基于磁球的竞争适配体法检测中药中赭曲霉素A.pdf

基于磁球的竞争适配体法检测中药中赭曲霉素 高仕超，秦美君，李 赟，郭丽敏（山西中医药大学，山西 晋中）收稿日期：基金项目：国家自然科学基金（）；山西省中医药管理局科研项目（）；山西省高等学校教学改革创新项目（）；山西中医药大学科技创新能力培育计划项目（）作者简介：高仕超（），男，硕士生，从事中药质量鉴定研究。：通信作者：郭丽敏（），女，副教授，硕士生导师，从事中药质量鉴定研究。：（），：摘要：目的 基于磁球的竞争适配体法检测中药中赭曲霉素。方法以赭曲霉素 的适配体为识别元件，荧光素 为荧光探针，磁球为载体，发展了一种竞争的适配体法检测赭曲霉素。标记的适配体（）与修饰在磁球上的适配体互补链（）杂交而结合在磁球上，并随着磁性分离离开溶液，溶液的荧光信号弱；在溶液中加入赭曲霉素 后，赭曲霉素 与 竞争性的与 结合，与赭曲霉素 结合的 留在溶液中，从而使溶液的荧光信号增强。结果 做互补链，在 的、的 和 的缓冲溶液下，方法检出限低至 ，展现出良好的选择性，同时只需对样品进行简单处理即可实现赭曲霉素 在中药中的检测。结论 本实验将适配体技术和纳米材料结合并应用于中药中真菌毒素的检测，为中药质量鉴定提供了新思路。关键词：赭曲霉素；适配体；中药；荧光；磁球中图分类号：文献标志码：文章编号：（）：赭曲霉素是一种真菌毒素，其中赭曲霉素 是最重要的霉菌代谢产物，可引起肝、肾坏死性病变，还具有致畸性，国际癌症研究机构将其定义为 类致癌物。中国和欧盟对许多食品和饲料中赭曲霉素 进行了限定。年版 中国药典 规定了可以使用 法和 法测定中药中的赭曲霉素，弥补了我国对中药中赭曲霉素 的检测空白。中药中赭曲霉素 的检测主要有色谱法、免疫分析法。色谱法检测灵敏度高，但样品前处理复杂；免疫分析法操作简单、快速，但抗体制备困难、成本高。适配体是体外筛选得到的 或 序列，易于体外大量合成，成本低，可以和光学、电化学等技术结合，广泛应用于细胞成像、生物检测等领域，且适配体易于标记荧光物质而活性不受影响。本实验以磁球为载体，发展了一种竞争性适配体分析法检测赭曲霉素，见图。当溶液中不存在赭曲霉素 时，标记的适配体（）与 通过碱基互补配对，形成双链并结合在磁球上，随磁性分离过程被磁球带走，荧光信号很低；当溶液中存在赭曲霉素 时，赭 曲 霉 素 与 竞 争 性 的 结 合，并将 留在溶液中，荧光信号得以保留。因此，通过检测荧光信号的变化实现对赭曲霉素 的定量检测。图 基于磁球的竞争适配体荧光法检测赭曲霉素 原理图 材料赭曲霉素、氨基酸、华法林、香豆素、赭曲霉素、玉米赤霉烯酮均购自美国 公司；（批号）、（批号）、（批号）、（批号）、（批号）均购自生工生物工程（上海）股份有限公司；链霉亲和素包被的磁球购自美国 公司。其余试剂均为分析纯；水为超纯水。标记有 的赭曲霉素 适配体（）与其互补序列（）由上海生工生物工程股份有限公司提供，序列见表。木槿皮（批号）、桔梗（批号）、槟榔（批号）均购自山西维康堂中药饮片有限 年 月第 卷 第 期中 成 药 表 寡核苷酸序列列表名称序列 公司。型荧光光度计（美国 公司）；型涡旋混匀器（杭州米欧仪器有限公司）；型超纯水机（四川优普超纯科技有限公司）；孔高速微量离心机 鼎昊源（天津）生物科技有限公司。方法 赭曲霉素 检测方法取链酶亲和素包被的磁球 于离心管中，磁性分离，吸取上清液，用缓冲液（溶液 ，含 ，）洗涤磁球 次，加入 生物素标记的核酸适配体互补序列（），室温下反应 ，将 修饰的磁球用缓冲溶液 洗涤后备用。将含有 缓冲液 （溶液 ，含 ，）与 含有赭曲霉素 的缓冲溶液 在室温下反应 ，加入 修饰的磁球，两者混合后室温下反应 ，磁性分离后，在荧光分光光度计下测定荧光强度。根据本实验所选 的荧光强度，设定激发和发射狭缝宽度为 ，由实际测定 的最大激发波长为 ，发射波长范围 ，得到完整荧光光谱。