CircCCND1调节miR-340-5p_TGIF1轴对H446肺癌细胞恶性生物学行为的影响.pdf

161中国肺癌杂志2024年3月第27卷第3期Chin J Lung Cancer,March 2024,Vol.27,No.3 基 础 研究CircCCND1调节miR-340-5p/TGIF1轴对H446肺癌细胞恶性生物学行为的影响董怡 朱翠敏 柳新 赵继伟 李青山【摘要】背景与目的 肺癌是常见的肺部恶性肿瘤，探究肺癌发生发展的分子机制是当前研究的热点。环状RNA细胞周期蛋白D1（circular RNA Cyclin D1,CircCCND1）在肺癌中高表达，可能是治疗肺癌的潜在靶点。本研究旨在探讨CircCCND1调节miR-340-5p/转化生长因子诱导因子同源框1（transforming growth factor-induced factor homeobox 1,TGIF1）轴对肺癌细胞恶性生物学行为的影响。方法 检测人正常肺上皮细胞BEAS-2B及人肺癌H446细胞中CircCCND1、miR-340-5p及TGIF1 mRNA表达。将体外培养的H446细胞分为对照组、CircCCND1 siRNA组、miR-340-5p mimics组、阴性对照组、CircCCND1 siRNA+miR-340-5p inhibitor组，检测细胞增殖、线粒体膜电位、凋亡、迁移和侵袭情况，以及各组细胞CircCCND1、miR-340-5p、TGIF1 mRNA、BCL2相关X蛋白（BCL2-associated X protein,Bax）、剪切的半胱天冬氨酸蛋白酶3（cleaved Caspase-3）、N-钙黏蛋白（N-cadherin）、E-钙黏蛋白（E-cadherin）、TGIF1蛋白表达，并验证miR-340-5p与CircCCND1、TGIF1的靶向关系。结果 与BEAS-2B细胞相比，H446细胞CircCCND1、TGIF1 mRNA升高，miR-340-5p表达降低（P0.05）。敲低CircCCND1或上调miR-340-5p表达可抑制H446细胞增殖、迁移、侵袭，降低TGIF1 mRNA和TGIF1蛋白表达，促进细胞凋亡；下调miR-340-5p可拮抗敲低CircCCND1对H446肺癌细胞恶性生物学行为的抑制作用。CircCCND1可能靶向下调miR-340-5p，miR-340-5p可能靶向下调TGIF1。结论 敲低CircCCND1可抑制肺癌H446细胞恶性行为，其作用可能是通过调控miR-340-5p/TGIF1轴实现的。【关键词】CircCCND1；miR-340-5p/TGIF1；肺肿瘤；恶性生物学行为 Effect of CircCCND1 on the Malignant Biological Behaviors of H446 Lung Cancer Cells by Regulating the MiR-340-5p/TGIF1 Axis Yi DONG,Cuimin ZHU,Xin LIU,Jiwei ZHAO,Qingshan LIDepartment of Oncology,Affiliated Hospital of Chengde Medical College,Chengde 067000,China Corresponding author:Qingshan LI,E-mail:【Abstract】Background and objective Lung cancer is a common malignant tumor of the lung.To explore the molecular mechanism of the occurrence and development of lung cancer is a hot topic in current research.Cyclic RNA D1(CircCCND1)is highly expressed in lung cancer and may be a potential target for the treatment of lung cancer.The aim of this study was to investigate the effect of CircCCND1 on the malignant biological behaviors of lung cancer cells by regulat-ing the miR-340-5p/transforming growth factor-induced factor homeobox 1(TGIF1)axis.Methods The expression of CircCCND1,miR-340-5p,and TGIF1 mRNA in human normal lung epithelial cells BEAS-2B and human lung cancer H446 cells were detected.H446 