基于非靶向代谢组学分析长孢假单隔孢侵染对羊肚菌代谢的影响.pdf

江西农业学报 2023，35（09）：6065ActaAgriculturaeJiangxiDOI:10.19386/ki.jxnyxb.2023.09.010基于非靶向代谢组学分析长孢假单隔孢侵染对羊肚菌代谢的影响苏文英,纪 伟,刘晓梅,秦裕营,任立凯*（连云港市农业科学院，江苏 连云港 222006）摘 要:以羊肚菌子实体为试材，利用非靶向代谢组学、样本相关性分析、偏最小二乘法判别分析、聚类分析和KEGG富集分析等方法，研究了羊肚菌白霉病在不同侵染阶段中的代谢物差异。结果表明：不同时期羊肚菌受到侵染的代谢物存在较大差异，共鉴定出395种代谢物，大部分代谢化合物不存在显著差异，其中在M1与M2、M1与M3样本中分别检测到81和146个差异代谢物。此外，KEGG主要富集到全局地图和总览图、氨基酸代谢、辅因子和维生素代谢及核苷酸代谢等代谢途径；HMDB主要富集到有机酸及其衍生物、脂质和类脂质类、有机杂环化合物、苯甲酸酯类等代谢途径。关键词:羊肚菌；长孢假单隔孢；非靶向代谢组学；通路分析 中图分类号：S436.46+1 文献标志码：A 文章编号：1001-8581（2023）09-0060-06Effect of Pseudodiplospora longispora Infection on Morchella esculenta Metabolism Based on Non-targeted Metabonomics Analysis SUWen-ying,JIWei,LIUXiao-mei,QINYu-ying,RENLi-Kai*(LianyungangAcademyofAgriculturalSciences,Lianyungang222006,China)Abstract:ThefruitingbodyofMorchella esculentawasusedasthetestmaterial,andnon-targetedmetabolomics,samplecorrelationanalysis,leastsquaresdiscriminantanalysis,clusteranalysisandKEGGenrichmentanalysiswereusedtostudythedifferencesinmetabolitesduringdifferentinfectionstagesofPseudodiplospora longispora.TheresultsshowedthatthereweresignificantmetabolicdifferencesinthesamplesofM.esculentaatdifferentstagesofinfection.Atotalof395metaboliteswereidentified,andmostmetaboliccompoundsdidnotshowsignificantdifferences.Amongthem,81differentialmetabolitesweredetectedintheM1andM2samples.and146differentialmetabolitesinM1andM3samples.Inaddition,KEGGismainlyenrichedinmetabolicpathwayssuchasGlobalandoverviewmaps,Aminoacidmetabolism,Metabolismofcofactorsandvitamins,andnucleotidemetabolism.HMDBismainlyenrichedinorganicacidsandderivatives,lipidsandlipid-likemolecules,organoheterocycliccompounds,benzenoidsandothermetabolicpathways.Key