特异性试验 选择与赭曲霉素 结构相近的氨基酸、华法林、香豆素，以及赭曲霉素 的可能共存物赭曲霉素 和玉米赤霉烯酮作为干扰试剂，进行特异性试验，分别在、浓 度 下 进 行 实 验，方 法 同“”项。加样回收率试验分别取 木槿皮、桔梗、槟榔，加入 水，煮沸 ，离心 ，用缓冲溶液将上清液稀释 倍后，加入赭曲霉素，按“”项下方法测定其荧光信号。结果 可行性实验 由图 可知，当体系中不存在赭曲霉素 时，荧光信号弱，说明大部分的 都结合在了磁球上；当加入目标物赭曲霉素 后，体系的荧光信号明显增高，说明赭曲霉素 与 特异性结合，将 留在了溶液中，设计方案可行。实验条件的优化 的选择 赭曲霉素 核酸适配体互补序列 的长度是影响荧光信号强度的一个重要因素，越短（碱基数越少），其与 的结合能力就弱，则在没有赭曲霉素 的情况下，通过磁性分离带走的 图 可行性分析 就越少，体系的荧光信号降低不明显，使得检测背景过高；如果 太长，其与 结合能力过强，又会增强 与赭曲霉素 结合的难度，使得体系在有赭曲霉素 存在下荧光信号也不会太高，这 种情况都会影响检测的灵敏度。基于此，本实验设计了 条分别含有 个（）、个（）、个（）、个（）、个（）碱基数的赭曲霉素 适配体互补序列进行考察。棕色部分为不存在赭曲霉素 时的荧光信号值，绿色部分为加入赭曲霉素 时的信号值，由图 可知，当碱基数为 时（），种体系的荧光信号差值最高，说明 与 的结合能力适当，既能与 有效结合，又能在赭曲霉素 存在下与 及时解离，保障高灵敏度，故本实验选择 为最佳互补链。浓度 既是赭曲霉素 的识别元件，又是荧光探针，它的浓度对检测体系影响很大。如果 浓度过低，检测信号就低，如果 浓度过高，会使得体系背景信号高，两者都会降低检测灵敏度。浓度对体系的荧光信号比值 （，其中 为加入赭曲霉素 时的荧光信号，为没有加入赭曲霉素 时的荧光信号）的影响如图 所示，当 浓度达到 时，荧光信号比值达到最高点。故本实验选择 浓度为 进行后续实验。浓度 离子浓度对赭曲霉素 和其适配体的结合有明显影响。本实验测量了不同浓度 对体系的荧光信号的影响，见图，当体系中没有 时，荧光信号非常弱，随着 浓度逐渐增加，体系荧光比值逐渐升高，在 浓度为 时，荧光信号比值达到最高点，继续增加浓度，荧光信号比值降低，说明一定浓度的有助于适配体特定结构的形成，但是浓度太高反而影响适配体与赭曲霉素 的结合，这与文献 报道一致，故本实验选择 浓度为 进行后续实验。值 值是影响检测体系荧光信号又一重要因素，由于酸性条件会降低赭曲霉素 和其适配体的亲和力，本实验中 值的考察选用中性缓冲溶液和碱性缓冲溶液。实验发现，当 值为 时，实验体系的荧光比 年 月第 卷 第 期中 成 药 图 实验条件的优化值 最大，见图，这与文献 报道的 的荧光量子产率在弱碱性条件下最高相吻合，故本实验选择在 值为 的缓冲溶液进行后续实验。赭曲霉素 检测 以 为互补链，在 、的缓冲溶液下，对赭曲霉素 进行检测，结果见图。随着赭曲霉素 浓度的 增加，体系的荧光信号升高，说明赭曲霉素 浓度越大，在与 的竞争中越有优势。由图 可知，在 范围内，赭曲霉素 浓度与 呈线性相关，线性关系为 （）（为赭曲霉素 的浓度，为 ），检出限（）为 （约 ）。图 赭曲霉素 检测结果 特异性实验 由图 可知，干扰物质只产生微弱的信号，而且当它们的浓度大幅增加时（从 增加 ），其信号没有明显增长；但不管是在相同浓度下，还是在干扰物质浓度远高于赭曲霉素 浓度的情况下，赭曲霉素 都会引起体系荧光信号显著增强，而且信号明显高于干扰物质产生的信号，同时赭曲霉素 的信号会随浓度的增加而明显增长。这些现象不仅进一步说明荧光信号和赭曲霉素 浓度成正相关，再次表明了该方法的可行性，而且展现了方法对赭曲霉素 良好的选择性，这使得将该方法应用于实际样品中成为可能。重复性试验取 赭曲霉素，按“”项下方法平行测定 次荧光信号，并计算 ，测得 为 ，表明该方法重复性良好。