基于TGR5_cAMP_PKA信号通路探讨疏肝、健脾疗法对肝损伤大鼠的作用及机制.pdf

论著基于/信号通路探讨疏肝、健脾疗法对肝损伤大鼠的作用及机制魏伟莉郑智礼邓秀兰高艺宁史兴华钟相根(北京中医药大学中医学院北京)摘要 目目的的 探讨疏肝疗法与健脾疗法对肝郁叠加肝损伤大鼠的作用及机制 方方法法 将 只雄性 大鼠随机分为正常组、模型组、双环醇组、四逆散组、六君子汤组每组 只 除正常组外其余组大鼠均采用束缚叠加四氯化碳橄榄油溶液皮下注射的方法制备肝郁叠加肝损伤模型造模同时模型组给予去离子水灌胃双环醇组给予./双环醇灌胃四逆散组给予./四逆散灌胃六君子汤组给予六君子汤./灌胃连续灌胃 末次灌胃结束后全自动生化分析仪检测血清肝功能生化指标碱性磷酸酶()、丙氨酸氨基转移酶()、天冬氨酸氨基转移酶()、总胆红素()、直接胆红素()水平 法检测肝脏组织中白细胞介素()、肿瘤坏死因子 ()、环磷酸腺苷()、蛋白激酶()表达情况免疫组化法检测肝脏、结肠组织中 蛋白偶联受体()阳性表达情况 染色观察结肠组织中杯状细胞数量 结结果果 与正常组比较模型组血清、水平和肝脏组织中 相对表达量、结肠组织中 阳性表达平均光密度值均明显升高(均.)肝脏组织中、相对表达量和肝脏组织中 阳性表达平均光密度值均明显降低(均.)结肠组织中杯状细胞数量明显减少(.)与模型组比较双环醇组、四逆散组血清、水平及六君子汤组血清、水平双环醇组、四逆散组肝脏组织中 、相对表达量和各药物组结肠组织中 阳性表达平均光密度值均明显降低(均.)四逆散组肝脏组织中、相对表达量和双环醇组 相对表达量、六君子汤组 相对表达量、各药物组肝脏组织中 阳性表达平均光密度值均明显升高(均.)各药物组杯状细胞数量均明显增多(均.)与六君子汤组比较四逆散组 、相对表达量均更低(均.)相对表达量明显更高(.)结结论论 四逆散疏肝可能通过激活/信号通路上调肝脏中、表达下调肝脏中炎症因子表达从而改善肝郁叠加肝损伤大鼠的肝功能关键词 肝损伤疏肝健脾四逆散六君子汤 蛋白偶联受体:./.中图分类号 文献标识码 文章编号 ()作者简介 魏伟莉女硕士研究方向为中医药防治消化系统疾病通信作者 钟相根 :.基金项目 国家自然科学基金面上项目()北京中医药大学校级科研纵向发展基金()/():.现代中西医结合杂志 ()./././.()()()()()()()()().().()(.)(.).(.)(.)(.).(.)(.)./.:肝脏在维持代谢动态平衡排泄外源性和内源性有毒物质方面起着关键作用肝脏损伤可导致肝脏炎症、肝脂肪变性、肝纤维化等多种病理 改变 胆汁酸由肝脏中胆固醇合成并进入肠道可调节肠道菌群的组成肝损伤时造成的胆汁酸代谢改变可引起肠道菌群失衡和肝脏炎症 蛋白偶联受体()是 蛋白偶联受体()大家族中的成员是胆汁酸膜受体在肝脏枯否细胞、结肠中表达 并在小鼠肝脏中具有抗炎特性调节其表达可能是治疗肝损伤的有效靶点目前治疗肝损伤的西药有限中医药的应用越来越多 四逆散具有疏肝理脾、透邪解郁的功效可调节非酒精性脂肪性肝炎大鼠脂代谢紊乱、改善胰岛素抵抗、减轻肝细胞损伤四逆散加味对大鼠肝纤维化有明显的预防和治疗作用 六君子汤具有益气健脾、燥湿化痰的功效能预防阿霉素所致的肝细胞损伤有效预防抗生素相关性肠道菌群失调 但两种方药辨治证型有所不同对肝损伤的保护作用机制尚不明确 本实验将四逆散作为疏肝方、六君子汤作为健脾方基于/环磷酸腺苷()/蛋白激酶()信号通路探讨了疏肝、健脾治疗对于肝郁叠加肝损伤大鼠肝脏的作用及机制旨在为肝损伤的临床治疗提供实验依据 