地打开显微镜进 行清洁，除去目镜清洁镜头足以使灰尘和真菌的泡子穿透并附着在棱镜上。同样 地，如果移去物镜头进行修理或更换，应该用显微镜厂家提供的塑料塞封住物镜 转换器上的孔洞。二、日常维护1、安稳水平放置显微镜。2、除去表面的灰尘。3、检查显微镜上的灰尘和油渍，如果需要，按上述方法清洁。4、检查物镜是否擦拭（有的人可能会将显微镜的物镜浸到镜油）。5、使用后应关闭显微镜电源（适用于电光源的显微镜）。6、待显微镜灯泡及其周围部分充分冷却后拔除电源线。7、盖好显微镜并存放好。三、维修和保养如上所述，只有经过专门培训的技术人员才可以进行显微镜的维修和超出上 述范围以外的保养。未经专门培训的人员所能进行的唯一“维修”操作是更换破 损的灯泡：1、更换灯泡前，关闭显微镜电源，待显微镜灯泡及其周围部分充分冷却后拔除 电源线。2、如果必须倒转显微镜以触到灯泡部分，应先拔下目镜头，否则目镜可能掉落。3、确认你选择了正确的灯泡：查看显微镜说明书中的详细说明。4、正确更换新灯泡：现在许多显微镜装有卤素灯泡（很小但是功率很强）。这 些卤素灯泡会变得很热，因此一定不要用手触摸，因为在灯泡的工作温度下，即 使很少的油脂也会和玻璃起反应，并使灯泡破损。所以，当更换卤素灯泡时，要使其一直在塑料袋中进行操作，当灯泡安装到位后才能除去塑料袋。如果 这样的灯泡被手指接触，或经其他途径被弄脏，应使用纱布浸少许酒精擦拭，并 在干燥后安装。5、打开灯泡小室的盖子。6、安装新灯泡（如果是卤素灯泡可将灯泡插脚插入针孔，或者将其他灯泡旋转 入位）。7、关闭灯泡小室的盖子。8、插上显微镜电源试用。第六节试剂和材料为保障痰涂片镜检工作的连续性，各实验室应根据实际工作负荷储存一定 数量的实验耗材和相应试剂，储备量一般应比平均工作量高20%作为缓冲。每 检查1000份标本所试剂消耗和应该储备的耗材和试剂见表1：表1实验室准备耗材（每检查1000份标本）材料、试剂名称实际用量需要储备量备注痰盒1000 个1 200 个竹签1000 个1 200 个载玻片1000 张1200 张镜油100 ml120 ml复红染色液3000 ml3600 ml每张玻片需染 色液、复染液各 约3ml,需脱色 液约6 ml；亚甲兰复染液3000 ml3600 ml浓盐酸。300 ml36 0 ml95%酒精Q5700 ml7000 ml石碳酸1 35 g1 6 2 g金胺0染色液（如使用荧光染色）3000 ml36 00 ml高镒酸钾复染液（如使用荧光染色）3000 ml36 00 ml定性滤纸6张擦镜纸2本玻片盒(100张/盒)_。盐酸、酒精的消耗量根据脱色情况调整。10个第三章痰涂片显微镜检查质量保证实施质量保证工作对于持续提高结核病实验室痰涂片检查的工作效率和可 靠性非常重要。质量保证(Quality Assurance,QA)包括三个方面：室内质量控 ftlj(Quality Control,QC)、室间质量评估(External Quality Assessment,EQA)、质量提高(Quality Improvement,QI)。按照国家结核病防治规划的要求以及WHO的建议，在实验室内部质量控制的 基础上，应用实验室间质量检查和评估的方法，进行实验室检查系统的评价，并 通过采取一系列措施不断改进和提高实验室服务的总体水平。必须依靠全国结核 病实验室质量保证系统网络。现将我国结核病实验室网络及职能、质量保证工作 介绍如下。第一节实验室网络及职能实验室质量保证依赖于完整的实验室网络以及网络中各级实验室是否能够 有效地发挥各自职能。一、结核病实验室网络图4结核病实验室网络二、质量保证体系中各级实验室职能（一）国家结核病参比实验室1、根据国家结核病防制规划的要求，组织全国结核病实验室的工作，制定和推 行结核病细菌学实验技术标准化准操作规程及规章制度。2、建立可行的全国结核病实验室质量控制标准和质量保证系统，并负责组织、实施。