cells cultured in vitro were randomly divided into control group,CircCCND1 siRNA group,miR-340-5p mimics group,negative control group,and CircCCND1 siRNA+miR-340-5p inhibitor group.Cell proliferation,mito-chondrial membrane potential,apoptosis,migration,and invasion were detected,and the expressions of CircCCND1,miR-340-5p,TGIF1 mRNA,BCL2-associated X protein(Bax),cleaved Caspase-3,N-cadherin,E-cadherin,and TGIF1 proteins in each group were detected.The targeting relationship of miR-340-5p with CircCCND1 and TGIF1 was verified.Results Compared with BEAS-2B cells,CircCCND1 and TGIF1 mRNA were increased in H446 cells,and miR-340-5p expression was decreased(P0.05).Knocking down CircCCND1 or up-regulating the expression of miR-340-5p inhibited the proliferation,migration and invasion of H446 cells,decreased the expression of TGIF1 mRNA and TGIF1 protein,and promoted cell apop-tosis.Down-regulation of miR-340-5p could antagonize the inhibitory effect of CircCCND1 knockdown on the malignant bio-DOI:10.3779/j.issn.1009-3419.2024.106.05本研究受河北省自然科学基金面上项目（No.H2020406050）资助作者单位：067000 承德，承德医学院附属医院肿瘤科（通信作者：李青山，E-mail:）162中国肺癌杂志2024年3月第27卷第3期Chin J Lung Cancer,March 2024,Vol.27,No.3logical behavior of H446 lung cancer cells.CircCCND1 may target the down-regulation of miR-340-5p,and miR-340-5p may target the down-regulation of TGIF1.Conclusion Knocking down CircCCND1 can inhibit the malignant behaviors of lung cancer H446 cells,which may be achieved through the regulation of miR-340-5p/TGIF1 axis.【Key words】CircCCND1;miR-340-5p/TGIF1;Lung neoplasms;Malignant biological behavior【Copyright statement】Copyright 2024,Chinese Journal of Lung Cancer.This study was supported by the grant from Science and Technology Department of Hebei Province(No.H2020406050)(to Cuimin ZHU).肺癌是最常见的肺部恶性肿瘤，已成为威胁人类生命健康的重大卫生问题1-3。环状RNA细胞周期蛋白D1（circular RNA Cyclin D1,CircCCND1）是一种源自CCND1的新型环状RNA分子，也是癌症发生发展的关键调控因子之一，在喉鳞状细胞癌中上调，并与其侵袭性和不良预后密切相关，CircCCND1的缺失可在体内外抑制喉鳞状细胞癌细胞的生长4，敲低CircCCND1可减弱非小细胞肺癌的化学耐药性，进而抑制顺铂处理下非小细胞肺癌细胞的增殖并诱导其凋亡5。miR-340-5p是一种具有抗癌作用的微小RNA分子，可被环状RNA调控，过表达miR-340-5p可抑制透明细胞癌细胞的生长及进展6，并可有效抑制结直肠癌细胞的增殖、迁移和侵袭以及体内生长7。Li等8研究表明miR-340-5p的上调抑制了肺癌细胞的增殖、迁移和血管生成。