words:Morchella esculenta;Pseudodiplospora longispora;Non-targetedmetabolomics;Pathanalysis0 引言羊肚菌（Morchella esculenta）属子囊菌亚门（As-comycota）盘菌纲（Discomycetes）盘菌目（Pezizales）羊肚菌科（Morchellaceae）羊肚菌属（Morchella）1，是一种具有特殊风味的珍稀食药两用菌。羊肚菌富含多种人体必需的氨基酸、蛋白质及不饱和脂肪酸等，营养保健价值极高，还具有抗肿瘤、抗病毒、抗疲劳、调节机体免疫功能、保肝、保肾、调血脂及器官保护等功效 2-3。近几年，随着驯化栽培技术的不断发展，羊肚菌的种植规模和产量迅速增长，白霉病危害也逐年加重4-5。羊肚菌病害种类包括细菌性病害和真菌性病害，其中真菌性病害是羊肚菌子实体时期发生最普遍的病害之一6。羊肚菌真菌性病害主要是由白霉病病原长孢假单隔孢（Pseudodiplospora longispora）侵染形成的7，羊肚菌白霉病适应性极强且传播迅速，一旦发病则极难控制，很大程度上限制了羊肚菌产业的发展。代谢组学是一种基于高通量检测和多元数据收稿日期：2023-06-08基金项目：江苏省现代农业（蔬菜）产业技术体系（JATS 2022 177）；江苏省连云港市财政专项（QNJJ2302）。作者简介：苏文英（1992），女，河南驻马店人，助理研究员，硕士，研究方向为食用菌遗传育种。*通信作者：任立凯。9 期苏文英等：基于非靶向代谢组学分析长孢假单隔孢侵染对羊肚菌代谢的影响61处理，对生物体液、细胞提取物、细胞培养液和组织等进行定性、定量分析的一门学科。近年来，代谢组学在植物病原真菌互作的植物病理学研究中发挥了重要作用。在病原菌侵染过程中，植物通过调节体内的代谢反应来防御病原菌8。Kumaraswamy等9的研究表明，植物体受到赤霉病侵染时，与植物防御病菌相关的茉莉酸、二氢甘氨酸、葡萄糖苷、鼠李糖苷的山奈以及甲氧基肉桂酸等代谢物含量明显增加。Chitarrini等10在受到霜霉病入侵的抗性葡萄代谢图谱中发现，在病菌侵染2448h内积累的代谢物主要是不饱和脂肪酸、氨基酸，以及一些酸和糖等，在病菌侵染48h内积累的是一些挥发性化合物和苯甲醛，在病菌侵染96h内积累的主要是苯丙烷类、黄酮醇和二苯乙烯类。Liu等11对水稻稻瘟病菌不同发育时间点附着胞内的代谢物质进行了研究，确定了神经酰胺是附着胞正常发育和致病所必需的代谢物质，为研发针对水稻和其他谷类病害的新型药物提供了潜在的靶标。Mahatma等12对花生与链格孢叶枯病菌互作进行了非靶向代谢组学研究，共检测出了67种代谢物，包括糖、糖醇、氨基酸、有机酸、脂肪酸、甾醇和酚类等，为开发新的生物标记奠定了基础。因此通过代谢组学技术可分析植物在病原菌侵染过程中积累代谢产物的特点、合成途径、相关基因等，可为进一步快速化学鉴定或辅助鉴定、致病机理研究提供重要的参考依据。目前，国内外学者从病害特征、基因组、转录组等角度深入研究了羊肚菌白霉病的发生13-16，然而，利用非靶向代谢组学技术分析羊肚菌在长孢假单隔孢侵染后积累代谢物的变化与差异的研究仍较少。本研究以羊肚菌子实体为试验材料，利用非靶向代谢组学技术分析羊肚菌在长孢假单隔孢不同侵染阶段的代谢产物，结合多元统计法分析了羊肚菌响应长孢假单隔孢侵染的代谢物变化情况，以期为阐明白霉病致病机理及辅助鉴定提供理论依据。1 材料与方法1.1 试验材料羊肚菌子实体由连云港市农业科学院试验基地提供，长孢假单隔孢由本课题组分离自患病羊肚菌子实体，经形态学和分子鉴定确定其分类地位17，并保存于本实验室。