3、指导、协调、检查各省（市、自治区）结核病实验室工作，为全国各级结核 病实验室服务提供技术支持。4、对结核病实验室的设施、设备、耗材的技术指标及质量进行评价。5、参与跨国参比实验室的质量评估。（二）省（市、自治区）级结核病参比实验室1、按照国家和省结核病防制规划的要求，在国家参比实验室的统一部署下，规 划本省结核病实验室工作，制定实施措施，协调、指导省内各级结核病实验室工 作并提供技术支持。2、根据国家结核病实验室质量保证体系的要求，组织全省各级实验室痰涂片镜 检的质量保证工作，按要求对所辖的地市、县级实验室进行督导和评估，指导地 市级实验室对各县级实验室的盲法复检和现场评估。3、对本省结核病实验室所用耗材、试剂的质量进行评估和核准。建议省级参比 室为全省统一提供抗酸染色试剂，为省内开展分离培养的实验室统一提供培养 基。4、负责组织、实施本省结核病实验室质量保证相关的培训工作。5、接受国家参比实验室的质量评估，按有关规定上报各类表格。（三）地（市）级结核病实验室1、在省级参比实验室的指导下，制定本地（市）结核病实验室工作计划。2、根据国家结核病实验室质量保证体系的要求，组织实施本地市痰涂片镜检的 盲法复检和现场评估，并按要求向省参比实验室报告结果。3、对县级实验室以及乡镇卫生院查痰点提供技术支持。在省级参比室难以统一 提供抗酸染色试剂时，协助省级为辖区内的痰涂片检查实验室提供抗酸染色液。4、培训所辖县（市）结核病实验室技术人员，监督辖区内检验人员培训后上岗 制度。5、接受省级参比室的质量控制、技术培训和现场督导。（四）县级结核病实验室1、在省、地（市）参比实验室的指导下，制定本县（市）结核病实验室检查的 工作计划。2、按照国家结核病实验室质量保证体系的要求，在所属地（市）级实验室的组 织下，开展痰涂片镜检盲法复检。3、按国家统一的标准化操作程序常规开展痰涂片镜检工作，并按规定保存痰涂 片待上级实验室抽取复检。4、接受上级实验室的督导、现场评估和定期培训。5、对辖区内乡镇卫生院查痰点的工作提供技术支持。（五）乡镇卫生院查痰点1、按国家统一的标准化操作程序开展痰涂片镜检工作，并按规定送痰涂片复检。2、接受上级实验室的培训、现场督导和技术指导。第二节室内质量控制室内质量控制（Quality Control,QC）指实验室内部的操作规程、设备和 耗材、痰标本收集、染色剂制备、涂片制备和染色、显微镜维护、显微镜镜检、结果登记和报告、以及痰片保存等整个过程的内部检查和监测。一、痰标本收集1、容器：采用可密封的螺旋盖痰盒收集痰标本（参考规格：直径4厘米，高度 2厘米）。痰容器应标明病人姓名、日期、编号（初诊病人门诊序号或随访病 人登记号）和容器序号1、2、3（1为当日即时痰，2为夜间痰，3为次日即 时痰）。2、痰标本性质：干酪痰、血痰、粘液痰为合格标本；唾液或口水为不合格标本,除照常进行涂片检查外，应要求患者重新送检。3、初诊病人应收集3份痰标本（当日即时痰、夜间痰和次日晨痰），治疗中或复诊随访病人按期每次收集2份痰标本（即时痰、当日或次日晨痰）。4、对当日不能进行涂片检查的痰标本，须置于4冰箱保存，注意防止痰液干 涸或污染。二、抗酸染色液制备1、配制染色液的实验室必须按标准浓度和步骤配制染色液（见附件3）,实验室 要有染色液制备配方和配制纪录。2、染色液试剂瓶须标明染色液名称、浓度和制备时间。3、染色液置于棕色瓶内或者不透明塑料瓶内存放，避光保存。4、为监测染色液的质量，每次制备一批新的染色液之后，需使用未经染色的上 知阳性和阴性涂片进行染色、镜检，并记录结果。三、涂片制备1、新载玻片应经95%乙醇脱脂，检查无划痕后方可使用。2、一张载玻片只能涂抹1份痰标本，且只能一次性使用，严禁清洗后重复使用。3、推荐使用一端有磨砂面的玻片。