疟原虫显微镜镜检技术.pdf

显微镜检查 疟原虫疟疾简介疟疾是一种古老的传染病,俗 称“冷热病”、“打摆子”、“发疟子”、“脾寒”、“瘴气”等，是由疟原虫寄 生于人体引起的传染性寄生 虫扃。寄生人体的8种疟原虫间日疟原虫Plasmodium vivax,P.v三日疟原虫P.Malariae,P.ni恶性疟原虫T7.Falciparum,P.f卵形疟原虫P.Ovale,P.o我国主要是间日疟常见，恶性疟次之，三日疟偶尔发现，卵形疟已无病例报告。镜检疟原虫方法简述19世纪后期，显微镜的出现使 人们不断发现了传染病的病因。1880年法国军医拉韦朗第一次 见到并描述了人红细胞内的疟 原虫，至此才解开了困扰人们 数千年的疟疾的病因之谜。目前用于疟疾诊断的实验室检测包括 病原学检查、免疫学检测和分子生物 学检测三类。镜检疟原虫由于具有操 作简便、敏感、价廉和可鉴别虫种等 优点，广泛用于疟疾的病原学诊断已 愈近一个世纪，仍是目前最常用的方 法，也是我国疟疾诊断标准确定的实 验室检查方法(WS259-2006)。镜检目的与意义疟疾诊断标准中把疟疾病例分为疑似病例、临床病例、确诊病例和带虫者，前两者依 据流行病学史和临床表现即可做出诊断，而后两者需通过发现病原体方能做出诊断。通过对发热病人血检达到确诊疟疾病例。及时发现传染源和明确感染的疟原虫种类,以能针对虫种选择正确的治疗方案。血片镜检血片制作用于检查疟原虫的血涂片有两种：一种是将血液涂呈薄膜状，称薄血膜。一种是血液涂成圆盘，称厚血膜。薄血膜上的血细胞要求平辅在玻片上 面。血膜的制作（取血时间）取血时机现症病人一般可随时取血,疟疾普 春时可不考虑取血时机。在诊断或需要禁期疟原虫作标本时,则应掌握 适宜的取血时机。间国疟在塞热发作时,外周 血液中主要可见环状体期；麦作后数小时,环 状体发育到滋杀体期,疟色素形成，形忐较易 辩认,另诊断的有利时机；3648小时,可检 出裂琏体；发作一，二次后,配子体出现较多。恶性疟较理想的取血时间是在发棒后至20小时 内取血,初发患去退热后常看不到原虫。血膜的制作（取血操作）取血方法 采血部住一般人为耳垂，指头,通常在耳垂取血（现场取血建议用大头针 采血，一人一针，避免血传疾病）O先用 75%）酒精棉球消素取血部伉（冬季用手捻 动耳垂使其充血后再行消素），待酒精干 后，用左手拇指和食指紧捏耳垂上方，右 手持靖等针迅速剌人耳垂下端12毫米,不宜过深或过浅。然后用右手中指轻轻向 挤出血 O取血量及涂片法（涂片操作）薄血膜 取洁净的载玻片2张，工张 平置在桌上，以左手拇指，食指夹 持载玻片两端（手指切勿接触玻片 表面），用另一张边缘平滑（最好 为磨口边缘）的载玻片做推片，用 推片一端边缘的中点从取血部分取 约工微升的血量（相当于1/4火柴 头大小），使血滴与平置的载玻片 接触，并形成2530度夹角，待 血液向两侧扩展约2厘米长度时，均匀而迅速地轻轻向左推出（约 2.5厘米长），整个血膜成舌形。正确的推片姿势厚血膜用推片的一角,从取血部位刮取约4微升 血量（相当于火柴头 小），使血滴与平置的 载玻片接触，再由里向 外一个方向旋转，转 24圈，涂成直径 0.81厘米大小圆形厚 血膜，血膜厚薄均匀，过厚易于脱落，过薄达 不到检出窣的要求。涂制厚、薄血膜的住置通军是将厚、薄血膜涂在 一张就片上。方法是将就 片分为6等分，第1、2格 备贴标签及编号用；厚血 膜涂在第3格中央，诲血 膜涂在第4格前缘至第6格 中部。作为标本的血片每 张玻片涂厚、薄血膜各工 个；门诊和发热病人血片 每片工人,涂2个厚血膜工 个薄血膜，以防血膜脱落 而影响检杳。