转化生长因子诱导因子同源框1（transforming growth factor-induced factor homeobox 1,TGIF1）作为一种癌基因可促进恶性肿瘤的病理过程，TGIF1的高表达是神经胶质瘤患者预后不良的重要预测因素，敲低TGIF1可抑制神经胶质瘤细胞的增殖和侵袭9；TGIF1的沉默促进了食管癌细胞凋亡并抑制了其迁移、侵袭和上皮间充质转化（epithelial mesenchymal transition,EMT）过程10；增强TGIF1基因表达可促进肺腺癌H157细胞的迁移、侵袭和转移，此过程可通过沉默TGIF1来进行阻断11。生物信息学预测发现miR-340-5p序列与CircCCND1、TGIF1序列存在结合位点，因此预测CircCCND1可能通过调节miR-340-5p/TGIF1轴介导肺癌细胞的恶性生物学行为，本文旨在通过体外人小细胞肺癌H446细胞来验证此预测。1 材料与方法1.1 实验材料与仪器 人正常肺上皮细胞BEAS-2B、人小细胞肺癌H446细胞，购自武汉尚恩生物技术有限公司；一步法逆转录-实时荧光定量聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）试剂盒，购自河北三狮生物科技有限公司；TRIzol RNA提取试剂、兔源抗人Anti-Ki67、Anti-TGIF1、Anti-Bax、Anti-Cleaved Caspase-3、Anti-actin、Anti-N-cadherin及Anti-E-cadherin一抗、JC-1检测试剂盒，购自美国Thermo Fisher Scientific公司；Alexa FluorTM 488标记小鼠抗兔二抗、HRP标记小鼠抗兔二抗、TUNEL检测试剂盒，购自美国Abcam公司；Q3200实时荧光定量PCR仪，购自杭州柏恒科技有限公司；Delphi-X倒置荧光显微镜，购自美国AMSCOPE公司；DxFLEX流式细胞仪，购自美国Beckman公司；HT-Mini01/Mini04/ZY02蛋白电泳与转印系统、HT-600C/600D通用型电泳仪电源，购自江苏天通设备科技有限公司；PRESA-96全自动酶标仪，购自普睿博仪器（杭州）有限公司等。1.2 方法1.2.1 实时荧光定量PCR实验检测BEAS-2B及H446细胞中CircCCND1、miR-340-5p、TGIF1 mRNA表达 在39.8 oC温水浴中迅速解冻购买的BEAS-2B及H446细胞，分别以DMEM和RPMI-1640培养基进行复苏培养（两种培养基内均混有10%胎牛血清和1%青链霉素双抗）。收集细胞提取总RNA后，按照一步法逆转录-实时荧光定量PCR试剂盒说明书中方法进行PCR，采用2-Ct算法分析各基因循环阈值，并采用GAPDH作CircCCND1、TGIF1的内参对照，同时采用U6作miR-340-5p的内参对照。引物序列见表1。表 1 引物序列Tab 1 Primers sequenceGenesDirectionSequence(5-3)CircCCND1FRTCCTCTCCAAAATGCCAGAG ACTCTGCTGCTCGCTGCTACTGIF1FRGGATTGGCTGTATGAGCACCGTGCCATCCTTTCTCAGCATGTCAGGAPDHFRAATGGGCAGCCGTTAGGAAA TGAAGGGGTCATTGATGGCAmiR-340-5pFRGCGGTTATAAAGCAATGAGA GTGCGTGTCGTGGAGTCGU6FRGCTTCGGCAGCACATATACTAAAATCGCTTCACGAATTTGCGTGTCATCircCCND1:circular RNA Cyclin D1;TGIF1:transforming growth factor-induced factor homeobox 1;miR-340-5p:microRNA-340-5p.163中国肺癌杂志2024年3月第27卷第3期Chin J Lung Cancer,March 2024,Vol.27,No.31.2.2 分组转染H446细胞 将H446细胞接种于24孔板进行传代培养，直至进入对数生长期后随机分为对照组、CircCCND1 siRNA组、miR-340-5p mimics组、阴性对照组、CircCCND1 siRNA+miR-340-5p inhibitor组，采用脂质体3000进行转染，转染24 h后行后续实验检测。1.2.3 实时荧光定量PCR实验检测各组H446细胞CircCCND1、miR-340-5p及TGIF1 mRNA表达 收集1.2.2中分组转染后的各组H446细胞，使用TRIzol RNA提取试剂提取其总RNA，然后进行实时荧光定量PCR实验来检测各组细胞CircCCND1、miR-340-5p及TGIF1 mRNA相对表达，按1.2.1中所述方法进行操作。