试验共设置3个处理，分别是M1：不处理羊肚菌子实体，菌盖部分；M2：长孢假单隔孢侵染3d的羊肚菌子实体，菌盖部分；M3：长孢假单隔孢侵染5d的羊肚菌子实体，菌盖部分。1.2 仪器和试剂QExactiveHF组合型四极杆质谱仪（ThermoFisher，德国）；VanquishUHPLC液相色谱仪（Ther-moFisher，德国）；HypesilGoldcolumn色谱柱（100mm2.1mm,1.9m）（ThermoFisher，美国）；低温离心机D3024R（Scilogex，美国）；甲醇（ThermoFisher，美国）；甲酸（ThermoFisher，美国）；乙酸铵（质谱级）（ThermoFisher，美国）。1.3 试验方法1.3.1 代谢物提取及测定 取100mg组织样本，置于1.5mL离心管中，经液氮研磨成粉末状后将其溶解于80%甲醇水溶液中；进一步利用涡旋振荡器混匀后冰浴5min，离心20min（4，离心力15000g）；吸取一定量的上清稀释至甲醇含量为53%，离心20min（4，离心力15000g），收集上清用于色谱及质谱分析，色谱及质谱条件参照龚意辉等18方法。1.3.2 数据分析 采用CD3.1数据处理软件对下机原始数据进行数据预处理，然后对数据结果进行质控。采用主成分分析（PCA）和偏最小二乘法判别分析（PLS-DA）等方法分析羊肚菌患病子实体样本中的显著差异代谢物。利用KEGG、HMDB及LIPIDMAPS等数据库将鉴定到的代谢物进行功能注释及分析。使用Z-score模型将显著差异的代谢物进行归一化处理，采用Pheatmap绘制聚类热图。2 结果与分析2.1 主成分分析（PCA）分别对M1与M2、M1与M3样本进行主成分（PCA）分析，以阐明无处理（M1）、侵染3d（M2）和侵染5d（M3）样品之间的变异度大小（图1）。PCA结果显示，在M1与M2的样本中，PC1、PC2的贡献率分别为52.91%、16.63%，M1与M2样本的分离趋势较为明显，反映出处理组和对照组之间的代谢物存在差异；在M1与M3样本中，PC1、PC2的贡献率分别为62.64%、12.21%。2.2 偏最小二乘法判别分析（PLS-DA）为进一步分析不同侵染时期各处理之间的代谢物差异，筛选各组别的差异代谢物，对样本进行偏最小二乘法判别分析（PLS-DA）。从图2a可以看出，能明显区分M1与M2两组间样本；PLS-DA得到2个主成分，PC1、PC2的贡献率分别为57.00%、江 西 农 业 学 报35 卷6210.78%，R2Y=1.00，Q2Y=0.90，模型稳定可靠，预测能力较好，没有出现过拟合现象。由图2b可知，M1分布在置信区间的左侧，M3的样品分布在置信区间的右侧，M1与M3区分效果明显；PC1、PC2的贡献率分别为68.12%、7.48%，R2Y=1.00，Q2Y=0.96，模型稳定可靠，预测能力较好，没有出现过拟合现象。ab图中数字分别表示M1、M2、M3样品的3次生物学重复。下同。图1 两组样品的 PCA 结果ab图2 PLS-DA得分图2.3 差异代谢物的筛选基于PLS-DA模型的变量重要性投影（VIP）1.0、单变量分析的差异倍数值（FC）1.2或FC0.833且P0.05的筛选标准，对分组样本的差异代谢物进行了筛选。通过差异倍数分析和火山图可知，羊肚菌子实体受长孢假单隔孢侵染前后样本间代谢物的差异显著性，进而得到差异代谢物。由图3可知，对羊肚菌受长孢假单隔孢侵染不同时期的样本进行分析，共鉴定出395种代谢物。大部分代谢化合物无显著差异，在M1和M2样本中共检测到81种显著差异代谢物（上调53种、下调28种），而在M1和M3样本中共检测到146种显著差异代谢物（上调85种、下调61种）。因此长孢假单隔孢侵染羊肚菌在不同阶段的代谢物数量存在一定差异，且上调代谢物多于下调代谢物。