标准的疟疾厚薄血膜片位置血片的染色一、吉氏染液母液配制取吉氏i扮05克置于研钵中，加少量甘油充分研磨,边加边磨,至25毫升加克为止,倒入60或100毫 升带有玻塞的有色玻瓶中。在研钵中加少量无水 甲醇,洗去甘油浓液混入瓶内,至25毫升甲醇冼 净钵中甘油染液为止，塞紫瓶塞,充分摇匀，置 于5560水浴中2小时,或室温内35天,每 天用力摇动5分钟,即成原液。吉氏！染液是目前较 优前的血膜染剂,即使在炎热天与中,亦可经久 不变。二、瑞式染液的配制将瑞氏染剂粉1g置于研钵内，加入15ml甘油充 分研磨后，倒入有塞玻璃瓶中，再用500ml甲醇 洗出研钵中的甘油溶液，倒入瓶中，摇匀后，置 室温下，每天摇动5分钟，3天后即可使用。此方法染色的时间短，但染色效果不如吉氏染液 效果稳定，又不能大量血片染色，可用于门诊应 急向巧用。吉 氏染液血片染色方法（推荐使用 此方法）先用甲醇或无水酒精固定诲血膜，待干后进行染色。在 固定摩血膜后用清水对厚血膜漆脱血红蛋白可用满管靖 水于厚血膜上，番血膜呈灰白色时，将水倾去，晾干后 进行染色。成批血片染色：将已固定薄血膜的血片插入染色缸，倒 人2%）吉处染液稀羚液（2毫升原液加中性蒸锵水98毫 升稀将均匀即成J,同时对厚薄血膜染色30分钟（如染 液不合标准时，得酌情增城染色时间），然后用清水轻 轻将染液冲去，再用请人轻轻冲洗一次，干净后将血片 标木（血膜面朝下）插于晾干板上，待干铳检。单张血片染色：薄血膜经固定干燥后，用 2%吉氏染液稀释液广2毫升，滴入血片标本 上染色30分钟左右；或用中性蒸储水1毫升,加吉氏母液2滴，混合均匀后滴入血片标 本上，染色1020分钟，然后用清水轻轻将 片上的染液冲洗干净，（切勿先倒掉染液 再用水冲洗）晾干镜检。瑞氏染液的染色方法:先用蜡笔在厚、薄血膜间划一界限，滴几 滴蒸储水在厚血膜上溶血。溶血后倾去水 滴。在薄血膜上加瑞氏染液58滴，染色 12分钟。然后再加58滴蒸镭水于薄血 膜上，用吸管将染液与蒸储水混合均匀后,把染液引到厚血膜上，使厚血膜再染色10 分钟。用清水轻轻冲去染液，晾干。血片的镜检在学习镜检疟原虫之前，必须先对正常厚薄血膜 中各种血细胞的 形态、内部结构和 染色性质加 以 识另U。学习 镜检疟原虫，首先要学看薄血膜，在基本上 掌握薄血膜中疟原虫形态后，才学习镜检厚血膜。镜检疟原虫一般只查厚血膜，薄血膜仅作为原虫 分类时参考和血片编号之用。镜检疟原虫必须用油镜头配合5X低倍 目 镜镜检，当 发现疑难问题时可调换工0X目 镜进行观察。检查时应从厚血膜的上缘开始，使血膜从上而下,自左至右，由右至左，一行接一行，一个视野稍 叠一个视野顺序地查完整个血膜。疟原虫血片检查结果确定检查全部厚血膜未查见疟原虫者判为 阴性。显微镜下查见疟原虫，根据疟原虫形 态确定恶性疟、间日疟、三日疟、卵 形疟或混合感染。疟原史形态持证和整列要点在RBC内发现疟原虫是确诊疟疾和鉴别虫种 的重要依据疟原虫基本构造相同一细胞膜、质、核.瑞氏或姬氏染色：核染成紫红色，胞质呈 兰色，疟原虫消化血红蛋白产物-疟色素呈 棕黄色疟原虫在RBC内各期形态各不相同疟原虫在RBC内的形态（三期六种形态）滋养体期：大、小滋养体裂殖体期：成熟、未成熟裂殖体 配子体期：雌、雄配子体人体疟原虫的基本结构疟原虫基本构造为细胞质（胞浆）、核和 疟色素。.1.细胞浆-被染成蔚蓝色或深蓝色，随着虫体发育长 大，细胞浆逐渐增多。间日疟原虫发育到 大滋养体阶段，胞浆呈阿米巴样活动，胞 浆内有空泡。2.核即细胞核或染色质粒。在正常情况下核呈鲜红 色，呈圆形或不规则的颗粒状。核的结构致密，只 有在个别发育阶段较为疏松，例如间日疟原虫雄配 子体的核。有时因胞浆厚密或染色深蓝，使核呈暗 红或紫红色。