1.2.4 Ki67免疫荧光染色检测各组H446细胞增殖率 采用PBS缓冲液漂洗1.2.2中转染后的各组H446细胞，然后加入10%甲醛溶液覆没细胞，于室温下固定30 min后依次以5%牛血清白蛋白封闭、稀释100倍的兔抗人Anti-Ki67一抗孵育、PBS缓冲液漂洗、稀释150倍的小鼠抗兔二抗（Alexa FluorTM 488标记）避光孵育，荧光显微镜下观察并拍照，计数Ki67阳性细胞数与细胞总数，计算细胞增殖率（Ki67阳性细胞数/细胞总数100%）。1.2.5 检测各组U20S细胞线粒体膜电位 采用PBS缓冲液漂洗1.2.2中转染后的各组H446细胞，计数测定其密度后每组各取含1107个细胞的细胞悬液于室温下进行离心（300 g,5 min），所得细胞沉淀采用 JC-1工作液进行重悬孵育，在同样条件下再次离心后用适量PBS缓冲液洗涤、悬浮，混匀后用流式细胞仪检测，并用FlowJo V10软件处理获得各组细胞红色和绿色荧光强度后算出各组细胞线粒体膜电位，公式：细胞线粒体膜电位=红色荧光强度/绿色荧光强度。1.2.6 TUNEL染色实验检测各组H446细胞凋亡率 采用PBS缓冲液漂洗1.2.2中转染后的各组H446细胞，然后加入10%甲醛溶液覆没细胞，于室温下固定30 min后以TUNEL工作液孵育、PBS缓冲液漂洗，最后在荧光显微镜下观察并拍照，计数各组TUNEL阳性细胞数与细胞总数，计算细胞凋亡率（TUNEL阳性细胞数/细胞总数100%）。1.2.7 划痕实验、Transwell侵袭实验分别检测各组H446细胞迁移比、侵袭数 划痕实验：采用PBS缓冲液漂洗1.2.2中转染后的各组H446细胞，计数测定其密度后每组各取含1107个细胞的细胞悬液于室温下进行离心（300 g,5 min），所得细胞以无胎牛血清的RPMI-1640培养基悬浮后于24孔板内培养，待细胞铺满孔底后，用无菌枪头在孔底划线，并用Image J软件定量图像中各组划痕面积并以S1表示，加入无胎牛血清的RPMI-1640培养基继续培养24 h后再次采集各组细胞图像，测出其划痕面积并以S2表示，然后算出各组细胞迁移比，细胞迁移比=（S1-S2）/S1100%。Transwell侵袭实验：采用PBS缓冲液漂洗1.2.2中转染后的各组H446细胞，计数测定其密度后每组各取含1107个细胞的细胞悬液于室温下进行离心（300 g,5 min），所得细胞以无胎牛血清的RPMI-1640培养基悬浮（5105个细胞/mL）后，在Transwell上室内添加100 L细胞悬液，600 L培养基（含血清）加入下室，培养24 h后，将细胞固定，进行吉姆萨染色后，显微镜下观察并拍照，用Image J软件定量图像中各组下室内总细胞数，可获得各组细胞侵袭数。1.2.8 免疫印记实验检测各组H446细胞凋亡与EMT相关蛋白表达、TGIF1蛋白表达 收集1.2.2中转染后的各组H446细胞分别与RAPI裂解液混匀，按照其说明书中方法提取各组总蛋白后通过BCA法测出其浓度，根据结果每组取30 g总蛋白样品于蛋白电泳与转印系统内进行电泳后湿转，所得膜上蛋白浸没在3%牛血清白蛋白内封闭后依次以均稀释2000倍的兔源抗人Anti-TGIF1、Anti-Bax、Anti-cleaved Caspase-3、Anti-actin、Anti-N-cadherin及Anti-E-cadherin一抗孵育、TBST缓冲液漂洗、以稀释1000倍的二抗孵育后显影，Image J软件分析灰度值，计算蛋白相对表达，公式：蛋白相对表达=检测蛋白（TGIF1、Bax、cleaved Caspase-3、N-cadherin、E-cadherin）/内参蛋白（-actin）。1.2.9 双荧光素酶报告实验验证H446细胞CircCCND1对miR-340-5p、miR-340-5p对TGIF1的靶向关系 于24孔板内培养H446细胞，将CircCCND1、TGIF1野生型（WT-CircCCND1、WT-TGIF1）和突变型（MUT-CircCCND1、MUT-TGIF1）质粒分别与miR-NC（或miR-340-5p mimics）进行共转染，采用脂质体3000并按照其说明书中方法转染24 h后，测定荧光素酶活性。1.3 统计分析 统计分析采用GraphPad Prism 8.0软件，本实验数据使用均数标准差（MeanSD）进行表示，两组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析，多组两两比较采用SNK-q检验。P0.05为差异有统计学意义。2 结果2.1 人小细胞肺癌H446细胞CircCCND1、miR-340-5p及TGIF1 mRNA表达 H446细胞中CircCCND1、TGIF1 mRNA164中国肺癌杂志2024年3月第27卷第3期Chin J Lung Cancer,March 2024,Vol.27,No.3表达高于BEAS-2B细胞，miR-340-5p表达低于BEAS-2B细胞（P0.05）。见表2。