实验材料与方法 实验动物 只清洁级雄性 大鼠体重()由斯贝福(北京)生物技术有限公司提供动物合格证号:(京)饲养条件:室温()相对湿度()采用现代中西医结合杂志 ()/明暗光照自由摄食饮水 本实验经北京中医药大学动物伦理委员会批准()药物和试剂 双环醇片(北京协和药厂国药准字 规格:/片)四逆散(柴胡、白芍、枳壳、炙甘草)六君子汤(党参、茯苓 、白术 、炙甘草 、法半夏 、陈皮、焦神曲、焦山楂、焦麦芽)组方中中药饮片均购于北京同仁堂医药药材有限公司经北京中医药大学中药学院李向日教授鉴定药物符合 年版中华人民共和国药典规范 药物煎煮方法:先加药物组方 倍量纯水浸泡 药物煎煮至沸腾保持沸腾 后过滤药液滤渣再加 倍量纯水煎煮 过滤 次煎煮滤液合并后文火浓缩四逆散、六君子汤含生药质量浓度分别为./和./保存备用 四氯化碳(上 海 沪 试 化 工 有 限 公 司 批 号:)肝功能生化指标检测试剂原厂配套试剂()提取液、()(、)兔抗 多克隆抗体()染液()仪器石蜡切片机()组织包埋机()脱水机()烤箱(上海慧泰仪器制造有限公司)光学显微镜()荧光定量 仪()超微量分光光度计()全自动生化分析仪()台式高速冷冻型微量离心机()实验方法 大鼠适应性喂养 后采用随机数字表法分为正常组、模型组、双环醇组、四逆散组、六君子汤组每组 只 正常组大鼠不进行造模其余组大鼠采用束缚叠加 橄榄油溶液皮下注射的方法制备肝郁叠加肝损伤模型 慢性束缚方式:将大鼠放于特制的束缚筒内根据大鼠体重通过拧动螺丝固定束缚筒前端的筒塞及调节束缚筒后端的插片进行相应的活动空间调整空间大小以大鼠无强烈反抗动作为准 每天开始束缚的时间随机持续束缚的时间从开始的 /逐渐增加到/次/连续束缚 束缚期间大鼠禁食并禁水 造模期间各组大鼠均给予新鲜配制的 橄榄油溶液./皮下注射正常组大鼠皮下注射等容量橄榄油溶液均 次/同时双环醇组给予双环醇./灌胃(次/)四逆散组、六君子汤组分别给予四逆散./、六君子汤./灌胃(中药给药剂量参照普通成人体重 的临床用量、大鼠与人的等效剂量换算及本课题组实验研究而定 均 次/)正常组与模型组大鼠给予等体积去离子水灌胃(次/)均持续 以血清、水平明显升高为大鼠肝损伤造模成功 观察指标及检测方法 肝功能生化指标 末次灌胃结束后麻醉各组大鼠腹主动脉取血 使用全自动生化分析仪测定血清、水平 肝脏组织中 、表达情况 采用 法检测:取大鼠肝脏组织将组织充分研磨后取上清液提取总 使用 检测 浓度及纯度后进行反转录加入 作为模板反转录程序设置条件为 结束后 保温 灭活反转录酶然后进行定量 扩增反应条件:预变性 变性 延伸 共进行 个循环 熔解曲线为 每升温.采集 次荧光信号 用甘油醛 磷酸脱氢酶()作内参通过 法计算肝脏组织中 、相对表达量 各引物由武汉赛维尔生物科技有限公司设计合成引物序列见表 肝脏、结肠组织中阳性表达情况采表 、检测引物序列基因上游引物序列下游引物序列扩增长度/现代中西医结合杂志 ()用免疫组化法检测:取出 甲醛固定好的肝脏、结肠组织并进行切片将切片依次放入脱蜡液、每次 浓度梯度乙醇浸泡每次 将切片放于抗原修复液并在微波炉中进行抗原修复使用 双氧水进行封闭在组织上均匀滴加 室温 加一抗/片 湿盒内孵育过夜加入二抗/片 室温孵育 再进行 显色、复染细胞核、脱水封片等处理 显微镜下每张切片随机取 个视野在放大相同倍数()条件下进行观察以出现棕褐色为 阳性表达然后采集图像用 .