4、2B铅笔在磨砂面上注明实验序号及标本序号，若使用无磨砂面的玻片，则必 须使用玻璃刻刀在玻片一端的1/3处进行标注。5、大约0.05ml痰标本，在玻片正面右侧2/3的中央处均匀涂抹面积为1 0X20 mm 的卵圆形痰膜。6、将已干燥的玻片放置在报纸上，如果透过痰膜不能分辨报纸上的5号字，则 表明该玻片涂抹过厚。四、染色1、肉眼观察染色后的痰膜应呈均匀亮蓝色，无红色斑块。2、染色后的痰膜脱落部分应小于整个涂抹面积的10%0五、镜检1、为防止抗酸杆菌的交叉污染，严禁油镜头直接接触涂片上的痰膜。2、按照结果报告标准仔细观察足够的视野数。3、每个工作日，一名镜检人员的涂片阅读量不应超过25张。4、连续阅读1012张涂片后，应休息20分钟左右。5、采用自查和互查方式，至少抽查复检当日10%涂片，并填写室内质控登记 表（表2）。表2 痰涂片镜检室内质量控制记录表单位名称：年 月日期镜检涂片数初检者 签名抽查复检 涂片数痰涂片 符合数复检者 签名合计阴性阳性合计六、登记报告1、登记前应反复核对检验单、标本盒、涂片上的标注。2、检查后的每一张涂片结果，应按规定准确记录在“结核病细菌学实验室登 记本”上。3、镜检结果报告应及时发出，以便尽早为临床提供诊断依据。七、痰涂片保存1、镜检后应及时用擦镜纸轻轻在涂片上揭取数次，彻底去除玻片上的镜油。2、涂片脱去镜油后，必须再次核对实验室登记本与每张涂片实验序号是否一 致。3、涂片上禁止标记镜检的阴、阳性结果。4、全部涂片按实验室登记本序号连续排列，存放于玻片盒内。5、涂片保存与实验室登记本记录应一致。初诊病人第一张涂片存入涂片盒后 需预留出2个空位置，以备第二张、三张涂片检查后放入；随访病人第一张涂片 存入涂片盒后需预留出1个空位置，以备第二张涂片检查后放入。6、对涂片保存量的要求：（1）根据结核病实验室登记本记录，按照弃旧存新的原则，保存近期3个月 的全部痰涂片待复检。（2）、年涂片量不足500张的实验室，必须保存全年的涂片待复检。（3）、如果近3个月的涂片数超过1000张，可以按照弃旧存新的原则，保存 近期1000张的涂片待抽查复检。7、装满涂片的玻片盒，需用标签注明涂片实验序号区间和日期区间，以便日 后盲法复检或现场评价时抽样。第三节室间质量评估室间质量评估（EQA）是通过进行批量测试、盲法复检并与网络中的其他实 验室（上级或同级实验室）比对结果，对实验室的能力进行评价的过程。EQA 包括实验室现场评价（On site Evaluation）盲法复检（Blind Rechecking）以及 批量测试（Panel Testing）0一、现场评价（一）目的通过现场评价发现问题，提出正确的建议解决问题，提高痰涂片镜检质量。（二）频度1、国家参比室不定期对省级参比室进行现场评价，同时抽查市及县级结核 病实验室。2、省级参比室每年对所辖地（市）级实验室至少进行1次现场评价，同时 每地（市）抽查12个县级实验室；对批量测试或盲法复检存在问题的市、县实 验室，应适当增加现场评价频率。3、地（市）级实验室每年对所辖区（县）实验室每年至少进行2次现场评价。4、对批量测试或盲法复检存在问题的县级实验室必须尽快进行针对性的现 场督导，以查找原因，提高涂片镜检质量。（三）注意事项1、现场评价的优点是能直接观察实验室实际工作，能核实并验证设备和耗 材，因此有利于发现问题、查找出现错误的原因。更重要的是与有关领导进行直 接沟通，以促进实验室工作。2、现场评价的缺点是工作时间短，工作强度大，而且花费高，因此必须保 证现场评价高效实行。这就要求现场评价员（督导员）应由经验丰富的实验室技 术人员担任，必须经过高一级实验室的培训。3、现场评价要按本手册所附督导清单（附件4）进行。如果省、市对县级 督导，人员及硬件设施没有变动，不需要每次都填写。4、现场评价反馈报告的参考模式见附件5。5、上级实验室对下级进行督导的时候，应核对以前的督导报告和被评估实 验室实际情况，因此各级督导报告应保存至少二年。