2.2 各组H446细胞CircCCND1、miR-340-5p及TGIF1 mRNA表达 CircCCND1 siRNA组CircCCND1、TGIF1 mRNA表达低于对照组，miR-340-5p表达高于对照组（P0.05）；miR-340-5p mimics组TGIF1 mRNA表达低于对照组，miR-340-5p表达高于对照组（P0.05）；CircCCND1 siRNA+miR-340-5p inhibitor组miR-340-5p表达低于CircCCND1 siRNA组，TGIF1 mRNA表达高于CircCCND1 siRNA组（P0.05）。见表3。2.3 各组H446细胞增殖、线粒体膜电位与凋亡 CircCCND1 siRNA组、miR-340-5p mimics组细胞增殖率、线粒体膜电位低于对照组，凋亡率高于对照组（P0.05）；CircCCND1 siRNA+miR-340-5p inhibitor组细胞增殖率、线粒体膜电位高于CircCCND1 siRNA组，凋亡率低于CircCCND1 siRNA组（P0.05）。见图1-3和表4。2.4 各组H446细胞迁移、侵袭 CircCCND1 siRNA组、miR-340-5p mimics组细胞迁移比、侵袭数低于对照组（P0.05）；CircCCND1 siRNA+miR-340-5p inhibitor组上述指标高于CircCCND1 siRNA组（P0.05）。见图4、5和表5。2.5 各组H446细胞凋亡与EMT相关蛋白、TGIF1蛋白表达 CircCCND1 siRNA组、miR-340-5p mimics组N-cadherin、TGIF1蛋白水平低于对照组，Bax、Cleaved Caspase-3、E-cadherin蛋白水平高于对照组（P0.05）；CircCCND1 siRNA+miR-340-5p inhibitor组N-cadherin、TGIF1蛋白水平高于CircCCND1 siRNA组，Bax、Cleaved Caspase-3、E-cadherin蛋白水平低于CircCCND1 siRNA组（P0.05）。见图6和表6。2.6 CircCCND1对H446细胞miR-340-5p、miR-340-5p对H446细胞TGIF1的靶向调节 查询Starbase数据库可发现CircCCND1与miR-340-5p存在互补位点（图7）。miR-340-5p mimics+WT-CircCCND1组荧光素酶活性低于miR-NC+WT-CircCCND1组（P0.05），见表7。查询Starbase数据库可发现miR-340-5p与TGIF1之间表 2 各细胞CircCCND1及miR-340-5p表达、TGIF1 mRNA相对表达水平（MeanSD,n=6）Tab 2 Expression levels of CircCCND1 and miR-340-5p,and relative expression levels of TGIF1 mRNA in each cell(MeanSD,n=6)GroupsCircCCND1miR-340-5pTGIF1 mRNABEAS-2B0.980.161.030.171.000.21H4462.170.11a0.250.08a2.040.19aaP0.05 vs BEAS-2B cells.表 3 各组细胞CircCCND1、miR-340-5p及TGIF1 mRNA表达（MeanSD,n=6）Tab 3 Expressions of CircCCND1,miR-340-5p and TGIF1 mRNA in each group(MeanSD,n=6)GroupsCircCCND1miR-340-5pTGIF1 mRNAControl1.000.151.030.161.010.17CircCCND1 siRNA0.310.10a2.210.20a0.360.11amiR-340-5p mimics0.950.142.280.21a0.320.10aNegative control1.020.161.010.171.040.15CircCCND1 siRNA+miR-340-5p inhibitor0.330.111.080.19b0.960.13baP0.05 vs Control group;bP0.05 vs CircCCND1 siRNA group.表 4 各组H446细胞增殖率、线粒体膜电位、凋亡率（MeanSD,n=6）Tab 4 Proliferation rate,mitochondrial membrane potential and apoptosis rate of H446 cells in each group(MeanSD,n=6)GroupsProliferation rate（%）Mitochondrial membrane potentialApoptosis rate（%）Control78.2510.851.610.227.462.32CircCCND1 siRNA21.907.21a0.580.17a46.153.86amiR-340-5p mimics18.456.10a0.530.16a50.243.75aNegative