软件进行定量分析计算平均光密度值(阳性细胞染色的累积光密度与区域面积比值)结肠组织中杯状细胞数量 采用 法检测:将 甲醛固定好的结肠组织进行切片按照 染液试剂说明严格进行染色操作 每张切片随机取 个视野进行观察以杯状细胞蓝染为阳性表达用 .软件进行定量分析记录每张切片视野下出现的阳性细胞数量 统计学方法 采用 .软件处理数据计量资料如果满足正态性和方差齐性检验用 表示多组比较使用单因素方差分析()组间两两比较使用 检验如果数据不满足正态分布或方差不齐则使用非参数统计的多个独立样本 检验组间两两比较使用 法检验 .表示差异有统计学意义 结 果 各组大鼠肝功能生化指标比较模型组大鼠血清、水平均明显高于正常组(均.)双环醇组、四逆散组血清、水平及六君子汤组、水平均明显低于模型组(均 .)四逆散组 水平明显低于双环醇组、六君子汤组(均.)双环醇组 水平明显低于四逆散组、六君子汤组(均.)见表 表 正常组和肝郁叠加肝损伤各组大鼠血清、水平比较()组别只数/(/)/(/)/(/)/(/)/(/)正常组.模型组.双环醇组.四逆散组.六君子汤组.注:与正常组比较.与模型组比较.与四逆散组比较.与双环醇组比较.各组大鼠肝脏组织中 、相对表达量比较 与正常组比较模型组大鼠 相对表达量明显升高(.)、相对表达量均明显降低(均.)与模型组比较双环醇组、四逆散组 、相对表达量均明显降低(均.)四逆散组、相对表达量和双环醇组 相对表达量、六君子汤组 相对表达量均明显升高(均.)且四逆散组 、相对表达量均明显低于六君子汤组(均.)相对表达量明显高于六君子汤组(.)见表 表 正常组和肝郁叠加肝损伤各组大鼠肝脏组织中 、相对表达量比较()组别只数 正常组.模型组.双环醇组.四逆散组.六君子汤组.注:与正常组比较.与模型组比较.与四逆散组比较.各组大鼠肝脏、结肠组织中 阳性表达情况比较与正常组比较模型组大鼠肝脏组织中 阳性表达平均光密度值明显降低(.)结肠组织中 阳性表达平均光密度值明显升高现代中西医结合杂志 ()(.)与模型组比较双环醇组、四逆散组、六君子汤组肝脏组织中 阳性表达平均光密度值均明显升高(均.)双环醇组、四逆散组、六君子汤组结肠组织中 阳性表达平均光密度值均明显降低(均.)见图、图 及表 各组大鼠结肠组织中杯状细胞数量比较 正图 正常组和肝郁叠加肝损伤各组大鼠肝脏组织中 阳性表达情况(免疫组化染色)图 正常组和肝郁叠加肝损伤各组大鼠结肠组织中 阳性表达情况现代中西医结合杂志 ()表 正常组和肝郁叠加肝损伤各组大鼠肝脏、结肠组织中 阳性表达平均光密度值比较()组别只数肝脏结肠正常组.模型组.双环醇组.四逆散组.六君子汤组.注:与正常组比较.与模型组比较.常组和模型组杯状细胞数量分别为(.)个/视野和(.)个/视野模型组杯状细胞数量明显少于正常组(.)双环醇组、四逆散组、六君子汤组杯状细胞数量分别为(.)个/视野、(.)个/视野、(.)个/视野各药物组杯状细胞数量均明显多于模型组(均.)