二、盲法复检（一）原则1、抽样要保证随机：从各个实验室抽取的用于盲法复检的涂片必须按本手 册的要求随机抽出，即能代表整个实验室的操作水平。2、复检要保证盲法：盲法复检的整个过程必须保证第一复检者不知道初检 结果，以确保复检结果的客观、真实。3、最终复检结果由盲法复检组织者确定。选择同级实验室交叉复检模式的 地区，若第一复检者盲法复检结果与初检结果不一致，由上级实验室进行第二次 复检后最终确定。选择地市级（或省级）直接复检的地区，由该地市（或省级）另一名镜检人员查验第一复检结果与初检结果，如果出现不符，对不符合的涂片 进行第二次复检，以确定最终复检结果。4、由盲法复检的组织单位抽取涂片。为保证盲法，应由非实验室人员（项目管理人员、临床医生或统计人员等）或实验室中不进行第一复检的人抽片。5、盲法复检组织者必须及时将复检结果以书面形式反馈给接受检查的实验 室，必须保证受检查实验室留存有反馈报告或复印件，受检查实验室的实验员能 看到反馈报告，以便其了解出现的错误，查找原因并改正。6、盲法复检组织者按本手册要求及时将盲法复检结果分析汇总，并按期上 报。（二）盲法复检的实施模式1、对地（市）实验室的盲法复检：由省级参比实验室负责组织实施。可以 根据本省实际情况组织不同地市实验室之间交叉互检（第一复检），再由省级参 比实验室进行第二复检；也可由省级参比室对所有地市实验室抽取的涂片统一进 行盲法复检。2、对县（区）级实验室的盲法复检：由地市实验室负责组织实施。可以根 据本地区实际情况组织不同县区实验室之间交叉互检（第一复检），再由地市实 验室进行第二复检；也可由地市实验室对所有县区实验室抽取的涂片统一进行盲 法复检。第一种模式适用于地域面积大、所辖县区数目较多、地市实验室承担对 所有县区实验室的盲法复检难度较大的地区；而后者适用于地域面积较小、所辖 的县区数目较少、地市能够承担对所有县区实验室盲法复检任务的地区。某一地 市选择哪种盲法复检的模式，需由本地区实验室根据具体情况提出意见，并由省 参比实验室批准。（三）盲法复检中各级实验室职责总体来说，盲法复检时由上一级实验室负责对所辖下一级各个实验室盲法复 检的组织实施、现场盲法抽片，根据当地具体情况安排第一复检者和第二次复检、负责结果的汇总、分析、报告和反馈，以及根据盲法复检中出现的问题及时进行 有针对性的的现场督导，帮助查找错误原因并督促改正。详见表3。表3、盲法复检中各级实验室职责对地市实验室的盲法复检对县级实验室的盲法复检同级交叉省级复检同级交叉地市复检组织实施、现场抽片省级省级地市级地市级第一复检地市级省级县级地市级第二复检、反馈、及督促整改省级省级地市级地市级（四）盲法复检频度：1、省参比室对地（市）级实验室进行的盲法复检，每半年进行1次。2、地（市）级实验室对县级实验室进行的盲法复检，每季度进行1次；对 于因地域、交通等原因不能每季度进行1次盲法复检的实验室，可在省参比实验 室核准后适当减少盲法复检次数，但一年不得少于2次，并应相应增加每次抽取 复验的涂片数，以保证年内抽验涂片总数不变（详见以下内容）。（五）抽取涂片的样本量1、样本量估算：盲法复检的关键是复检结果能否代表被评估实验室的实际 水平。WHO推荐80%灵敏度、100%特异性（针对阴性涂片）、误差为0的可接 受数量以及95%可信限样本量表,可保证盲法复检在统计学意义上可以代表被评 估实验室的总体水平。表4为按上述统计参数计算的本年应抽取的涂片样本量计 算表。表4 样本量计算表上一年阴性 涂片的总数涂片阳性率5.0%7.5%1 0.0%1 3.0%15.0%18.0%300129101806759504001431088670615150015411489716252700167121927565541000180128967666552000197135100796856500020814