control75.909.551.640.217.052.33CircCCND1 siRNA+miR-340-5p inhibitor70.1410.35b1.540.18b8.962.50baP0.05 vs Control group;bP0.05 vs CircCCND1 siRNA group.165中国肺癌杂志2024年3月第27卷第3期Chin J Lung Cancer,March 2024,Vol.27,No.3ControlmiR-340-5p mimicsCircCCND1 siRNANegative controlCircCCND1 siRNA+miR-340-5p inhibitor图 1 各组H446细胞增殖情况（Ki67免疫荧光染色，200）Fig 1 Proliferation of H446 cells in each group(Ki67 immunofluorescence staining,200)JC-1 green fluorescenceJC-1 green fluorescenceJC-1 green fluorescenceJC-1 green fluorescenceJC-1 green fluorescenceJC-1 red fluorescenceJC-1 red fluorescenceJC-1 red fluorescenceJC-1 red fluorescenceJC-1 red fluorescence100 101 102 103 104100 101 102 103 104100 101 102 103 104100 101 102 103 104100 101 102 103 104104103102101100104103102101100104103102101100104103102101100104103102101100ControlmiR-340-5p mimicsCircCCND1 siRNANegative controlCircCCND1 siRNA+miR-340-5p inhibitor图 2 流式细胞实验检测各组H446细胞线粒体膜电位（200）Fig 2 Mitochondrial membrane potential of H446 cells in each group detected by flow cytometry(200)ControlmiR-340-5p mimicsCircCCND1 siRNANegative controlCircCCND1 siRNA+miR-340-5p inhibitor图 3 TUNEL染色检测各组H446细胞凋亡率（200）Fig 3 Apoptosis rate of H446 cells in each group detected by TUNEL staining(200)0 h24 hControlmiR-340-5p mimicsCircCCND1 siRNANegative controlCircCCND1 siRNA+miR-340-5p inhibitor图 4 细胞划痕实验检测H446细胞迁移（200）Fig 4 H446 cell migration detected by cell scratch test(200)166中国肺癌杂志2024年3月第27卷第3期Chin J Lung Cancer,March 2024,Vol.27,No.3表 5 各组H446细胞迁移比、侵袭数（MeanSD,n=6）Tab 5 Migration ratio and invasion number of H446 cells in each group(MeanSD,n=6)GroupsMigration ratio(%)Invasion numberControl83.7210.85286.5330.45CircCCND1 siRNA24.977.29a90.1426.21amiR-340-5p mimics21.046.16a82.3025.85aNegative control84.189.93298.5729.70CircCCND1 siRNA+miR-340-5p inhibitor80.019.42b274.2028.35baP0.05 vs Control group;bP0.05 vs CircCCND1 siRNA group.图 5 Transwell实验检测H446细胞侵袭（结晶紫染色，200）Fig 5 H446 cell invasion detected by Transwell assay(crystal violet staining,200)ControlmiR-340-5p mimicsCircCCND1 siRNANegative controlCircCCND1 siRNA+miR-340-5p inhibitor表 7 各组相对荧光素酶活性（MeanSD,n=6）Tab 7 Relative luciferase activity in each group(MeanSD,n=6)GroupsRelative luciferase activitymiR-NC+WT-CircCCND11.010.13miR-340-5p mimics+WT-CircCCND10.300.08amiR-NC+MUT-CircCCND10.990.12miR-340-5p mimics+MUT-CircCCND10.970.11aP0.05 vs miR-NC+WT-CircCCND1 group.