2.4 差异代谢物热图分析 由图4可知，对长孢假单隔孢侵染羊肚菌不同侵染阶段的差异代谢物进行聚类分析，能明显观察到各组样本间的颜色差异，白霉病不同侵染阶段代谢物的变化情况更加直观。在M1和M2样本中，共有81种具有显著性差异的代谢物，M2较M1有53种差异代谢物相对含量显著上调，占比为65.43%；有烟酰胺、乳糖醇、-酮戊二酸、丁香酸等28种差异代谢物的相对含量显著下调，占比为34.57%。在M3和M1样本中共检测到146种显著差异代谢物，其中包括L-亮氨酸-L-丙氨酸、山梨酸、DL精氨酸、海藻糖、烟酸等85种差异代谢物的相对含量显著上调，占比为58.22%；有亚麻油酸、9 期苏文英等：基于非靶向代谢组学分析长孢假单隔孢侵染对羊肚菌代谢的影响632-（3,4-二羟基苯基）乙酰胺、高丝氨酸、花生四烯酸、甘氨酰酪氨酸、己内酰胺、谷氨酸-甘氨酸、色氨醇等61种差异代谢物的相对含量显著下调，占比为41.78%。-log10(P-value)-log10(P-value)log2(FoldChange)log2(FoldChange)图3 正离子模式下的组间火山图图4 正离子模式代谢物聚类分析2.5 代谢物通路及分类注释2.5.1 KEGG通路注释 通过KEGG代谢途径注释，进一步探索白霉病不同侵染阶段中代谢通路的差异。由图5可知，共有153个代谢物被注释到了13个代谢通路中。有59个代谢物被注释到该通路；代谢物富集最多的通路为全局地图和概览地图，其次是氨基酸代谢通路，有31种代谢物被注释到该通路，数量最少的为细胞生长与死亡及萜类化合物和聚酮类化合物代谢通路，均只有1个代谢物。2.5.2 HMDB分类注释 通过HMDB数据库对羊肚菌白霉病发生过程中的代谢物进行分类注释，由图6可知，9条代谢途径中共注释了206个代谢物。代谢物富集数量最多的5条途径依次为：（1）有机酸及其衍生物（Organicacidsandderivatives）代谢通路，共注释了58个代谢物，主要包括D-苯丙氨酸、甜菜碱、硬脂酰胺、L-缬氨酸、L-麦角硫酮、亮氨酸脯氨酸、缬氨酸、L-丙氨酸-L-脯氨酸、DL-精氨酸、脯氨酸、L-谷氨酸等；（2）脂质和类脂质类（Lipidsandlipid-likemolecules）代谢通路，共注释了45个代谢物，主要包括油酸酰胺、十六烷酰胺、庚二酸、异丙醛、创伤性酸、石榴酸、麦角甾醇等；（3）有机杂环化合物（Organoh-eterocycliccompounds）代谢通路，共注释了35个代谢物，包括鸟嘌呤、吡哆醇、L-苏氨酸-1，4-内酯、腺嘌呤、咪唑乙酸、烟酰胺等；（4）苯甲酸酯类（Benzenoids）代谢通路，主要包括高香草酸、丁香酸、2-（3,4-二甲氧基苯基）乙胺、邻苯三酚、邻苯二甲酸一丁酯等24种；（5）有机氧化合物（Organic江 西 农 业 学 报35 卷64oxygencompounds）代谢通路，包括海藻糖、茉莉酮、5-腺苷酸、D-木糖、泛酸、烟酸核糖核苷等19种。图 5 代谢物KEGG富集图 图6 代谢物的HMDB分类注释 3 讨论植物受到病原真菌侵染后，其形态和生理代谢都会发生变化，病原菌通过干扰植物的正常生理代谢以满足自身对营养物质的吸收和利用，这种现象也存在于食用菌与病原菌互作的过程中19。因此通过代谢组学技术研究食用菌在受到病菌入侵后代谢物谱的变化与差异，进一步分析这些差异代谢产物的特点、合成途径、相关基因等，可以探寻到一系列与抗病相关的代谢物，这些代谢物可为食用菌的抗病机制研究和抗性鉴定提供参考依据。本研究利用非靶向的代谢组学技术对羊肚菌受到长孢假单隔孢侵染过程中产生的代谢物进行了研究，以探索代谢化合物与羊肚菌白霉病发生的相关性，在羊肚菌子实体中共鉴定出395种代谢物，大部分代谢化合物之间不存在显著差异，在M1和M2样本中共检测到81种显著差异代谢物（上调53种、下调28种），而在M1和M3样本中共检测到146种显著差异代谢物（上调85种、下调61种）。