3.不着苞，颜色和颗粒的形状，因疟原虫种类而 异。间日疟原虫的色素颗粒呈短棒状，黄褐色；恶 性疟原虫的色素颗粒呈细砂状，黑褐色；三日疟原 虫的色素呈砂粒状，深褐色；卵形疟原虫的色素与 间日疟原虫相似。疟色素在虫体内散在分布或聚集 成团块。4.被寄生的红细胞被间日疟原虫寄生的红细胞胀大、颜色变淡。疟原虫发育至阿米巴样体，红细胞出现薛氏 点。:获恶性疟原虫寄生的红细胞大小正常或稍微 缩小，红细胞上有时见到茂氏点。被三日疟原虫寄生的红细胞大小正常，红细 胞上可见到齐氏点。被卵形疟原虫善工的红细胞稍胀大或不胀大,呈卵形或一端呈伞矢状，薛氏点出现较早，于环状体阶段便可查见。u彩印海可日空婷生窄20.2疹彩田4海血片三日疟座虫窄W彩田将血片垂形疟原虫形W号血片间日症原虫形态承片干恶触症感虫疟原虫薄血膜形态鉴别（吉氏染色）间日疟小滋养体一环状体较大，约占寄生红细胞的1/3,胞浆较薄，一个核,很少见到一个红细胞寄生2个环状体和一个环状体有2 个核。间日疟滋养体-大滋养体经810小时，虫体增大，胞质增多，伸出伪足，阿米巴样,常含空泡。出现黄褐色的疟色素，细小、杆状，散在分布。红细胞胀大，变形，颜色变淡，并出现数量较多，淡红色的 小点，球薛氏小点间日疟-裂殖体未成熟裂殖体经40小时晚期滋养体 发育成熟，虫体变圆,空泡消失，核分成2 个以上。核开始分裂又称裂殖 体前期色素聚集成团块A间日疟成熟裂殖体 成熟裂殖子约有12-24个，通常16个，排 列不规则。受染RBC胀大、颜色 苍白、虫体几乎充满 红细胞疟色素集中成堆，常 聚集一侧。裂殖体配子体疟原虫经过几次红细胞内裂体增殖，部分 裂殖子在红细胞内不再进行裂体增殖，而 发育为雌性配子体或雄性配子体，间日疟 原虫配子体呈圆形或椭圆形，疟色素均匀 分布于虫体内，核1个。间日疟原虫雄配子体 虫体较小，圆形，占满胀大的红 细胞胞质浅蓝核大疏松，淡红色，多位于虫体 的中央o疟色素黄褐色，均匀散在间日疟原虫雌配子体虫体较大，占满胀大的红细胞胞质致密，色深蓝核小致密，深红色，多位于虫 体一侧疟色素黄褐色，均匀散在恶性疟原虫一环状体环纤细，约为RBC直径的1/6,RBC不胀大，颜色 稍紫或正常核1个或2个，红细胞常含2个以上原虫虫体常位于红细胞的边缘，呈“鸟飞状”不带色素恶性疟原虫一大滋养体一般不出现在外周血 虫体小结实，圆形，空泡不显著，不活动 疟色素集中一团，黑 褐色原虫此时开始集中在 内脏毛细血管恶性疟成熟裂殖体裂殖子8 26个，通常818个，排列不规则 疟色素集中成一团，黑 褐色虫体占红细胞体积的2/3 至3/4恶性疟原虫雌配子体新月形，两端较尖核1个，较小，致密,深红色，常位于中 央胞浆深蓝色疟色素黑褐色，紧 密分布于核周围恶性疟原虫雄配子体腊肠形，两端钝圆胞浆浅蓝或谈红色核1个，较大，疏松，淡红色，位于中央疟色素黑褐色，小杆状,在核周围松散分布恶性疟原虫由于在发作间歇期，绝大部分疟原 虫要进入内脏毛细血管发育，周围血液内仅能 发现环状体和配子体。因此，恶性疟在发作期 为最适宜的查血时间。如在血膜上查见许多这样的小滋养体而无大滋 养体，可判定为恶性疟原虫。恶性疟原虫粗大 环状体与间日疟原虫的环状体相似，较难区别。此时应依据血膜上有无其他发育阶段的疟原虫 来确定。如果血膜上只有少数环状体，其形态又不太典 型，则应另外取血检查，不应轻易下结论。三日疟原虫主要形态特征1.寄生的红细胞正常或缩小，有淡红色细小的齐氏,占八、2,环状体中等大小，核较大，胞浆粗厚；3.滋养体胞浆常呈带状，核呈条状，疟色素深褐色,粗大常沿边缘分布；4,裂殖体小于正常红细胞，核612个，常排列成 菊花状，疟色素常聚集于中央；5.