见图 讨 论图 正常组和肝郁叠加肝损伤各组大鼠结肠组织中杯状细胞染色情况()肝损伤时肠黏膜屏障被破坏肠道通透性增加肠道菌群失调和细菌过度生长随之而来的细菌易位使细菌及其产物从胃肠道经门静脉循环和淋巴系统进入肝脏加重肝损伤 另外肝脏枯否细胞产生过量的 和其他促炎介质引发肝脏炎症 杯状细胞位于肠上皮内是胃肠道重要的分泌细胞杯状细胞的产物之一是黏蛋白黏蛋白能形成一种覆盖在上皮表面的生物凝胶对维持肠道屏障至关重要 本实验以束缚叠加 制造肝郁叠加肝损伤病证结合动物模型结果显示模型组大鼠血清、水平及肝组织中 相对表达量均明显升高肠组织中杯状细胞数量显著减少表明大鼠肝功能和肠道受损双环醇、四逆散、六君子汤灌胃均能在一定程度上改善肝功能和增加肠组织中杯状细胞数量双环醇和四逆散灌胃能下调肝组织中 、表达六君子汤灌胃对 、表达无明显影响但杯状细胞数量略多于四逆散灌胃提示四逆散疏肝治疗更有利于减轻肝脏炎症六君子汤健脾治疗有利于肠道功能的改善肝的生理功能包含了排泄胆汁、分泌胆汁胆汁参与食物和水液的消化与吸收 是胆汁酸膜受体 被激活后随即释放 亚基并激活细胞内 浓度增加进而激活 使 反应元件结合蛋白()磷酸化抑制巨噬细胞、树突状细胞中核因子 的激活进而减少 、的释放及各种黏附分子如 选择素、血管细胞黏附分子()、细胞间黏附分子()的表达减轻炎症反应 本实验结果显示模型组大鼠肝脏组织中 阳性表达及、表达减少结肠组织中 阳性表达增加与模型组比较四逆散组肝脏组织中 阳性表达及、表达增加结肠组织中 阳性表达减少六君子汤组肝脏组织中 阳性表达及 表达增加结肠组织中 阳性表达减少但肝脏组织中 表达无明显变化 结合先前研究六君子汤可上调肝郁叠加肝损伤大鼠肠黏膜紧密连接蛋白表达肝脏免疫应答对从消化道流入的许多抗原具有耐受性这种耐受性使肝脏不像其他器官那样容易发生排斥反应故推测六君子汤健脾治疗可能通过调节肠道菌群、减少细菌易位而发挥间接作用 四逆散疏肝治疗能激活/信号通路增加肝脏 含量激活 导致细胞中 水平升高 水平升高进一步激活 磷酸化下游效应元件结合因子()被激活的 可结合至特定位点调节相关基因的表达减少肝现代中西医结合杂志 ()脏炎症因子 、的表达从而减轻肝损伤综上所述在肝郁叠加肝损伤状态下六君子汤健脾治疗通过维护肠道内环境从而防止肝损伤进一步发展四逆散疏肝治疗对于维护肠道屏障功能是有利的其减轻肝脏炎症作用优于六君子汤健脾治疗其作用机制可能与/信号通路的激活有关利益冲突:所有作者均声明不存在利益冲突参考文献 .():.():.():.:.:.().():.():.()().():.张仲景.伤寒论.北京:人民卫生出版社:.宋琳陈策李承潇.四逆散对非酒精性脂肪性肝炎大鼠的肝保护作用研究.河北中医药学报():.尚立芝王付苗小玲.四逆散加味抗大鼠肝纤维化作用机制.中国实验方剂学杂志():.于向民刘友章野田亨等.阿霉素对大鼠肝细胞的毒性及中药六君子汤对肝细胞的保护作用.解剖学报():.苏毅张茁钟晓芃等.六君子汤预防抗生素相关性肠道菌群失调临床对照研究.继续医学教育():.严灿徐志伟吴丽丽 等.建立中医情志致病动物模型的思考.中国临床康复():.洪绯赵锦燕张泽修等.复方片仔癀肝保片对大鼠四氯化碳诱导慢性肝损伤的治疗作用.福建中医药():.黄继汉黄晓晖陈志扬等.药理试验中动物间和动物与人体间的等效剂量换算.中国临床药理学与治疗学():.郑智礼史兴华于瀚等.金匮要略“当先实脾”对肝损伤大鼠肝细胞凋亡的干预作用.环球中医药():.():.:.():.():.魏伟莉高艺宁史兴华等.基于 及肠黏膜屏障功能探讨疏肝健脾 疗法对肝损伤大鼠的影响及作用机制.中国实验方剂学杂志():.:.():.():.():.(下转第 页)现代中西医结合杂志 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