DL-精氨酸、脯氨酸、L-谷氨酸、D-苯丙氨酸、海藻糖、麦角甾醇等代谢物发生了显著变化，表明这些物质可能与羊肚菌响应白霉病侵染密切相关。海藻糖是一种非还原性双糖，广泛存在于微生物、动物及植物体内，在对抗生物和非生物胁迫方面发挥着重要作用20。Tayeh等21研究表明，喷施海藻糖可上调小麦脂氧合酶（lox）和脂质转移蛋白（ltp）编码基因的表达，从而促进脂质代谢，降低小麦白粉病的发病率。麦角甾醇是微生物细胞膜的重要组成部分，在维持细胞膜的完整性和流动性以及细胞活力等方面起着重要作用，还具有抗氧化、抑菌等功效22。麻兵继等23利用色谱和光谱技术从猴头菌（Hericium erinaceum）干燥子实体中分离获得的麦角甾醇过氧化物对金黄色葡萄球菌、苏云金芽孢杆菌、枯草杆菌和大肠杆菌等细菌有显著的抑制效果。另外，脯氨酸（Pro）可以通过强化植物细胞壁来抵御病原真菌的入侵24。苯丙氨酸（Phe）在植物体内参加植物的抗病性反应，可以作为苯丙素、黄酮类化合物、细胞壁木质素等一系列抗病代谢物的前体来起到抗病作用25。谷氨酸（Glu）可作为植物对环境胁迫应答的信号分子，通过参与植物的抗氧化防御系统、植物的渗透调节等生理过程来增强植物抗病性26。综上所述，羊肚菌白霉病的形成机制是一个复杂的生理过程，虽然利用代谢组学可以识别鉴定羊肚菌体内由长孢假单隔孢诱导产生的代谢物质，但具体的作用机制还需要进一步的研究。4 结论本研究利用非靶向代谢组学全面测定出了长孢假单隔孢侵染羊肚菌过程中的代谢产物共395种，其中227种代谢物之间存在显著差异。M1和M2样本中检测到81种显著差异代谢物（53种上调、28种下调）；M1和M3样本中共检测到146种显著差异代谢物（85种上调、61种下调）。差异代谢物的数量随着侵染时间的延长而增加。精氨酸、海藻9 期苏文英等：基于非靶向代谢组学分析长孢假单隔孢侵染对羊肚菌代谢的影响65糖、山梨酸等代谢物差异显著，可能与羊肚菌白霉病的发生密切相关。本研究初步探究了长孢假单隔孢侵染羊肚菌过程中的差异代谢物，为进一步寻找与羊肚菌抗病相关的代谢物及其抗病机制研究提供理论依据。参考文献：1 HibbettSD,BinderM,BischoffFJ,etal.Ahigher-levelphylogeneticclassificationofthefungi J.MycologicalResearch,2007,111(5):509-547.2 MckellarRL,KohrmanRE.Aminoacidcompositionofthemorelmushroom J.JournalofAgriculturalandFoodChemistry,1975,23(3):464-467.3 李卫东.羊肚菌生物活性成分及药理作用的研究进展综述 J.食药用菌,2018,26(3):157-160.4 赵琪.我国羊肚菌产业发展现状、前景及建议 J.食药用菌,2018,26(3):148-151,156.5 刘伟,张亚,蔡英丽.我国羊肚菌产业发展的现状及趋势 J.食药用菌,2017,25(2):77-83.6 刘伟,蔡英丽,何培新,等.羊肚菌栽培的病虫害发生规律及防控措施 J.食用菌学报,2019,26(2):128-134,5.7 SunJZ,YuS,LuYZ,etal.ProposalofanewfamilyPseudodiploosporeaceaefam.nov.(Hypocreales)basedonphylogenyofDiploospora longisporaandPaecilomyces penicillatus J.Mycology,2023,14(1):60-73.8 张凡忠,刘小红,章初龙,等.植物响应病原真菌的代谢组学研究进展 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