表 6 各组H446细胞凋亡与EMT相关蛋白、TGIF1蛋白相对表达（MeanSD,n=6）Tab 6 Relative expression of EMT-related protein and TGIF1 protein in H446 cell apoptosis in each group(MeanSD,n=6)GroupsCleaved caspase-3BaxN-cadherinE-cadherinTGIF1Control0.270.080.180.050.690.070.220.070.850.15CircCCND1 siRNA0.720.13a0.690.10a0.170.05a0.730.10a0.320.10amiR-340-5p mimics0.740.12a0.710.11a0.140.04a0.760.12a0.290.09aNegative control0.250.080.170.050.700.080.210.060.870.14CircCCND1 siRNA+miR-340-5p inhibitor0.290.09b0.200.06b0.650.06b0.250.08b0.810.12b aP0.05 vs Control group;bP0.05 vs CircCCND1 siRNA group.167中国肺癌杂志2024年3月第27卷第3期Chin J Lung Cancer,March 2024,Vol.27,No.3图 6 免疫印迹检测各组细胞凋亡与EMT相关蛋白、TGIF1蛋白表达。A：对照组；B：CircCCND1 siRNA组；C：miR-340-5p mimics组；D：阴性对照组；E：CircCCND1 siRNA+miR-340-5p inhibitor组。Fig 6 Western blot detection of apoptosis and EMT-related proteins,TGIF1 protein expression in each group.A:control group;B:CircCCND1 siRNA group;C:miR-340-5p mimics group;D:negative control group;E:CircCCND1 siRNA+miR-340-5p inhibitor group.Cleaved caspase-3:cleaved aspartate-specific cysteine proteinase-3;Bax:BCL2-associated X protein.aP0.05 vs Control group;bP0.05 vs CircCCND1 siRNA group.Cleaved caspase-3 Bax N-cadherin E-cadherin TGIF1 -actin16 kDa21 kDa145 kDa125 kDa30 kDa42 kDaA B C D E图 7 查询Starbase数据库得到的CircCCND1与miR-340-5p之间结合位点（红色表示突变位点）Fig 7 The binding sites between CircCCND1 and miR-340-5p obtained by querying Starbase database(red represents the mutation site)图 8 查询Starbase数据库得到得到的miR-340-5p与TGIF1之间结合位点（红色表示突变位点）Fig 8 The binding site between miR-340-5p and TGIF1 obtained by querying Starbase database(red represents the mutation site)存在结合位点（图8）。WT-TGIF1+miR-340-5p mimics组荧光素酶活性低于WT-TGIF1+miR-NC组（P0.05），见表8。3 讨论小细胞肺癌作为恶性程度更高的肺癌，手术后复发率很高且化疗效果会受限于靶向性弱、化疗耐药性等因素，致使患者预后不良，因此需要积极探究肺癌发生发展机制来寻找新型治疗靶点12-14。环状RNA是人类癌症发生和恶性进展的关键调节因子，CircCCND1作为可增强CCND1基因稳定性的促癌因子4，与肝细胞癌患者相对较大的肿瘤大小和淋巴结转移有关，敲低CircCCND1可显著抑制肝细胞癌细胞的增殖、迁移和侵袭15。CircCCND1在喉癌中高表达并在其发病机制中发挥着关键