稳定性试验 按“”项下方法制备木槿皮、桔梗、年 月第 卷 第 期中 成 药 图 特异性实验结果槟榔溶液，于、在“”项条件下测定荧光信号（赭曲霉素 加入量为 ），测得 时 种中药荧光信号分别为刚配制时信号的 、，表明溶液在 内稳定性良好。加样回收率试验按“”项下方法制备木槿皮、桔梗、槟榔溶液，将简单处理的中药样品用缓冲溶液稀释 倍后（稀释后的中药溶液为阴性样本，无本底信号），分别加入浓度为、赭曲霉素 进行检测，计算回收率，结果见表。回收率和 与使用色谱法的文献 报道接近，表明该方法能够应用于中药中赭曲霉素 的检测。表 加样回收率实验结果样品 加入量（）测得量（）回收率 木槿皮 桔梗 槟榔 讨论本实验比较了几种基于适配体和传统的色谱法检测赭曲霉素 的方法，见表，与几种传统的色谱法相比较，本方法的检出限更低，检测范围更大，充分展现了本方法相较于色谱法的优越性。本方法的灵敏度高于一些使用碳纳米材料的荧光法以及使用 碱基单荧光标记法，而低于基于纳米材料的分散固相萃取技术和采用电化学信号放大的传感器。但是本方法具有试剂量少、检测步骤少、操作简单的优势。表 基于核酸 检测赭曲霉素 的相关方法方法检测范围（）检出限（）文献 法 法 法 碳纳米粒子的荧光检测法 氧化石墨烯的荧光淬灭法 量子点的电化学发光法 碱基猝灭的单标记荧光法 适配体修饰复合纳米纤维的分散固相萃取技术 和 双重信号放大的电化学法 磁球的单标记荧光法 结论本实验以赭曲霉素 适配体为识别元件，为荧光探针，磁球为固体载体，建立了定量检测赭曲霉素 的方法。溶液中的赭曲霉素 与修饰在磁球上的 竞争性的与 结合，与赭曲霉素 结合的 留在溶液中，方法通过对溶液中 荧光信号的检测达到定量检测赭曲霉素 的目标。在最佳实验条件下，赭曲霉素 浓度在 范围内与 呈线性相关，检出限为 。仅需对样品进行简单处理，方法即可检测中药木槿皮、桔梗和槟榔中的赭曲霉素，回收率在 之间，检测效果良好。后期会进一步将该检测方法在同一种多批次中药以及其他多种类中药中应用，以确定方法的使用范围；同时尝试选用相应的适配体序列，检验方法对中药中其它污染物的检测是否可行。该方法将新兴的适配体技术和纳米材料应用于中药中赭曲霉素 的检测，希望能为将适配体技术推广到中药质量评价工作中做出一些努力。致谢本实验所用仪器由山西中医药大学实验管理中心公共研究平台提供，实验中得到了中药微乳技术国家与地方联合工程实验室、中药微乳与生物新制剂研发山西省 工程（技术）研究中心、山西省现代中药工程实验室和山西省卫健委“中药外用新制剂工艺开发”委级重点实验室的帮助，特此感谢。年 月第 卷 第 期中 成 药 参考文献：，（）：，（）（）（），：，（）：国家药典委员会 中华人民共和国药典：年版一部 北京：中国医药科技出版社，蔡伟谊，毛新武，林子豪，等 在线免疫亲和固相萃取高效液相色谱法快速测定食品中赭曲霉毒素 食品安全质量检测学报，（）：秦 露，张 磊，蒋佳伊，等 基于酶联免疫分析法高通量筛查中药材中赭曲霉毒素 的污染研究 中国中药杂志，（）：，（），（）：，：，（）：，（），（）：，（）：，（）：，（）：叶林链，王少敏，周恒，等 高效液相荧光色谱法测定坤宝丸中 赭曲 霉毒素 中 成 药，（）：李凤华，李作华，杨 丽，等 药食同源中药材中 种真菌毒素的测定与分析 食品工业科技，（）：胡佳哲，陈 俏，曹雅静，等 首批立法保护岭南中药材中真菌毒素 的 法检 测 药物 分析杂 志，（）：刘 丽 基于纳米材料荧光传感器检测赭曲霉毒素 的方法研究 杭州：浙江大学，康 宇，秦 兰，羊杜涛，等 用于 检测的氧化石墨烯 适配体传感器的构建 中国科技论文，（）：，（）：曲 瑶，张亚旗，肖光，等 基于核酸碱基猝灭荧光团的核酸适配体传感器检测赭曲霉毒素 分析化学，（）：刘炉英，刘锦辉，胡小刚 基于核酸适配体修饰复合纳米纤维的分散固相萃取技术在赭曲霉毒素 检测中的应用 分析化学，（）：白 天，岳 爽，赵路阳，等 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