雌雄配子体小于正常红细胞，色素呈深褐色；6,常可查见各阶段的疟原虫。卵形疟原虫的主要形态特征1.寄生的红细胞正常或稍胀大，可呈卵圆形或边 缘呈锯齿（伞矢）状，薛氏点出现较早粗大，量多;2.环状体中等大小，核较大，胞浆粗厚；3.滋养体胞浆常呈圆形，空泡不明显，疟色素棕 黄色，粗大常沿边缘分布；4.裂殖体小于正常红细胞，核612个，常排列不 规则，疟色素常散在。5.雌雄配子体小于正常红细胞，色素呈深褐色；6.常可查见各阶段的疟原虫。虫种周围血 中发育 阶段薄血膜4种疟原虫形态红细胞形态疟原虫形态大小点彩胞浆疟色素恶性疟 原虫环状体 配子体常 正见氏 常茂点环状体纤细,常见2个核己月 酉明，匚 里八创 粗子显裂殖子 数16-32间日疟 原虫各养裂和体期流殖体 配子卵形疟 原虫各期滋养 体裂殖体和 配子体涨大，可 达正常 的 1.5-2倍涨大，可 达正常 的 1.25-L5倍氏可现 氏可现 薛点出 薛点出阿米巴样滋 金棕色 养体，浅蓝 不明显 色，活泼卵圆形滋养 深棕色体，蓝色较 明显深，核较大12-244-12三日疟 原虫滋体子 期体殖配 各崇赳和体常 正氏少 齐点见圆形，蓝色 深，核紧缩,滋养体带状深粗明色 棕显6-12呈菊花 状厚血膜4种疟原虫形态间日疟原虫恶性疟原虫三日疟原虫卵形疟原虫环状体较大。核一个，较大，胞浆较厚，常呈”“，”状。.核较小，常见2个核，胞浆纤细，常呈“！”“飞鸟”“V”和“断环”状。核粗大，胞浆常缩 成圆形，拥抱于核 周常呈“鸟眼”状与三日疟相似大滋养体虫体较大，胞浆呈阿米 巴运动，形状不规则，有薛氏点在末稍血不常见，虫体 呈不规整圆形，有黑色 疟色素团块虫体常呈带状，胞 浆蓝色深，疟色素 较多虫体呈边缘锯齿状 的圆形裂殖体有1224个裂殖子有1826个裂殖子有612个裂殖子，排列呈菊花状有614个裂殖子配子体雌性核偏于一侧，致密，雄性位于中央，疏松雌性呈新月形，雄性呈 腊肠形与间日疟相似与间日疟相似疟色素黄绿色，短杆状散在呈金黄色，集成团 块呈黑褐色棕黄色，粗沙粒状黄褐色，沙粒状其他各期均能查见一般只能查见环状体和 配子体各期均能查见各期均能查见厚、薄血膜的优缺点及其适用范围薄血膜用血量约为2川，涂制成2cm宽X4cm长面积的薄 血膜。由于在制备过程中，血片通常经甲醇固定，使红细胞及其内疟原虫的形态保持完整，便于疟原 虫虫种的鉴定。惟由于用血量少，为保证检测的敏 感性，常耗时较多，似不适用于大规模调查。即使 在医院的化验室，由于要求在短时间内作出诊断，因而极有可能出现漏诊。厚血膜用血量约为43。涂制成直径1cm的厚血膜由于在制备过 程中红细胞已溶解，疟原虫在形态上仍可分辨，但胞浆 和胞核不可避免地形成一定程度的固缩。受影响较大的 有大滋养体、裂殖体的形态。在镜检厚血膜时，一般门 诊须检查2001000个油镜视野（相当于0.52.53血量），才能确保镜检的敏感性和可重复性。通常的敏感性可达 约1020个原虫/用血。-由于厚血膜与薄血膜相比血量大，须查范围小，节省时 间，阳性检出率较高。厚血膜能查出疟原虫数是薄血膜 的1525倍。所以，我们推荐疟疾诊断应以检查厚血膜 为主。在普查时均应查完整个厚血膜，未查见疟原虫则 判为阴性。混合感染的鉴别工、容易鉴别的混合感染1）同一血膜中发现间日疟各期原虫和恶性疟雌雄配 子体。2）同一血膜中发现大量纤细的恶性疟环状体，并混 有少量间日疟原负2、不易鉴别的混合感染1）间日疟各期原虫和粗环的恶性疟环状体。2）仅有间日疟和恶性疟的环状体。饕南大学寄生虫学致的/福纳图片间日疟原虫成熟裂殖体Mature schizont of Plasmodium vivax间日疟雌配子体间日疟雄配子体o